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熱透鏡吸收光譜法在毛細管電泳上的應用

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Academic year: 2021

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第一章 緒論

1-1 研究目的

毛細管電泳發展至今,最常使用紫外光吸收法(UV absorbance) 作為偵測方法。但由於毛細管內徑極小,在樣品偵測效果上不如傳統 層析方法靈敏,如 HPLC,因此許多新穎的偵測方法被開發應用在毛 細管電泳偵測上,其目的是為了改善毛細管電泳之偵測靈敏度,例如 雷射誘導螢光法(laser induced fluorescence , LIF)[1-14]、電化學偵 測法與質譜分析法等,或是在毛細管偵測窗部份改以 Z 型槽裝置替代 [15],以及使用具有 bubble cell 的毛細管作為偵測窗增加其偵測光學 路徑 [16]等,均成功地提高偵測靈敏度將近幾個數量級,但不利的 因素在於所需成本較高、較複雜偵測技術以及較高的維修費用等;基 於 上 述 理 由 , 各 式 各 樣 的 樣 品 線 上 濃 縮 技 術 ( on-line sample concentration)就此誕生,如 stacking [17-25]、sweeping [26-28]、dynamic pH-junction [29, 30]等。

在西元2000年時,Quirino與Terabe針對陽離子分析,將場放大樣 品進樣(field-enhanced sample injection, FESI)與掃集(sweeping)兩 濃縮技術結合在一起而開發了cation-selective exhaustive injection- sweeping(CSEI-sweeping)新技術 [31]。不僅進一步降低了偵測極 限,亦帶來了之後更新濃縮技術的發展,如anion-selective exhaustive injection-sweeping (ASEI-sweeping) [32, 33]、pH junction-sweeping [34] 等。

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光譜分析技術,因為使用的雷射功率大,使其對於在液體內或固體混 合物上的不發螢光物質有非常好的靈敏度與偵測極限,然而,其選擇 性是很差的,因為雷射光照射一物質後放出的熱和照射另一物質放出 的熱是無法區別的。也正因為其無特定選擇性,所以適合與各種分析 技術結合來做偵測,如高效能液相層析(HPLC)、流動注射分析(FI)、 凝膠電泳(GE)和高效能毛細管電泳(HPCE)。 基於以上各種理由,因此本研究發展利用熱透鏡吸收式分析法作 為毛細管電泳的偵測技術,期望能在改變偵測端偵測儀器的情況下提 高毛細管電泳的偵測靈敏度。本研究的重點大致如下: 1.非螢光性奈米粒子的分離與應用 利用10倍接物鏡與平凸透鏡來聚焦雷射並校光,再以毛細管電泳 對平均顆粒大小15及71.5 nm的奈米金粒子進行分離,將電泳分離結 果與計算得到的理論情形做比較。接著嘗試做出平均顆粒為35 nm的 奈米鑽石基本電泳模式檢量線,再將其分別與三種胺基酸 (L – lysine、glycine and L – (+) – cysteine) 混合行吸附作用,欲從電泳圖 譜上觀察到是否有胺基酸吸附上奈米鑽石所造成的譜峰。 2.非螢光性有機物質的分析 首先對維生素BB12及孔雀石綠進行微胞電動層析電泳模式的分 析,接著再結合線上濃縮技術毛細管電泳掃集法對孔雀石綠進行更進 一步分析。另外利用晶紅酸指示劑與甲醛反應三小時以上,再對其反 應產物進行電泳分析,希望能藉由定量生成的譜峰而達成定量分析甲 醛的目的。

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1-2 分析物簡介

1-2-1 奈米金粒子 (Nanogold particle) 隨著奈米科技的發展,一些奈米材料新的物理及化學性質陸續 被發現,因為這些獨特的性質,使得奈米科技結合了生命科學而開 啟了一個新的方向。近年來有許多學者成功的整合了奈米科技以及 生物科技,並且將其廣泛地應用在分子疾病診斷,臨床醫學治療 上。由於奈米粒子在大小尺度上與一些生物分子相近,使得奈米生 物科技的崛起帶動了奈米顆粒的重大發展。透過生物分子的鍵結, 使得奈米粒子特殊的性質(光、電、磁)可以展現於生物體。因此, 有許多的文獻提到生物分子如核酸、胜肽 或蛋白質,藉由生物鍵 結技術的發展與奈米顆粒結合,在疾病診斷、治療有顯著的突破、 貢獻。譬如:臨床學診斷中核磁共振影像中的顯影劑;藥物釋放控 制中輸送藥物分子的載體;甚至是組織工程中的細胞骨架等。 金奈米粒子於生化領域的應用一直是眾所矚目的焦點。相較於 其他大小相似的金屬奈米粒子,奈米金顆粒可藉由簡單的化學合成 法製得,且其在水溶液中有較高的分散行為。此外,金奈米粒子之 生物相容性比其他金屬奈米顆粒高,與生物分子鍵結後其穩定性也 較高。 奈米粒子之製備可約略分為三大類,分別是雷射消熔法(laser ablation method)、金屬氣相合成法(metal vapor synthesis method)與化 學還原法(chemical reduction method)。本研究所使用之奈米金粒子為 實驗室以化學還原法製備得到的,利用檸檬酸鈉(trisodium citrate)將

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氯化金(HAuCl4)還原成金奈米粒子,步驟如下: 先行配製1%氯化金溶液以及1%檸檬酸鈉溶液,氯化金若沒有用 完務必放置於4o C冰箱中,接著稀釋氯化金溶液至0.01%,加熱至沸 騰,沸騰時加入1%檸檬酸鈉溶液(加入量可以調整,檸檬酸鈉用量 多,奈米金顆粒直徑小,見表1-1),持續使之沸騰與快速攪拌,開始 出現藍色,然後淺藍,再加熱則出現紅色,煮沸8~10分鐘即可,最後 溶液的顏色取決於奈米金的顆粒大小,然後進行TEM分析或是測 UV-Vis吸收光譜檢驗其顆粒大小。 表1-1 奈米金粒子顆粒大小與檸檬酸鈉用量關係表 0.01%氯 化金(ml) 100 100 100 100 100 100 1%檸檬 酸鈉(ml) 0.30 0.45 0.70 1.0 2.0 5.0 肉眼顏色 藍灰 紫灰 紫紅 紅 橙紅 橙 吸收峰波 長(nm) 220 240 535 525 522 518 粒徑大小 (nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15

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1-2-2 奈米鑽石 (Nanodiamond) 鑽石恆久遠,一顆永流傳。這是我們耳熟能詳的一句廣台台詞, 說明了鑽石在人們心目中的地位,越大顆的鑽石身價越高,但是當鑽 石的大小變成了奈米等級時,人們是否會棄之如敝屣呢?這答案恐怕 是否定的。當鑽石的顆粒尺寸介於1~100 nm時,如此小尺度的奈米鑽 石融合了鑽石本質的優點以及奈米結構的特殊性質,可以視為一個量 子點來探討其展現出來的獨特性質。一般常見的量子點都是一些具有 毒性的金屬元素,而奈米鑽石的主要成分為碳元素,沒有毒性且與人 體或生物的相容性高。 奈米鑽石的表面一般覆蓋著一層疏水性的C-H 鍵結,在強氧化 酸性處理下(酸洗),鑽石表面經由氧化而生成羧基COOH(carboxyl groups)或其他含氧的官能基(例如 C=O、C-O-C 等),故而產生 親水性,並且和核酸(nucleic acids)與蛋白質(protein)產生強力的 鍵結。奈米鑽石表面官能基化跟酸洗是ㄧ樣的,都是溶於硫酸加硝酸 (體積比3比1)的水溶液中,用微波爐加熱120度,時間3個小時,離心 之後以二次水水洗再烘乾。奈米鑽石對於特別的生物細胞與DNA基 因具有良好的吸附性質,可以用來製作生物晶片,將帶有生物分子的 奈米鑽石放入細胞,並搭配奈米鑽石獨特的光學特性,即可成為效果 非常好的生物標記。下表1-2 說明了奈米鑽石顆粒大小與其本身物性 之關係[35]。

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Ib型的非螢光性奈米鑽石,一般含有100 ppm的氮原子,經由高 能的質子束照射後產生晶格空缺,接著再高溫焠火後,氮原子會靠近 空缺,產生(N-V)-中心,如圖1-1[36]。這中心會強烈地吸收532 nm附 近的光,並在700 nm附近有最大的放射螢光,生成所謂的螢光性奈米 鑽石。而一般的非螢光性奈米鑽石也是在532 nm附近有最大吸收。如 圖1-2[37]所示,為奈米鑽石的螢光光譜,在700 nm附近有螢光的是 先經過質子束照射再高溫焠火而得,而沒有放射螢光的僅是經過高溫 焠火而得,圖譜的激發波長設定在510-560 nm。 圖1-1 螢光性奈米鑽石(N-V)-中心示意圖 圖1-2 奈米鑽石螢光光譜圖

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1-2-3 維生素BB12 (Vitamin B12) 維生素BB12是所有維生素分子中最為複雜的,結構式如圖 1-3 所 示,是人體必需的水溶性維生素,少量存於體內。為深紅色的針狀結 晶,微溶於水,對熱安定,但在遇光或強鹼強酸的情況下會失去其活 性,大量的抗壞血酸存於飲食中或加入血清中會導致維生素B12B 的破 壞。主要來源是動物性食物,如動物肝臟、牛肉、猪肉、蛋、牛奶、 乳酪。除當歸外,目前已知的植物性食物都不含維生素BB12 。其功能為 促進紅血球形成及再生、預防貧血、代謝脂肪酸、維護神經系統的健 康及增強記憶及平衡感。缺乏時會惡性貧血、月經不順、眼睛及皮膚 發黃。 圖1-3 維生素BB12結構式圖

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1-2-4 孔雀石綠染料 (Malachite green oxalate)

孔雀石綠(Malachite green oxalate),結構式如圖 1-4 所示,可用作 生物染色劑把細胞或細胞組織染成藍綠色,方便在顯微鏡下研究,是 一種帶有金屬光澤的綠色結晶體(green crystalline solid),屬有機三苯 甲烷類染料。易溶於水,溶液呈藍綠色,具有相當好的殺真菌效果。 同時也具有高毒、高殘留及三致(致畸、致癌、致突變)作用。許多國 家都將孔雀石綠列為水產養殖禁用藥物,因價格低廉,不法商販使用 的目的主要是防止魚類因碰撞等原因,使魚鳞等脱落而引起魚體真菌 感染而導致死亡,部分販運商在運輸前用孔雀石綠溶液對車廂進行消 毒,不少儲放活魚的魚池也採用這種方式進行消毒。 為了延長魚生存的時間,不法販運商在運輸前都要用孔雀石綠溶 液對車廂進行消毒,使用孔雀石綠消毒後的魚即使死亡後顏色也較為 鮮亮,很難從外表分辨。根據動物實驗,孔雀石綠的三苯甲烷會毒害 肝臟出現腫瘤,引發貧血、甲狀腺功能異常,並且會影響胎兒。因此, 專家擔心過量攝取含有孔雀石綠的水產會致癌,並且會讓基因突變, 甚至影響生育能力。美國、歐盟、加拿大、日本、泰國、新加坡及香 港均禁止使用孔雀綠為動物用藥,因此歐盟規定孔雀綠和還原型孔雀 綠的殘餘量不得超過十億分之ㄧ公克(ppb),而一般偵測孔雀綠的方 法是利用高效能液相層析[38]或質譜[39、40]等方式。 H (H3C)2N N(CH3)2 圖 1-4 孔雀石綠結構式圖

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1-2-5 甲醛 (Formaldehyde) 甲醛,結構式如圖 1-5 所示,是結構簡單、分子量小 (Mw=30.03) 的化合物,化性活潑,常溫常壓下為無色、具強烈刺激性的氣體,水 溶解度可達 55 g/100 mL,通常以 30~50 %的水溶液販賣。 但根據資料,游離甲醛(福馬林)對人體之健康危害甚大,其釋放 (濃度)對人體的影響如表 1-3 所示。世界衛生組織 WHO(1989)規定 任何時間不得超過 0.8 ppm,平均暴露濃度為 0.25 ppm。我國(1995) 僅訂有最高容許濃度值 1ppm。由於甲醛對人體的為害極大,所以對 於微量甲醛濃度的偵測實屬必要。

H

2

C

O

圖 1-5 甲醛結構式圖

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表 1-3 游離甲醛濃度大小對人體影響程度表 空氣中之游離甲醛濃度 知覺狀況 0.08 ppm 0.5 ppm 0.8 ppm 5.0 ppm 15.0 ppm 20.0 ppm 幾乎沒有臭味或感覺 眼睛會有刺激感 有臭味產生 喉嚨開始不舒服 開始咳嗽 刺激呼吸器官系統

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實驗上我們利用甲醛與晶紅酸指示劑 (又名希夫試劑,Schiff , s reagent) 反應得到紫紅色的染料作間接偵測。反應機制如下: 晶紅(fuchsin)是一個粉紅色的顏料,它會與亞硫酸作用得到無色 的晶紅酸指示劑(leucosulfonic acid)。 這個指示劑是很不穩定的,當加入醛類化合物時很容易反應脫去 一分子亞硫酸並得到一紫紅色的 quinoid 顏料: 加入甲醛後,反應至少要三個小時以上才能完全。

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1-3 雷射簡介

雷射是由英文laser音譯而來,而laser一字則是Light Amplification by Stimulated Emission Radiation的字首組成,即光可藉由激發放射而 放 大 的 一 種 裝 置 。 雷 射 的 發 明 可 以 追 溯 到 物 理 學 家 Arthur L. Schawlow和Charles H. Townes於 1958 年在Physical Review上發表一篇 名為Infrared and Optical Masers的論文[41],由此正式開啟了雷射的 時代。1960 年美國物理學家Theodore Malman首先利用光與共振腔產 生雷射光以來,雷射幾乎成為各種領域應用上不可或缺的工具。雷射 的種類依其使用的活性介質區分為:固體、液體、氣體與半導體雷射, 例如氦氣、二樣化碳、氮氣等氣體雷射;以液體為活性介質的液體雷 射,如染料雷射;使用固體為活性介質的固體雷射,如紅寶石、石榴 石雷射;使用化學週期表中三族、五族半導體為材料的,如砷化鎵、 砷磷化銦鎵、砷化鎵鋁等半導體雷射。

參考文獻

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