綠弄蝶屬的系統分類研究
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(2) 目錄 致謝 ..................................................................................................... 2 中文摘要 ............................................................................................. 3 英文摘要 ............................................................................................. 4 前言 ..................................................................................................... 5 材料與方法......................................................................................... 11 結果 .................................................................................................... 16 討論 .................................................................................................... 18 參考文獻 ............................................................................................ 23 附表 .................................................................................................... 26 附圖 .................................................................................................... 31 . 1.
(3) 致謝 首先誠摯的感謝指導教授徐堉峰老師及千葉秀幸老師兩位老師 悉心的教導，指點我正確的方向，並給予我很多珍貴的建議，也非常 感謝千葉秀幸老師提供珍貴的綠弄蝶標本，使本論文可以順利完成。 另外也感謝口試委員林思民老師對本論文所提供許多的寶貴意見，使 本論文能夠修改得更加完整。 感謝立偉學長與亭瑋學姊在分生實驗與分析方法的教導與協 助，另外在論文寫作與實驗過程中，感謝政學、郁婷與阿珠給我很多 的建議與幫助，並且不厭其煩的回答我各種疑難雜症。也要感謝黑 熊、球球與岳賢在我口試時給我很多及時的幫助，讓我可以無後顧之 憂得完成口試。最後要感謝我親愛的爸媽，在我求學過程中無微不至 的照顧，並給我許多精神上的支持與鼓勵。 能得到這麼多師長朋友的幫助，我才有幸能完成此論文，感謝所 有直接或間接給予我幫助的人。. 2.
(4) 中文摘要 綠弄蝶屬(genus Choaspes)為弄蝶科(Family Hesperiidae)大弄蝶亞 科(Subfamily Coeliadinae)中顏色鮮豔的蝶種，主要分布於亞洲的東南 部一帶，在目前分類共有 8 種。綠弄蝶幼蟲顏色鮮豔，而且不同種花 紋差異相當大，但是生活在同一地區不同種的綠弄蝶成蟲外形卻非常 相似。傳統上的分類與分群主要依據交尾器、成蝶翅紋或幼蟲外觀來 分類，但是在綠弄蝶屬內有少數物種在分類上卻是缺乏共識的。Chiba 依據成蟲翅紋與交尾器等形態特徵的不同將綠弄蝶分為四個亞群，但 有三個種的成蝶形態特徵是介於兩個亞群之間。本研究以粒線體 DNA 之 COI、COII 序列片段來重建綠弄蝶屬之分子親緣關係，並與 Chiba 所提出之形態親緣分群相比較。本研究包含內群 8 種共 39 隻個 體與外群 4 個屬共 4 隻個體。在分群關係方面支持 Chiba 所認定的兩 大群 benjamini-group 和 xanthopogon-group 為單系群，而兩大群再被 細分的四個亞群 stigmatus–subgroup、benjaminii– subgroup、 xanthopogon -subgroup 與 hemixanthus-subgroup 也皆為單系群。而本 研究也釐清三個在形態特徵上有矛盾而無法明確分群的三個種 C. plateni、C.adhara 和 C. illuensis，與屬內其他種的親緣關係。. 關鍵字：分子系統學、粒線體 DNA、種群. 3.
(5) Abstract The skipper genus Choaspes consists of 8 species and distributed throughout the Oriental region, from North India eastwardly through China to Japan, and southwardly through Sunda islands to New Guinea. The adults and larvae alike have bright colors, which may be aposematic. Based on morphological characters and vicariant distribution pattern, Chiba arranged the genus Choaspes into 4 subgroups: stigmatus–subgroup, benjaminii–subgroup, xanthopogon –subgroup and hemixanthus-subgroup. The morphological characters and distrubution of three species, C. plateni, C.adhara and C. illuensis, does not clearly show as to which subgroup they belong, stigmatus or benjaminii, and their taxonomic status were left ambiguous. In this research, the molecular phylogeny of Choaspes was reconstructed using the sequences of mitochondrial COI, COII region, and the consistency of the molecular phylogeny and the morphological taxonomic groups proposed by Chiba was tested. Total of 8 ingroup species with 39 individuals and 4 outgroup genera were sampled. The monophyly of 4 subgroups sense Chiba were supported, and the phylogenetic relationship of the three species with ambigous status were settled. Based on the result of the present study, the classification of the genus was modified. C. estrella, C. furcatus, and C. mona are raised to distinct species.. Key words: molecular systematics, mitochondrial DNA, species group. 4.
(6) 前言 粒線體 DNA 全長 16-18kb，結構簡單且具有母系遺傳特性，在傳 遞過程中少有基因重組的現象 (Walstenholme, 1992)，且動物粒線體 DNA 的演化速率較快，一般是核 DNA 的 5-10 倍，適合用於近緣物 種的分析研究。Cytochrome Oxidase I(COI)與 Cytochrome Oxidase II (COII)基因是粒線體 DNA 上細胞色素氧化酵素基因第一單元與第二 單元的簡寫，COI 與 COII 序列片段在文獻中時常被使用，例如鳳蝶 屬的系統發育關係研究(Sperling & Caterino, 1999)；Heliconius 屬 (Lepidoptera: Nymphalidae)的輻射種化事件與親緣地理探討(Beltran et al., 2002)；與 Greya 屬(Lepidoptera: Prodoxidae)之分子與形態資料的 比較探討(Brown et al., 1994)。Hebert et al. (2003)提出利用生命條碼 (DNA barcoding)，也就是粒線體 COI 序列片段來分析各個不同動物 門的遺傳變異，他們利用 COI 片段分析鱗翅目的昆蟲，提出鱗翅目 COI 種間序列變異約大於 3%的看法，並且在 2004 年，利用生命條碼 研究美洲地區的弄蝶 Astraptes fulgerator，此種弄蝶的成蝶外觀均 質，難以辨識，但是幼蟲花紋及生命條碼卻顯示其中至少包含十種以 上的隱藏種(Hebert et al., 2004)。由上述種種研究可以得知，利用分子 資料，得以提供基本的系統發育關係比較，甚至可以做為分類鑑定上 的參考。. 5.
(7) 綠弄蝶屬(genus Choaspes Moore, 1881)，為弄蝶科(Hesperiidae) 大弄蝶亞科(Coeliadinae)的一屬。Chiba (2009)發表的A revision of the subfamily Coeliadinae (Lepidopera: Hesperiidae)中列出了共八種二十 二個亞種的綠弄蝶。主要分布於亞洲東南部，延伸到日本及新幾內 亞，其中以印度北部到中國西部與馬來半島到蘇門答臘兩個區域多樣 性最高。目前台灣的綠弄蝶屬共有2種，其中綠弄蝶(Choaspes benjaminii )，是較為常見的種類，而另一種褐翅綠弄蝶(Choaspes xanthopogon)則是一直到1986年才在台灣本島被發現(Hsu, 1988)。雖 然褐翅綠弄蝶相較於其他弄蝶是較為大型而且顯眼的蝶類，之所以這 麼晚期才被發現，主要原因是因為褐翅綠弄蝶與綠弄蝶的成蝶外觀非 常相似，易被視為同一種；另一原因可能與牠們習慣在黃昏出沒的習 性有關，而相同的情況也出現在其他大弄蝶亞科的成員身上(Hsu & Huang, 2008)。 綠弄蝶屬的蝴蝶相較於其他弄蝶而言體型較大，顏色鮮豔，複 眼周圍有毛。翅膀背面為藍褐色或綠褐色，翅腹面褐綠色或靛藍色具 金屬光澤，翅脈顏色較深，後翅肛角(tornus)處有醒目的橙色或黃色斑 塊，而肛角翅型有時突出成瓣狀或尾狀。幼蟲顏色鮮豔，有條紋狀或 斑點狀花紋，大部分幼蟲會利用寄主植物製作躲藏的蟲巢。清風藤科 (Sabiaceae)的植物為幼蟲主要的寄主植物，另外也有利用使君子科 6.
(8) (Combretaceae)、茶茱萸科(Icacinaceae)、防己科(Menispermaceae)、百 合科(Liliaceae)以及無患子科(Sapindaceae)等植物的紀錄(Chiba, 2009; de Jong & Treadaway, 2007)。 Chiba(1988)依據交尾器形態特徵的不同而將綠弄蝶屬分為 benjaminii-group和xanthopogon-group兩群，兩者主要的區別是在抱器 瓣(valvae)與鉤突(uncus)相對位置的不同(圖一)。benjaminii-group綠弄 蝶的鉤突並沒有直接覆蓋住抱器瓣，而且其抱器瓣的末端呈現鳥嘴 型。而xanthopogon-group綠弄蝶的鉤突直接覆蓋在抱器瓣上，且其抱 器瓣的頂端有一個突起。 綠弄蝶屬幼蟲外觀的不同與此分類亦相符 合(Chiba, 1989; Igarashi, 1992)，benjaminii-group的幼蟲花紋是條紋 狀，而xanthopogon-group幼蟲花紋則是斑點狀。De Jong & Treadway(2007)卻認為幼蟲的外觀與此分群不相符，因為在巴布亞新 幾內亞發現的C. hemixanthus這種幼蟲，分群上是屬於xanthopogon -group，但是牠身上的花紋卻是條紋狀的。但是這種C. hemixanthus 幼蟲身上的顏色，與其他綠弄蝶屬條紋狀幼蟲的條紋顏色剛好是深淺 相反的，而呼吸孔也是位於深色的體節而不像其他條紋狀幼蟲是位於 淺色的體節，因此Chiba (2009)認為這可以解釋為一種祖徵 (plesiomorph)的表現。 Benjaminii-group和xanthopogon-group可以再各自分成兩個亞. 7.
(9) 群，benjaminii-group可再分為stigmatus–subgroup與benjaminii– subgroup，而xanthopogon-group則可再分為xanthopogon -subgroup與 hemixanthus-subgroup(Chiba, 1988)。而台灣的綠弄蝶(C. benjaminii japonicus)與褐翅綠弄蝶(C. xanthopogon xanthopogon)分別屬於 benjaminii – group底下的benjaminii – subgroup與xanthopogon – group 底下的xanthopogon – subgroup。 Chiba (2009)將4個亞群的綠弄蝶依照牠們的產地，分別劃分到地 圖上，提出了綠弄蝶屬蝴蝶的分布模式，並且以泛生物地理學 (panbiogeography)的理論為基礎，預測某些地區尚有未被發現的綠弄 蝶屬蝴蝶的類群。在此提出幾個分布地點為例。在印度北部共發現有 四種綠弄蝶屬的蝴蝶，分別是：C. stigmatus stigmatus、C. benjaminii japonicus、 C. xanthopogon xanthopogon 與 C.hemixanthus furcatus， 雖然這四種綠弄蝶的外觀非常相似，但是卻分屬於四個不同的亞群， 每一個亞群只有一種代表分布在印度。而在馬來半島，共有三種不同 的綠弄蝶被發現，分別是：C. stigmatus caudatus、C. benjaminii flavens 與C. subcaudatus crawfurdi，這三種綠弄蝶外觀也是大致相同，在後 翅肛角的外型皆為瓣狀且有黃色斑塊，但同樣的，三種綠弄蝶分別代 表一個不同的亞群，而此地區代表 xanthopogon – subgroup的物種尚 未被發現。在蘇門達臘島，有四種綠弄蝶被發現：C. stigmatus. 8.
(10) caudatus、C. benjaminii pallidus、 C. xanthopogon cora 與 C.hemixanthus subcaudatus，一樣每一種分別代表一個亞群。由此看 來，在每一個有綠弄蝶屬蝴蝶分部的地區，皆有部份或全部四種分類 單元的綠弄蝶各自代表四個不同的亞群，不同的亞群在一個相同的地 區，會有極為相似的外表型，反而是屬於同一亞群生活在不同地區的 物種，在外表上有較大的差異，相同的情形也發生在其他大弄蝶亞科 的成員身上，而目前還還不清楚此現象形成的原因。但是在泰國北部 與越南北方的地區，同時有C. subcaudatus與C. hemixanthus這兩種綠 弄蝶存在的紀錄，兩種皆屬於hemixanthus-subgroup，雖然不確定兩者 的活動週期或成蝶出現的季節是否有重疊，但是在這個情況下，當我 們在進行綠弄蝶屬演化研究時，此區應是優先被拿來討論的。另外在 綠弄蝶屬內有三個種C. plateni、C.adhara 和 C. illuensis，因為牠們 的形態特徵是介於stigmatus– subgroup與benjaminii–subgroup之間，在 分群上無法明確的分類屬於哪一個亞群。 Warren et al. (2008, 2009)利用分子與形態的資料探討世界弄蝶科 的高階親緣關係，但對於弄蝶科低階的親緣關係研究目前較缺乏， 本研究擬使用分子技術，利用粒線體 DNA 的 COI 及 COII 序列片段 來做為工具，針對綠弄蝶屬內的蝴蝶進行親緣關係樹的建構，檢測綠 弄蝶屬內蝴蝶的分群是否與 Chiba 所利用形態分類的四個亞群相符. 9.
(11) 合，又如果符合的話，可以將 C. plateni、C.adhara、C. illuensis 三個 形態特徵介於兩個亞群之間的物種，依據親緣關係，歸類到其所屬的 亞群。. 10.
(12) 材料與方法 一、樣本採集 收集國內外綠弄蝶屬全部8種蝴蝶，包括：C. stigmatus (Evans, 1932)、C. benjaminii (Guérin-Méneville, 1843)、C. adhara (Fruhstorfer, 1911)、C. plateni (Staudinger, 1888)、C. illuensis (Ribbe, 1900)、C. xanthopogon (Kollar, 1844)、C. subcaudatus (C. & R. Felder, 1867)、C. hemixanthus (Rothschild & Jordan, 1903) ，學名以Chiba(2009)針對大 弄蝶亞科蝴蝶之整理為主，主要使用翅紋特徵進行樣本鑑定。全部39 個樣本採集自亞洲東南部及台灣各地(表一)，樣本採集地點詳見圖 一。並且使用同為大弄蝶亞科另外4個屬的4種樣本作為外群。物種鑑 定以及編號後，將樣本足部肌肉組織儲存於99.5%的酒精中，放置 -80°C冰箱中保存。. 二、分子技術 1. DNA 萃取 使用 Purgene DNA Isolation kit (Gentra Systems, Minnesota, USA)來萃取 DNA。取出冰箱中儲存之樣本，取一~二隻腳置於 1.5ml 的微量離心管中，加入 cell lysis 100µl 後，用剪刀將組織剪 碎，之後加入 DTT 10µl 與 Proteinase K 10µl 研磨，置於 65°C 水. 11.
(13) 浴中反應 90 分鐘。接著加入 protein precipitation 40µl，置於-20°C 冰箱 10~30 分鐘後，以 14000rmp 離心 15 分鐘，取上清液(兩次)， 加入 Isopropanol 140µl 將 DNA 沉澱，混合均勻後以 14000rmp 離 心 10 分鐘。去上清液，加入 70%酒精 500µl 洗去殘餘鹽類，以 14000rmp 離心 5 分鐘後，去上清液，於抽風櫃風乾 2 小時，風乾 後的 DNA 溶於 30~50µl 的 ddH2O，放置於-20°C 冰箱保存。 2.聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR) 將萃取所得 DNA 樣本，進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)來擴增 COI、COII 序列片段，以分析綠弄蝶屬內部 的親緣關係。PCR 引子(primer)之設計乃參照前人研究發表之 COI、COII 基因序列片段的引子(Caterino & Sperling, 1999; Megens, 2004)。所使用之引子詳見表二。 將反應物置於熱循環儀中，設定 95°作用 4 分鐘，裂解雙股 DNA，再以 95°C 進行 30 秒的變性(denaturation)，黏合(annealing) 溫度選擇 55°C 作用 30 秒，延長(extension)反應於 72°C 進行 1 分 鐘，此循環共進行 30 次，最後以 72°C 進行 7 分鐘作最後複製(final extension)。以上步驟會因物種不同而稍做變動。 3.DNA 定序 以電泳確認萃取出之 DNA 與 PCR 產物之濃度與狀況，確認完. 12.
(14) 成後，由定序公司進行雙股定序。. 三、親緣關係分析方法 使用 Sequencher5.0 (GeneCode, Boston, USA)套裝軟體整理序 列，並將所得序列與 NCBI(National Center for Biotechnology Information)線上資料庫進行比對，以確認物種。序列資料比對確認無 誤，並刪除掉引子與 tRNA-Leu 序列片段後，使用軟體 MEGA5.1 (Tamura et al., 2011)中的 ClustalW 進行排序(alignment)的工作，並進 行編輯以提供進一步分析使用。 將粒線體基因序列 COI+COII 進行資料分析，為獲得最適合綠弄 蝶屬資料分析的功能外群(functional outgroup)，首先以同為大弄蝶亞 科的四個屬成員，Badamia exclamations、Burara jaina、Hasora badra badra 與 Coeliades forestan 作為外群，利用 Bayesian inference 進行初 步分析，結果顯示 Coeliades forestan 與綠弄蝶屬之親緣關係最為接 近，之後皆以 Coeliades forestan 作為功能外群來進行分析，並利用不 同的方法來構築親緣關係樹。 最大儉約法(Maximun parsimony, MP) 利用軟體 MEGA5.1 (Tamura et al., 2011)，建立 MP 樹，演算法採 用 TBR 演算法(tree bisection-reconnection)；樹形選用嚴格共識樹；重. 13.
(15) 複 1000 次取樣(bootstrap)來確認系統樹分支之可信度。 最大或然法分析(Maximum Likelihood, ML) 使用網路軟體 PHYML(Guindon & Gascuel, 2003)進行最大或然 法分析。利用 jModelTest 0.1.1 (Posada, 2008)軟體來計算核苷酸演替 模式(substitution models)，藉由 AIC(Akaike Information Criterion)演算 法，所得之資料矩陣為 GTR+I+G。利用所獲得之資料設定參數，獲 得 ML 樹形。而樹形統計檢測 bootstrap value 則使用 PHYML 經由 1000 次重複所得。 Bootstrap(Felsenstein, 1985)是利用統計的方法來評估系統發育樹 各演化分枝的可信度，數值範圍由 50-70 稱為低支持度，範圍由 71-90 稱為中支持度，而數值高於 90 者稱為高支持度。 貝氏分析(Bayesian inference, BI) 使用 MrBayes 3.1 (Huelsenbeck & Ronquist, 2001)進行貝氏推論 分析，演替模型設定為 GTR+I+G；設定 1 條冷鏈，6 條熱鏈 (Nchains=6)，其餘參數設定則根據 modeltest 的結果，設定 Markov chain Monte Carlo(MCMC)5×106 次的運算，100 次的運算取樣一次， 並將 15%的取樣樹進行 burn in 捨去。 分支的支持度利用後驗機率(posterior probabilily)來輔證，數值範 圍由 0.6-0.8 稱為低支持度，由 0.81-0.95 稱為中支持度，而數值高於. 14.
(16) 0.95 者稱為高支持度。 遺傳變異度分析 使用 MEGA5.1 計算綠弄蝶屬不同種之間與種內的遺傳距離 (p-distance)。. 15.
(17) 結果 序列資料 本研究全部 43 個樣本中，共完成 39 個內群樣本與 4 個外群樣本 的粒線體 DNA，包含 COI+COII 共 2217 個 base pairs(bp)。而綠弄蝶 屬種間 COI+COII 序列的遺傳距離列於表三。種間的遺傳距離皆高於 3.2%。 親緣關係樹的建立 MP、ML 與 BI 的樹型圖詳見圖三、圖四與圖五，三圖皆為嚴格 共識樹，而內群皆獲得相近的分群結果：綠弄蝶屬內弄蝶可以分為 A 群(C. benjaminii、C. stigmatus、C. plateni、C. adhara 與 C. illuensis)、 B 群 (C. xanthopogon、C. subcaudatus 與 C. hemixanthus) 兩大單系 群，而且皆有高的支持度。 A 群總共包含了五個種，分別是 C. benjaminii、C. stigmatus、 C. plateni、C. adhara 與 C. illuensis，而且在兩個樹型圖上皆有高的支 持度。而五個種各自皆為支持度極高的單系群。其中 C. illuensis 這群 的樣本來自印尼，共包含兩個亞種，位於此單系群的最基部；其餘四 種 C. benjaminii、C. stigmatus、 C. plateni、C. adhara 也形成一個高 支持度的單系群。其中 C. stigmatus 與 C. plateni 兩種形成一支持度 極高的單系群，與 C. adhara 的關係較為接近，但是支持度並不高。. 16.
(18) B 群則包含三個種，分別是 C. xanthopogon、C. subcaudatus 與 C. hemixanthus，在兩個樹型圖上有高的支持度。而 B 群可以再被分 為兩個單系群，C. xanthopogon 這群樣本包含兩個種亞種，分別是來 自大陸與台灣的 C. xanthopogon xanthopogon 與來自菲律賓的 C. xanthopogon estrella，兩者形成一高支持度的單系群。而 B 群裡的另 一個單系群，樣本包含了兩個種，分別是 C. subcaudatus 與 C. hemixanthus，其中 C. subcaudatus 只有一個亞種，分別來自中國、泰 國、菲律賓、印尼等地，不同地區之族群樣本形成一高支持度的單系 群。而 C. hemixanthus 包含了三個亞種，分別是來自印尼哈馬黑拉島 的 C. hemixanthus mona 、 來 自 印 尼 西 巴 布 亞 的 C. hemixanthus hemixanthus 以及來自中國大陸的 C. hemixanthus furcatus。但是三個 亞種之間的關係並不清楚，未形成單系群，而且分群的支持度都極低。. 17.
(19) 討論 不同的分析方式與序列資料於綠弄蝶屬內群討論得到相近的結 果，以下根據分子資料重建的親緣關係來探討檢測綠弄蝶屬內蝴蝶的 分群是否符合 Chiba 的形態分群：. benjaminii-group 與 xanthopogon-group Chiba(1988) 依 據 交 尾 器 形 態 上 的 不 同 而 將 綠 弄 蝶 屬 分 為 benjaminii-group 和 xanthopogon-group 兩 大 群 。 在 本 實 驗 包 含 了 benjaminii-group 內全部五個種，分別是 C. benjaminii、C. stigmatus、 C. plateni、C. adhara、C. illuensis，而剛好和實驗結果中的 A 群相符 合，並且有極高的支持度支持 benjaminii-group 為一單系群。另外本 實 驗 也 包 含 了 xanthopogon-group 內 全 部 三 個 種 ， 分 別 是 C. xanthopogon、C. subcaudatus、C. hemixanthus，這三者分群也和實 驗結果中的 B 群相符合，並且也有極高的支持度，支持 xanthopogon-group 為一單系群。分子資料完全支持 Chiba 以形態所分 類的 benjaminii-group 和 xanthopogon-group 兩大群。. stigmatus–subgroup 與 benjaminii–subgroup Benjaminii-group. 可. 再. 分. 為. stigmatus–subgroup. 與. benjaminii–subgroup ， 本 實 驗 包 含 stigmatus–subgroup 底 下 的 C. 18.
(20) stigmatus 三個亞種中的兩個，並且為一支持度高的單系群。而本實驗 包含 C. benjaminii 底下四個亞種中的兩個，也是呈現一支持度高的單 系群。本實驗分子資料支持 Chiba 所分的 stigmatus–subgroup 與 benjaminii–subgroup 各自為單系群。同樣屬於 benjaminii-group 底下 卻未被歸類到所屬亞群的有 C. plateni、C. adhara、C. illuensis 三種， 因為形態特徵介於 stigmatus–subgroup 與 benjaminii–subgroup 之間， 在形態分群上無法明確的分類屬於哪一個亞群。以分子資料來探討可 得知，其中 C. illuensis 位於 A 群的最基部，是最早分化的類群，與 A 群其他 4 種成員形成之單系群互為姐妹群，但無法將其歸入 stigmatus–subgroup 或是 benjaminii–subgroup。而 C. plateni 與 C. stigmatus 形成一個支持度極高的單系群，也許可以將 C. plateni 歸入 stigmatus–subgroup。另外在實驗結果中 C. plateni 與 C. stigmatus 形成 的單系群雖然與 C. adhara 關係較近，而且三個種類雄性翅膀上皆有 性標（Brands），但是在兩個樹型圖所得的支持度皆非常低，因此關 於 C. adhara 的分群仍需要更進一步的討論。. xanthopogon -subgroup 與 hemixanthus-subgroup xanthopogon-group 可 以 再 被 分 為 xanthopogon-subgroup 與 hemixanthus-subgroup，本實驗包含 xanthopogon-subgroup 底下的 C.. 19.
(21) xanthopogon 三個亞種中的兩個，並且為一個支持度高的單系群。而 hemixanthus-subgroup 包含了兩個種分別是 C. hemixanthus 與 C. subcaudatus，而本實驗則包含 C. hemixanthus 四個亞種中的三個以及 C. subcaudatus 兩個亞種中的一個，C. hemixanthus 與 C. subcaudatus 形成一個高支持度的單系群。因此本實驗分子資料也支持 Chiba 所分 的 xanthopogon -subgroup 與 hemixanthus-subgroup 各自為單系群。. 種階層的問題 本研究所蒐集到的 8 種綠弄蝶，大多數的種皆自成一個單系群。 其中 C. xanthopogon 雖然是一個支持度高的單系群，但是所包含兩個 亞種，C. xanthopogon xanthopogon 與 C. xanthopogon estrella，各自形 成支持度極高的單系群，C. xanthopogon estrella 只分布在菲律賓，而 C. xanthopogon xanthopogon 則是廣泛分布在印度、大陸、越南、泰 國、馬來西亞等地，兩個亞種之間的遺傳距離高達 7.4%，明顯高於 一般蝴蝶的種內遺傳距離(3.2%) (Wiemer & Fiedler, 2007)。加上兩者 在抱器瓣的外觀也有明顯的差異(De Jong & Treadaway 2007)，因此本 研究傾向將兩者處理為不同的種，分別是 C. xanthopogon 與 C. estrella。另外 C. xanthopogon 的台灣族群最早被命名為 C. xanthopogon chrysopterus(Hsu, 1988)，後來被 Chiba(1988)視為原名亞種的同物異 名，有效學名成為 C. xanthopogon xanthopogon，但在本研究中，大陸 20.
(22) 的族群自成一單系群，與台灣的族群有一定的分化程度，遺傳距離約 為 1.5%，因此本研究傾向將台灣族群與大陸族群分為不同的亞種， 學名沿用 Hsu(1988)所發表的 C. xanthopogon chrysopterus。 只有 B 群中的 C. hemixanthus 這一種顯現出來的結果並非單系群 而是並系群。本次取樣 C. hemixanthus 中的三個亞種，分別是只分布 在新巴布亞紐幾內亞的 C. hemixanthus hemixanthus、只分布在哈馬黑 拉島的 C. hemixanthus mona 與分布廣泛包含尼泊爾、印度、中國、 泰 國 、 馬 來 西 亞 與 菲 律 賓 等 地 的 C. hemixanthus furcatus 。 C. hemixanthus furcatus 從樹型圖上看來與其他兩個亞種並未形成單系 群，反而是與另一種 C. subcaudatus 的關係較為接近，但是支持度非 常低。Noriyuki (2009)在寮國北部發現 C. subcaudatus 的幼蟲，外觀 與 C. hemixanthus furcatus 幼蟲的外觀非常相似，但是此兩種成蝶的 交尾器外觀有明顯的不同。因此在處理上，兩者應是屬於不同種。 再來討論 C. hemixanthus furcatus 與 C. hemixanthus hemixanthus， 雖然兩者成蝶交尾器外觀相似，但是 Igarashi & Fukuda(1997)認為兩 者幼蟲外觀差異極大，C. hemixanthus furcatus 幼蟲花紋是斑點狀的， 而 C. hemixanthus hemixanthus 幼蟲花紋則是條紋狀的，因此將兩者分 類為不同的物種，分別是 C. furcatus 與 C. hemixanthus。兩者所利用 的寄主植物也不相同，前者主要寄主食物為清風藤科以及防己科的植. 21.
(23) 物，而後者則是利用茶茱萸科的植物，再加上 C. hemixanthus furcatus 與 C. hemixanthus hemixanthus 的遺傳距離(6.6~9.2%)明顯高於一般蝴 蝶的種內遺傳距離，因此本研究傾向延用 Igarashi & Fukuda 的分類， 將兩者處理為不同的物種。C. hemixanthus mona 與另外兩個亞種 C. hemixanthus furcatus、hemixanthus hemixanthus 之間的遺傳距離範圍 約為 5.3%~8.4%，一樣是高於一般蝴蝶的種內遺傳距離，並且 C. hemixanthus mona 與另外兩者的交尾器外觀也有一定程度之差異，因 此本研究也傾向將 C. hemixanthus mona 處理為不同物種，C. mona。 另外 C. hemixanthus hemixanthus、 C. hemixanthus mona 各自只有一 隻樣本，也許增加樣本數與增加尚未蒐集到的亞種，可以對 C. hemixanthus 這一個類群能有更好的探討與了解。. 22.
(24) 參考文獻 Beltran, M., C. D. Jiggins, V. Bull, M. Linares, J. Mallet, W. O. McMillan & E. Bermingham 2002. Phylogenetic discordance at species boundary: comparative gene genealogies among rapidly radiating Heliconius butterflies. Mol. Biol. Evol. 19(12): 2176-2190. Brown, J. M., O. Pellmyr, J. N. Thompson & R. G. Harrison 1994. Phylogeny of Greya (Lepidoptera: Prodoxidae ), Based on Nucleotide Sequence Variation in Mitochomdrial Cytochrome Oxidase I and II: Congruence with Morphological Data. Mol. Biol. Evol. 11(1):128-141. Caterino, M. S. & F. A. H. Sperling 1999. Papilio phylogeny based on mitochondrial cytochrome oxidase I and II genes. Mol. Phylogenet. Evol. 11(1): 122-137. Chiba, H. 1988. A lepidopterist's view of panbiogeography. Riv. Biol.–B. Forum 81:553-568. Chiba, H. 1989. A note on a hesperiid larva reported from Zhejiang, China. Yadoriga (140):11. Chiba, H. 2009. A revision of the subfamily Coeliadinae. Bull. Kitakyushu Mus. Nat. Hist. Hum. Hist.,Ser. A, 7: 1-102. de Jong, R. & C. G. Treadaway 2007. Hesperiidae of the Philippine Islands. Butterflies of the World. Supplement 15:1-72. Felsenstein, J. 1985. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791. Guindon S, J. F. Dufayard, V. Lefort, M. Anisimova, W. Hordijk, & O. Gascuel 2010. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0. Syst Biol. 59:307–321. Hebert, P. D. N., S. Ratnasingham & J. R. deWaard 2003. Barcoding animal life:. 23.
(25) cytochrome coxidase subunit I divergences among closely related species. Proc. Biol. Sci. Suppl. 270: S96-S99. Hebert, P. D. N., E. H. Penton, J. M. Burns, D. H. Janzen & W. Hallwachs 2004. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci U S A101:14812–14817. Hennig, W. 1965. Phylogenetic Systematics. Ann. Rev. Entomol. 10:97-166. Hsu, Y.-F. 1988. A revision of Choaspes xanthopogon (Kollar),with description of a new subspecies, C. x. chrysopterus(Lepidoptera: Hesperiidae). Bull. Inst. Zool. Acad. Sin.27: 235-244 Hsu, Y.-F. & H.-C. Huang 2008. On the Discovery of Hasora mixta limata ssp. nov. (Lepidoptera: Hesperiidae: Coeliadinae) from Lanyu, Taiwan, with Observations of Its Unusual Immature Biology. Zoological Studies 47(2): 222-231. Huelsenbeck, J. P. & Ronquist F. 2001. Mrbayes: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics 17: 754-755. Igarashi, S. 1992. New problems on the genus Choaspes (Lepidoptera, Hesperiidae). Butterflyies (1):20-25. Igarashi, S. & H. Fukuda 1997. The Life Histories of Asian Butterflies. Vol. 1. Tokai University Press, Tokyo. Megens, H.-J., W. J. van Nes, C. H. M. van Moorsel, N. E. Pierce & R. de Jong 2004 Molecular phylogeny of the oriental butterfly genus Arhopala (Lycaenidae Theclinae)inferred from mitochondrial and nuclear genes. Syst. Entomol. 29, 115–131. Posada, D. 2008. jModelTest: Phylogenetic model averaging. Mol. Biol. Evol. 25: 1253-1256. Noriyuki, S., M. Yago & J. Uehara 2009. A congener-like larval form of Choaspes subcaudatus (Lepidoptera: Hesperiidae) from northern Laos, with a description of 24.
(26) its immature stages and male genital morphology. Butterflies51: 18–22. Tamura, K., D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei & S. Kumar 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol. doi:10.1093/molbev/ msr121. Warren, A. D., J. R. Ogawa & A. V. Z. Brower 2008. Phylogenetic relationships of subfamilies and circumscription of tribes in the family Hesperiidae (Lepidoptera: Hesperioidea). Cladistics (24):1–35. Warren, A. D., J. R. Ogawa & A. V. Z. Brower 2009. Revised classification of the family Hesperiidae (Lepidoptera: Hesperioidea) based on combined molecular and morphological data. Systematic Entomology 34:467-523. Wiemers ,M. & K. Fiedler 2007. Does the DNA barcoding gap exist? – a case study in blue butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae) Frontiers in Zoology. 4:8. Wolstenholme, D. R. 1992. Animal Mitochondrial DNA: Strecture and Evolution. International Review of Cytology. Vol. 141:173-211.. 25.
(27) 表一、各蝶種樣品採集數量與採集地 蝶種. 編號. 採集地. 緯度. 經度. C. adhara visaya. H1063. Mindoro, PHILIPPINES. 13.1° N. 121.1° E. C. adhara visaya. H1537. Leyte, PHILIPPINES. 11° N. 125° E. C. adhara visaya. H1587. Leyte, PHILIPPINES. 11° N. 125° E. C. benjaminii flavens. H1577. Gn. Jasar, MALAYSIA. 4.5° N. 101.3° E. C. benjaminii flavens. H1578. Gn. Jasar, MALAYSIA. 4.5° N. 101.3° E. C. benjaminii flavens C. benjaminii flavens C. benjaminii japonicus C. benjaminii japonicus C. benjaminii japonicus C. benjaminii japonicus C. benjaminii japonicus C. benjaminii japonicus C. benjaminii japonicus. H1579 H1580 H344 H564 H770 H1475 H1476 H1477 H1588. Gn. Jasar, MALAYSIA Gn. Jasar, MALAYSIA Sichuan, CHINA Okinawa, JAPAN Chongqing, CHINA Taipei, TAIWAN Taipei, TAIWAN Taipei, TAIWAN Xam Nua, LAOS. 4.5° N 4.5° N 30° N 26° N 29.6° N 25.1° N 25.1° N 25.1° N 20.4° N. 101.3° E 101.3° E 104° E 127.5°E 106.5° E 121.5° E 121.5° E 121.5° E 104° E. C. hemixanthus furcatus. H529. Sichuan, CHINA. 30° N. 104° E. C. hemixanthus furcatus. H1509. Shaanxi, CHINA. 34.1N. 109° E. C. hemixanthus furcatus C. hemixanthus hemixanthus. H1566 H1527. Zhejiang, CHINA Irian Jaya, INDONESIA. 30.3°N 5° N. 120.1°E 138° E. C. hemixanthus mona. H1528. Halmaheira, INDONESIA. 0.3° N. 127.5°E. C. illuensis ornatus C. illuensis ornatus C. illuensis illuensis C. plateni plateni C. plateni plateni C. plateni plateni C. stigmatus caudatus C. stigmatus caudatus. H1519 H1533 H1586 H1515 H1583 H1584 H1518 H1534. Irian Jaya, INDONESIA Irian Jaya, INDONESIA Seram Island, INDONESIA S. Sulawesi, INDONESIA S. Sulawesi, INDONESIA S. Sulawesi, INDONESIA Kota Tinggi, MALAYSIA Kota Tinggi, MALAYSIA. 5° N 5° N 3.1° S 3.4° S 3.4° S 3.4° S 4.5° N 1.7° N. 138° E 138° E 129.5° E 120° E 120° E 120° E 101.3° E 104° E. C. stigmatus stigmatus. H1525. Tam Dao, VIETNAM. 21.2° N. 105.3° E. C. stigmatus stigmatus. H1567. Hainan,CHINA. 20.1° N. 110.2° E. C. subcaudatus crawfurdi. H937. Yunnan, CHINA. 24° N. 101° E. C. subcaudatus crawfurdi. H1061. Bongao Tawi-Tawi, PHILIPPINES. 5.1° N. 119.4°E. C. subcaudatus crawfurdi C. subcaudatus crawfurdi C. subcaudatus crawfurdi. H1526 H1538 H1581. Sebulu, INDONESIA Bongao Tawi-Tawi, PHILIPPINES Ranong,THAILAND. 0.1° S 5.1° N 10° N. 117° E 119.4°E 98.4° E. 26.
(28) 蝶種. 編號. 採集地. 緯度. 經度. C. xanthopogon estrella. H1062. Mindoro, PHILIPPINES. 13.1° N. 121.1° E. C. xanthopogon estrella. H1582. Mindoro, PHILIPPINES. 13.1° N. 121.1° E. C. xanthopogon chrysopterus. H6. Taipei, TAIWAN. 25.1° N. 121.5° E. C. xanthopogon xanthopogon. H247. Sichuan, CHINA. 30° N. 104° E. C. xanthopogon xanthopogon. H256. Sichuan, CHINA. 30° N. 104° E. C. xanthopogon xanthopogon Badamia exclamations Burara jaina Coeliades forestan Hasora badra badra. H771 Lep103 H2 H1601 Lep104. Chongqing, CHINA Taipei, TAIWAN Taipei, TAIWAN Lume, D. R. CONGO Taipei, TAIWAN. 29.6° N 25.1° N 25.1° N 4.7° S 25.1° N. 106.5° E 119.4°E 119.4°E 26.5° E 119.4°E. 27.
(29) 表二、綠弄蝶屬親緣關係研究使用之核苷酸引子 Gene. Primer id. 5’→ 3’. F/R. COI&COII. Cox-J-1460. CAATT TATCG CCTAA ACTTC AGCC. F. Zcox-J-1530. CAACA AATCA TAAAG ATATT GG. F. H1co1-1700. RAGTCA ATTTC CRAAT CCTCC. R. H1co1-1880F. TCAAG AAGAA TTGTA GAAAA TGG. F. MiBocox-J-1920. ACAGT TTACC CCCCA CTTTC. F. MiBocox-N-2010. AGTTG TAATA AAATT AATWG CTCCT A. R. cox-N-2191. CCCGG TAAAA TTAAA ATATA AACTT C. R. Mean-J-2191. GATTT TTTGG TCATC CAGAA G. R. Chcox-N-2360. GAGCT CATAC AATAA ATCCT AAT. R. H1co1-2360. RGAGCT CATAC AATAA ATCCT A. R. C1-J-2500. CAAGA AAGAG GAAAA AAAGA AAC. F. Zcox-N-2530. CTCCT GTTAA TCCTC CTACA GT. R. Bocox-J-2550. CTGTA GGAGG ACTAA CTGGA G. F. C1-J-2550. ATTTA CWGTA GGWAT AGATA TTGA. F. C1-J-2600c. TATTA TGTAG TAGCT CATTT TCA. F. Chcox-J-2600. TCTAT RGGAG CYGTA TTTGC TATT. F. H1c1-2600F2. TTGAT ATCCT TTATT TACAG G. F. H1c1-2600F3. GGAGG ATTTA TTCAT TGATA. F. Tycox-J-2600. ACAGT TGGAG GATTG ACAGG AG. F. Cppcox-N-2770. TGGAT AATCA GAATA TCGTC GAGG. R. Jpcox--2840. TTTTG NTATC ATTCA ATAGA TGA. R. Graphium-N-2850 GAATG TTCTG AAGGA GGTAA AT. R. Efcox-J-3000. ATATG TAATG GATTT AAACC CC. F. C2-3138-F2. AGAGT TTCAC CTTTA ATAGA ACA. F. cox-J-3138. AGAGC CTCTC CTTTA ATAGA ACA. F. C2-3140. TCCTCCTTTAATAGAACAAAT. F. C2-N-3140. ATTTGTTCTATTAAAGGTGA. F. Mean-N-3230. ATTCA ATTAT TTGCC CTTCT A. R. C2-N-3300c. GTAAT TGCWG GWARR ATAGT TCA. R. H1c2-3300R1. TTGTT CTTCT AATAA AAATC G. R. Skcox-N-3300. ATAAA CGTAA AGATG GTAAA GC. R. Tycox-N-3300. GAGAT AGCTG GTAAA ATAGT TC. R. Mibo--3360. CCATT AAATC AATTG GACAT CAA. R. 28.
(30) Gene. Primer id. 5’→ 3’. F/R. cox-N-3389. TCATA ACTTC AATAT CATTG. R. cox-N-3782. GAGAC CATTA CTTGC TTTCA GTCAT CT R. 29.
(31) 表三、綠弄蝶屬粒線體 DNA 之 COI+COII 基因各種間遺傳距離 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 1. Choaspes benjaminii 2. Choaspes stigmatus. 0.062. 3. Choaspes plateni. 0.060. 0.037. 4. Choaspes adhara. 0.062. 0.055. 0.053. 5. Choaspes illuensis. 0.085. 0.085. 0.080. 0.078. 6. Choaspes xanthopogon. 0.127. 0.121. 0.112. 0.124. 0.125. 7. Choaspes hemixanthus. 0.103. 0.105. 0.103. 0.103. 0.113. 0.089. 8. Choaspes subcaudatus. 0.122. 0.114. 0.111. 0.120. 0.127. 0.102. 30. 0.058.
(32) 圖一、benjaminii-group 與 xanthopogon-group 交尾器比較圖，左: benjaminii-group; 右：xanthopogon-group(引用自 Chiba, 2009)。. 31.
(33) 3. 1.Tam Dao, VIETNAM 2.Xam Nua, LAOS 3.Sichuan, CHINA 4.Chongqing, CHINA 5.Shaanxi, CHINA 6.Zhejiang, CHINA 7.Yunnan, CHINA 8. Hainan,CHINA 9. Taipei, TAIWAN 10. Banong,Thailand 11. Okinawa, JAPAN 12. Mindoro, PHILIPPINES 13. Leyte, PHILIPPINES 14. Bongao Tawi-Tawi, PHILIPPINES 15. Gn. Jasar, MALAYSIA 16. Kota Tinggi, MALAYSIA 17. S. Sulawesi, INDONESIA !8. Irian Jaya, INDONESIA 19. Seram Island, INDONESIA 20. Sebulu, INDONESIA. 5 4. 6. 11. 7 9 2. 1 8. 10 12 13 14. 15 16 20. 17 19. 圖二、綠弄蝶屬樣本來源示意圖。 32. 18. 圖一、綠 弄蝶屬 樣本來.
(34) H1601 Coelidiades forestan. 外群. H1579 Choaspes benjaminii flavens 99. H1577 Choaspes benjaminii flavens H1580 Choaspes benjaminii flavens. 62. 100. 61. H1578 Choaspes benjaminii flavens. 61. H564 Choaspes benjaminii japonicus. 61. H1477 Choaspes benjaminii japonicus. 62. H1588 Choaspes benjaminii japonicus. 95. H770 Choaspes benjaminii japonicus H1476 Choaspes benjaminii japonicus. 99. H344 Choaspes benjaminii japonicus. 87. H1518 Choaspes stigmatus caudatus. 100. H1534 Choaspes stigmatus caudatus. 99. A群. H1567 Choaspes stigmatus stigmatus H1525 Choaspes stigmatus stigmatus. 100. 99. H1583 Choaspes plateni plateni. 96. H1584 Choaspes plateni plateni. 99 100. H1515 Choapses plateni plateni. 53. H1063 Choaspes adhara visaya. 71. H1537 Choaspes adhara visaya 100. H1587 Choaspes adhara visaya H1586 Choaspes illuensis illuensis H1533 Choaspes illuensis ornatus. 99 100. H1519 Choaspes illuensis ornatus. 100. H1582 Choaspes xanthopogon estrella H1062 Choaspes xanthopogon estrella. 99. H256 Choaspes xanthopogon xanthopogon. 96 100. H247 Choaspes xanthopogon xanthopogon H771 Choaspes xanthopogon xanthopogon. 100. H6 Choaspes xanthopogon xanthopogon H937 Choaspes subcaudatus crawfurdi. 75. H1581 Choaspes subcaudatus crawfurdi. 100 99. H1538 Choaspes subcaudatus crawfurdi 57. H1526 Choaspes subcaudatus crawfurdi. 92. H1061 Choaspes subcaudatus crawfurdi. 100. 44. B群. H1527 Choaspes hemixanthus hemixanthus H1528 Choaspes hemixanthus mona 96. H1566 Choaspes hemixanthus furcatus. 90. H1509 Choaspes hemixanthus furcatus 100. H529 Choaspes hemixanthus furcatus. 圖三、COI+COII 所得之最大儉約(MP)樹型圖，樹型選擇嚴格共識樹，分支上之數值為經過 1000 次重複之 bootstrap。. 33.
(35) 外群. H1601 Coelidiades forestan H1580 Choaspes benjaminii flavens 93. H1578 Choaspes benjaminii flavens 39. H1577 Choaspes benjaminii flavens 26. 100. H1579 Choaspes benjaminii flavens H344 Choaspes benjaminii japonicus H1476 Choaspes benjaminii japonicus. 82. H770 Choaspes benjaminii japonicus. 59. 25. H1588 Choaspes benjaminii japonicus 22. H1477 Choaspes benjaminii japonicus 11. 83. H564 Choaspes benjaminii japonicus H1567 Choaspes stigmatus stigmatus. 100. H1525 Choaspes stigmatus stigmatus. 100 100 98. A群. H1518 Choaspes stigmatus caudatus H1534 Choaspes stigmatus caudatus. H1515 Choapses plateni plateni. 100 100. H1583 Choaspes plateni plateni. 39. 54. H1584 Choaspes plateni plateni H1587 Choaspes adhara visaya. 100. H1537 Choaspes adhara visaya 72. H1063 Choaspes adhara visaya H1586 Choaspes illuensis illuensis 100. H1533 Choaspes illuensis ornatus. 100. H1519 Choaspes illuensis ornatus H1582 Choaspes xanthopogon estrella. 100. H1062 Choaspes xanthopogon estrella. 100. H6 Choaspes xanthopogon xanthopogon 100 100. H771 Choaspes xanthopogon xanthopogon H256 Choaspes xanthopogon xanthopogon. 70. H247 Choaspes xanthopogon xanthopogon H937 Choaspes subcaudatus crawfurdi. 48. 99. H1581 Choaspes subcaudatus crawfurdi. 93. H1538 Choaspes subcaudatus crawfurdi 92. 36. 100. B群. H1526 Choaspes subcaudatus crawfurdi H1061 Choaspes subcaudatus crawfurdi. 93. 99. H529 Choaspes hemixanthus furcatus H1566 Choaspes hemixanthus furcatus. 65. H1509 Choaspes hemixanthus furcatus H1528 Choaspes hemixanthus mona. 43. 0.08. H1527 Choaspes hemixanthus hemixanthus. 圖四、COI+COII 所得之最大相似度 (Maximum likelihood)樹型圖，並以 bootstrap 重複取樣 1000 次。 34.
(36) 外群. H1601 Coelidiades forestan H1577 Choaspes benjaminii flavens H1580 Choaspes benjaminii flavens. 0.99. H1579 Choaspes benjaminii flavens H1578 Choaspes benjaminii flavens H564 Choaspes benjaminii japonicus. 1. H1477 Choaspes benjaminii japonicus 0.91. H1476 Choaspes benjaminii japonicus. H770 Choaspes benjaminii japonicus. 0.99. H1588 Choaspes benjaminii japonicus H344 Choaspes benjaminii japonicus 0.94. H1518 Choaspes stigmatus caudatus. 1. H1534 Choaspes stigmatus caudatus. 1. H1567 Choaspes stigmatus stigmatus. 1. A群. H1525 Choaspes stigmatus stigmatus. 1. H1583 Choaspes plateni plateni 1. 1H1515. 0.52. Choapses plateni plateni. H1584 Choaspes plateni plateni H1587 Choaspes adhara visaya 1. H1063 Choaspes adhara visaya. 0.65. H1537 Choaspes adhara visaya H1586 Choaspes illuensis illuensis 1. H1533 Choaspes illuensis ornatus. 1. H1519 Choaspes illuensis ornatus H1582 Choaspes xanthopogon estrella. 1. H1062 Choaspes xanthopogon estrella H256 Choaspes xanthopogon xanthopogon. 1. 0.96. 1H247 1. Choaspes xanthopogon xanthopogon. H771 Choaspes xanthopogon xanthopogon H6 Choaspes xanthopogon xanthopogon 1. 0.99. 1. H1526 Choaspes subcaudatus crawfurdi. H1061 Choaspes subcaudatus crawfurdi. H1538 Choaspes subcaudatus crawfurdi 0.99. H937 Choaspes subcaudatus crawfurdi. H1581 Choaspes subcaudatus crawfurdi. 0.54. 0.81. H1566 Choaspes hemixanthus furcatus. H1509 Choaspes hemixanthus furcatus. 0.99. 1. H529 Choaspes hemixanthus furcatus 0.02. H1528 Choaspes hemixanthus mona. 0.53. H1527 Choaspes hemixanthus hemixanthus. 圖五、COI+COII 所得之貝氏推論(Bayesian inference)分析樹型圖。 35. B群.
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