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教育部高中生物科學資優生培育計畫-高雄區
DNA萃取純化與電泳分析 重組DNA技術與基因選殖
聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR) DNA定序(DNA sequencing) 基因定點突變 (Site-directed mutagenesis)技術 DNA交互配對(雜交)反應(DNA hybridization)
授課教師：楊文仁
任職單位：高雄大學生命科學系
2細菌
質體DNA
DNA 可 分 為 兩 大類 ： (1)染 色體 DNA (chromosomal DNA)；(2)質體DNA (plasmid DNA)，質體存在於許多
細菌及酵母菌等生物中。 質體是細菌染色體以外的遺傳物質，由雙股環狀DNA 組成。質體上的基因，可以讓攜帶該質體的細菌具有 某些特性(例如對抗生素具有抗藥性)。細菌所攜帶之 質體DNA的大小及數目不一定，長度從數千鹼基對 (base pair, bp)至數十萬鹼基對都有。 質體DNA具有自行複製的能力，可以在細菌間互相轉 移，而將外來的基因轉移到接受者細菌細胞中表現。 在 生 物 技 術 的 應 用 方 面 ，質 體 DNA常 被 做 為載 體 (vector)用以選殖特定的DNA以及表現特定的蛋白質。 因此，質體DNA的製備是分子生物學的一項基本且重 要的技術。 質體的名稱一般以小寫英文字母p為字首，接上幾個 大寫英文字母用以描述該質體，在英文名稱添加數字 代表該質體被建構成功的先後順序。例如：pBR322及 pBR325表示由Bolivar和Rodriguez兩人所建構的質體； pUC18及pUC19表示經由University of California所研發 建構成功。
細菌的
接合作用(conjugation)
是細菌間傳遞
遺傳物質
的方法之一，
它必須由兩細菌建立菌體的連結，類似
運輸孔道
的功能，再把
DNA由一方傳送到對方菌體內。
進行接合的兩細菌，兩者是
不同的交配型(mating type)
，
供體細胞
(donor cell)
必須攜有
質體
，而
受體細胞(recipient cell)
通常則不具
有質體。在革蘭氏陰性菌中，質體DNA帶有合成
性纖毛(sex pilus)
的基因，性纖毛突出於
供體細胞
表面，當它與
受體細胞
靠近時，能
拉近兩細胞的距離以便直接接觸。
大腸桿菌(E. coli)的質體含有
致育因子(fertility factor，簡稱為F
factor)
，即
F質體(F plasmid)
，是最先被發現可於細菌
接合作用
時
被轉移的質體。
F質體
可以獨立存在於細胞質中，也可以
嵌入細菌
的染色體
，長度
約10萬個鹼基對
，擁有自己的
複製起始點
。擁有F
質體的
供體細胞
簡稱為
F
+細胞
；而
受體細胞
則稱為
F
-細胞
。
受體細胞
因
接合作用
可獲得原來沒有的能力，例如：對抗生素的
抗
藥性
或是
新的新陳代謝功能
，使其能利用不同的營養來源或代謝物
。因此，對多數的
有害細菌
來說，接合作用更促進其族群的擴張。
3細菌接合 (bacterial conjugation)示意圖
染色體DNA 生育質體 (fertility plasmid) 3.移動的質體被剪切後 ，將單鏈DNA被轉移 到受體細胞。 1.供體細胞(Donor cell)產生性纖毛 (sex pilus)。 2.性纖毛連上受體 細胞(Recipient cell)，使兩細胞連 在一起。 4.兩個細胞重新 將質體繞成圈， 合成第二條鏈， 性纖毛再生。這 時兩個細胞都能 提供質體了。 DNA聚合酶 鬆弛小體 傳遞體 (F+細胞) (F-細胞)5
質體DNA萃取的原理
要將質體DNA從細菌內萃取出來，必須先將細菌的
細胞壁
及細胞膜破壞，造成
細菌裂解
，使細菌細胞內的質體DNA
及其他分子釋放出來，再利用質體DNA和其他分子在
物理
或化學特性的差異
，讓質體DNA分子和其他分子之間有足
夠的差異，逐步
移除其他分子
，進而萃取純化質體DNA。
步驟
1.培養並收穫細菌。
2.破壞細菌的細胞壁與外膜。
3.破壞細胞膜使細菌裂解。
4.移除染色體DNA。
5.移除蛋白質與RNA。
6.純化質體DNA。
6細菌質體DNA萃取
萃取質體DNA的方法很多，最常用的 是鹼性溶裂法(alkaline lysis)及煮沸法 (boiling method)。 鹼性溶裂法(alkaline lysis) 原理是利用鹼處理質體DNA和染色 體DNA，使兩者雙股打開呈單股狀 態，再加入酸中和鹼使得單股DNA 回復成為雙股DNA。 以氫氧化鈉(NaOH)及十二烷基硫酸 鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)將 細菌分解，並使蛋白質及DNA變性 (denaturation)，再用酸加以中和。 質體DNA在酸鹼中和後可以恢復原 狀，但細菌染色體DNA則無法完全 復原，而與SDS-K+ 形成複合物，可 經由離心沉澱加以去除。 上清液內所含的質體則可以用酒精 (乙醇)或異丙醇將其沉澱，即可取得 質體。 http://bioinfo2010.wordpress.com/ 提高滲透壓使細胞裂解7
煮沸法(boiling method)
製備質體DNA
boiling Plasmid Plasmid ：(原生質)球狀體,原生質球幾乎 或完全去掉了細胞壁的細菌細胞 溶菌酶 +乙二胺四乙酸 (聚乙二醇辛基苯基醚) 8 http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/
萃取的質體，以不同限制酵素作用， 經電 泳分 離 DNA 片 段 後 ， 比 較 各 DNA片段之分子量大小，用以檢測 所分離的質體DNA之正確性。 瓊脂膠電泳是把瓊脂糖(agarose)加 熱溶解後再冷凝，瓊脂膠會以氫鍵形 成凝膠。而經限制酶切過的 DNA 片 段，在電場影響下會在凝膠中移動， 帶負 電 荷 的 DNA分 子 會 往正 電 極 (positive electrode)方向移動。 移動速度依分子大小而定，分子愈大 移動性愈慢。凝膠中agarose 的濃度 決定空隙的大小，特定大小的DNA 片段在不同濃度的凝膠中移動速率均 不同，故每次膠體電泳均需以DNA marker (DNA ladder; DNA standard) 進行比對，以推測DNA樣品的大小。 核 酸 在 膠 體 中 可 經溴 化 乙 錠 (ethidium bromide, EtBr)染色，EtBr
會嵌入核酸的鹼基中，以紫外線照射， 則核酸吸收紫外線波長的光線，再經 EtBr 放出可見波長的光線，藉以觀 察核酸的位置。 http://www.molecularstation.com/agarose-gel-electrophoresis/ 小片段 大片段 10 http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/ DNA膠體電泳影片(3:26): https://www.youtube.com/watch?v=dSQQ67oCHXs
11 M 1 2 3 4 Circular form Linear form Coiled form Supercoiled form Q:下列那種處理最不會影響DNA片段在電泳膠體內之泳動速率？ (A) 將DNA片段上所帶的負電加以中和 (B) 增加DNA片段的長度 (C) 將DNA片段的序列改變 (D) 將DNA片段上的胞嘧啶加以甲基化 (E) 將DNA片段縮短 解答: 二○一○年國際生物奧林匹亞競賽 國手選拔初賽 12
重組DNA技術(Recombinant DNA technology)
= 基因工程;遺傳工程(Genetic engineering)
Key element of biotechnoloy：use recombinant DNAmethods to move a gene from any organism to any other organism.
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重組DNA之建構
製備重組DNA分子的兩種重要酵素： 1.限制內切酶：就像一把剪刀在特定 專一位置上剪切DNA分子 2.DNA接合酶：就像膠水般能將二段 DNA接合在一起 黏性末端 14Restriction enzymes split DNA into specific fragments
Restriction enzymes(restriction endonucleases, RE): recognize specificbase sequencesin double strand DNA and cleave, at specific places, both strands of a duplex containing the recognized sequences.
1. Restriction enzymes are found in prokaryotes. Their biological role is to cleave foreign DNA.
2. The recognized sequence is “palindromic (迴文)”. Greek means “running back again”.
e.g. Radar; Do geese see God?上海自來水來自海上; 花蓮噴水池水噴蓮花
3. The pattern of fragment that DNA be cleaved by several RE
can serve as a fingerprintof a DNA molecule (RE map)
SacII (from Streptomyces achromogenes)
西湖回游魚游回湖西; 山果花開花果山 霧鎖山頭山鎖霧；魚傍水活水傍魚 上水居民居水上；大波美人魚人美波大 法國逃難者難逃國法
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限制酶的種類
已知的限制酶分為Type I、Type II與 Type III三類。
Type I與Type III限制酶同時具有endonuclease與methylase的活性。 Type I限制酶會隨機的切割距離辨識位置~1000 bp的序列，Type III
則只會切割距離辨識位置24~26 bp的序列。 Type II限制酶則會專一地切割所辨識的核酸序列的位置，一般可辨識 雙股DNA上特定的4~8個鹼基，並能在認知序列內的特定位點上切割 雙股螺旋DNA。 每一種限制酶能辨識一特定的DNA序列並加以切割，但它不會切割細 菌自己的 DNA，因為細菌 DNA 上的切割位置已被甲基化，稱為限制 修飾系統(restriction-modification system)。 不同的細菌中可純化出具不同專一性的限制酶，可用來做基因剪接時 的「剪刀」，使其成為基因或分子遺傳操作上極為有用的工具，目前 被 廣 泛 應 用 於遺 傳 工 程 (genetic engineering)、基 因 選 殖 (gene cloning)和基因圖譜(gene mapping)分析。
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限制酶的命名
限制酶的命名是以該酶來源的原核生物的學名爲依據，即酶的名稱的 第一個大寫字母取自於屬名的第一個字母，第二、三個小寫字母取自 於種名的前兩個字母，字母後面的羅馬數字則是簡單地表明該種生物 中不同限制酶分離的先後順序。 限制酶名稱的書寫方式，前三個字母常用斜體或加下橫線表示。例如 ：分離自產色鏈黴菌(Streptomyces achromogenes )的兩種限制酶被 分別命名爲SacI和SacII。 若同一生物種內又分爲不同的血清型或菌株品系，其名稱則放在限制 酶名稱的第三個字母之後。 例如限制酶HincⅡ和HindⅢ則是分別來自流行性感冒嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)的c和d血清型菌株。 E Escherichia (屬) co coli (種) R RY13 (品系) I 首先發現 在此類細菌中發現 的順序 Quiz: 請說明限制酶HindIII各 字母所代表的意義。(12分) 【94 年高考】 1. H： 2. in： 3. d ： 4. III：Type II restriction endonuclease Cohesive end (Sticky end) (protruding; overhang) HindIIcleavage EcoRIcleavage 平頭末端;鈍端 18
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DNA連接作用
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DNA 連接酶作用機制
磷酸二酯鍵
All ATPand NAD-dependent ligases
appear to join DNA in a similar way but utilize a different nucleotide energy sourceto catalyze the reaction.
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基因選殖 (gene cloning)
基因選殖的步驟包括： 分離感興趣的DNA(例 如胰島素基因) 把感興趣的DNA接合 到載體 把重組的DNA轉形到 宿主細胞中 篩選含有重組DNA的 宿主細胞 檢測含有重組DNA或 是否產出適當蛋白質 產物的宿主細胞 22選殖載體 (cloning vector)
選殖載體的條件： 具有複製起點，使DNA可以在宿主細胞中進行複製。 具有許多單一特殊的限制酶切位，以供選殖DNA片段使用。 具有篩選性的標記，可以用來測定選殖重組DNA是否已轉移至細胞中或顯示 外來的DNA是否已經插入至載體上。 pBR322 multiple cloning site (MCS)23
Clone a foreign DNA into the PstI site of pBR322
1. Cut the vector to generate the sticky ends
2. Cut foreign DNA with PstI also – compatible ends
3. Combine vector and foreign DNA with DNA ligaseto seal sticky ends 4. Now transform the plasmid into E.
coli
24 Traditional method involves incubating bacterial cells inconcentrated calcium saltsolution
The solution makes the cell membraneleaky,permeable to the plasmid DNA
Newer method uses high voltage to drive the DNA into the cells in process calledelectroporation
Bacterial Transformation
Transformation produces bacteria with:
Religated plasmid Religated insert
Recombinants
Identify the recombinants using the antibiotic resistance(Fig. 4.4) Grow cells with tetracyclineso only cells with plasmid grow, not foreign DNA only.
Next, grow copies of the original colonies with ampicillinwhich kills cells with plasmid including foreign DNA.
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Screening With Replica Plating
Replica plating transfers clone copies from original tetracyclineplate to a plate containing ampicillin.
A sterile velvet (天鵝絨)transfer tool can be used to transfer copies of the original colonies
Desired colonies are those that doNOT
grow on the new ampicillin plate.
Plasmid cloning影片(4:23): http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o&NR=1
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Vectors for cloning large pieces of DNA
Fosmidsare similar to cosmids but are based on the bacterial F-plasmid.The cloning vector is limited, as a host (usually E. coli) can only contain one fosmidmolecule. Low copy number
offers higher stabilitythan comparable high copy number cosmids. (黏質體)
(Bacterial artificial chromosome)
27 Use of reverse transcriptaseto make cDNA of a eukaryotic gene
分離細胞全部RNA 純化mRNA 以反轉錄酶製備互補 DNA (complementary DNA, cDNA) 用PCR放大擴增感興趣 的基因的cDNA 以電泳分離純化感興趣 的基因
如何分離
真核生物
中感興趣的基因
利用
反轉錄酶
製備
感興趣的基因
外顯子 內含子 28聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)
由Kary Mullis發明，並於1993年獲得了諾貝爾化學獎。PCR能使DNA在試管中大量擴增，其原理是在擬擴增的DNA片段兩端分別設 計一個前置引子(forward primer)和反置引子(reverse primer)，使其與已變性 的單股目標DNA緩冷配對黏合(annealing)後，利用DNA聚合酶(DNA polymerase)以目標DNA的兩股分別做為模板(template)來合成新的DNA股。 PCR過程主要分成三大部份: 1.對黏變性反應(denaturation)：以高溫92℃-95℃使雙股模板DNA分離 2.緩冷配合(annealing)：使引子與單股模板DNA做緩冷配對(40℃~52℃) 3.延長反應(extension)：將溫度調整到DNA聚合酶作用的有效溫度而合成新的 DNA股(72℃) 在理想的條件下，DNA以幾何級數增加。理論上，一個DNA分子若重複操作 PCR 25次，那麼DNA的分子數將會擴增到225= 106個分子。 影響PCR DNA合成時精確性的因素 所欲合成的DNA的長度，長度越長出錯機率越高。 循環數(越多時精確度越低) 聚合酶的種類(有校對能力者為佳) Mg2+(0.5~2.5 mM)的濃度。
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聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)
一般的DNA聚合酶有效作用溫度是37℃，在高溫分離雙股時會破壞DNA聚合酶 的活性。然而在耐高溫的細菌，棲熱水生菌(Thermus aquaticus)中分離出來的 DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)，在95℃，其活性的半衰期(half life)長達40 分鐘，故可供PCR操作使用。 Taq DNA聚合酶的有效作用溫度為72℃，在此溫度，每分鐘可合成2000~4000 個核苷酸(nucleotides)。由於Taq DNA聚合酵素的發現，促使PCR之操作得以 自動化。 Taq聚合酶缺乏3‘至5’端外切酵素(exonuclease)的特性，因而在DNA合成時沒有 校對(proofreading)的功能，Taq聚合酶合成DNA時，在每一個循環中，核苷酸 的錯誤配對頻率可高達1/6000。 PCR的技術已廣泛地應用在學術，工業和醫學上的研究，例如 DNA序列的分析 病原菌的分析 基因定位突變 遺傳病之診斷 基因表現與選殖 水質及食品檢驗 30聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)
31 PCR實驗操作:http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ 利用PCR技術將DNA分子擴增之電泳圖 32
PCR的反應條件
注意！此為PCR常用之反應條件，隨著樣本、DNA序列等的不同，各項條件應斟酌調整。 DNA template 0.1~1μg Primers 0.1-1.0 μM each dNTPs 0.2 mM each KCl 50 mM MgCl2 1.5 mM Tris-HCl (pH 8.4) 10 mMTaq polymerase 2.5 Unit
Total volume 50 or 100 μL Buffer 94℃ 5 min 94℃ 1 min 55℃ 1 min 25 ~ 30 cycles 72℃ 1 min 72℃ 5 min 4℃ ∞
PCR溫度循環設定
33 起始以高溫將雙股DNA分離 對PCR而言，將雙股DNA完全分開是相當重要的起始步驟，作用不完全將會降低 PCR的產量。在GC含量50%以下時，溫度設定在95℃時間1~3分鐘。時間可隨 著模版上GC的比例增加逐漸調升。 通常94~95℃進行1~2分鐘即可將兩股DNA分離，如果GC含量過高，可將時間提 高 至 4~5 分 鐘 。 或 者 加 入10-15% 甘 油 (glycerol) 、 10% 二 甲 基 亞 碸 (dimethyl sulfoxide, DMSO) 、5%甲醯胺(formamide)等溶液促使DNA分離，但此等溶液的
副作用是會抑制Taq DNA polymerase約50%的活性。
Primer黏合溫度
一般來說，引子與模版DNA黏合溫度(annealing temperature;Ta)大約是引子解鏈
溫度(melting temperature; Tm)減5 ℃。而這溫度最好落於55-75 ℃之間。如果除 了目標產物外，有些非預期的產物出現，則可逐漸提高黏合溫度約1~2℃。 若2 條引子所算出之Ta 相差超過6 ℃以上(可能會影響PCR 的產率)，可以將算出 溫度較低的那段引子的3’或5’端加幾個鹼基。
PCR溫度循環設定
Tm(℃) = 2(A+T) + 4(G+C) Tm Calculator : https://tmcalculator.neb.com/ 34引子(primer)設計的注意事項：
1.
引子長度通常為
18-25個
鹼基長。
2.
GC含量約佔
40-60%
。
3.
最好3’-端的鹼基為G/C。
4.
避免引子本身形成
二級結構
。
5.
同一反應中的引子序列不可互補，以免造成自相黏合
形成
primer dimer
的情況
6.
避免引子
所要黏合的目標
形成二級結構
7. 前置引子
與反
置引子
之
黏合溫度盡量不要相差5℃以上。
8.
3'端
尤其重要，必須不含有與其他引子互補的序列，並
且要與模板
完全互補
，絕對不可以有mismatch。
35 Design the primer pairs, 15-merfor each, to amplify the gene
sequence below with PCR? It needs to indicate the 5’- and 3’-end of each primer. 5’-GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT… …TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3’ 5’-GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT… …TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3’ 3’-CGCAACTGCCATAGTTTTGCAATA… …AAATGGACCACCCGACAAGATTAG-5’ 5’-GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT… …TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3’ 3’-CGCAACTGCCATAGTTTTGCAATA… …AAATGGACCACCCGACAAGATTAG-5’ 5’-GCGTTGACGGTATCA…… ……ACCCGACAAGATTAG-5’ Ans: 36
DNA polymerases的選擇
Thermostable polymerase 種類繁多，一般常使用Taq polymerase， 但有時針對所合成fragment 的長度及正確性，可考慮其他酵素。
反(逆)轉錄PCR
(
Reverse Transcription PCR; RT-PCR)
過程:反轉錄酶以RNA為模板 (template)合成互補DNA (complementary DNA; cDNA)，接下來再利用PCR 的原理來大量擴增這段cDNA。 RT-PCR是目前在體外 (in vitro)觀察基因表現最敏感的 方法之一，可以檢測很低拷 貝數的RNA。 RT-PCR廣泛應用於遺傳病的 診斷以及檢測RNA含量的定 量分析。 38反轉錄PCR合成第一股cDNA使用的引子種類
Real-time PCR又稱定量即時聚合酶連鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱 qRT-PCR或q-PCR)，是一種在DNA 擴增反應中，以螢光染劑偵測每次PCR循環後產物總量的方法。 一般的PCR進行後，反應多已達到飽和，測得的產物為end-point的PCR 產物，若要以傳統的PCR做定量分析，則要對同一樣品同時做不同循環 的PCR反應，再將產物以電泳分離，費時費工且容易污染。 即時PCR的基本原理有兩個要點： 1. 對PCR反應中的每一個循環的產物能進行即時偵測並記錄下來。 2. 用於即時偵測PCR產物的螢光染料，標記在一段可以與目標序列進行特異性 結合的探針上，並且處於淬滅狀態，只有當探針與模板特異性結合以後才有 可能釋放出螢光信號。 即時PCR常用螢光探針有三種： DNA結合染劑(SYBR Green I) 雜交探針(hybridization probe)
水解探針(hydrolysis probe，又稱TaqMan probe)
即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR；即時PCR)
40 SYBR Green I 雜交探針(hybridization probe)
水解探針(hydrolysis probe) (又稱TaqMan probe） 即時PCR 每一輪循環中PCR的產出量都以 螢光信號被記錄在PCR儀器的光 學檢測系統，在某一循環中螢光 信號的強度達到預先設定的閾值 (Threshold)時，對應此時的循環 數稱為Ct 值(Threshold Cycle)。 目標DNA起始濃度與其Ct值成反 比，目標DNA的起始濃度越高， 其螢光值越早達到偵測之閾值， 其Ct值越小；反之目標DNA起始 濃度越低，其Ct值則越大。 根據序列稀釋標準樣品的Ct值及 其已知起始濃度，即得一標準曲 線(standard curve)，根據此標 準曲線．可以由樣品的Ct值推算 其起始濃度，達到定量之目的。 Ct Overview of qPCR (2:44)：https://www.youtube.com/watch?v=1kvy17ugI4w
43 99學年度大學入學考試指定科目【生物科】非選擇題 1. 遺傳工程技術利用酵素以切割DNA。請問這種酵素是(a)來自哪一類 生物? (1分) (b)其名稱為何? (1分) 2. 利用PCR技術來擴增目標基因時，請問(a)所使用的酵素名稱為何? (1分) (b)在對溫度的敏感性質上，此酵素有何特性? (1分) 3. 能用來接合目標基因的構造稱為載體，請寫出兩種載體的名稱。(2分) 4. 在建構重組DNA過程中，請問(a)能接合目標基因和載體的酵素名稱 為何? (1分) (b)哪一類原核生物常被用來複製重組DNA? (1分) 解答: 1. (a) ; (b) 2. (a) ; (b) 3. ; 4. (a) ; (b) 利用遺傳工程技術，可將不同來源的DNA組合起來，建構出重組DNA。 試回答下列問題。
DNA定序(DNA sequencing)
2’,3’-dideoxy analogStrategy of the chain-termination method for sequencing DNA
Nobel prize in Chemistry (1980)
在1977年，有兩種DNA定序方法首先被發表出來。
1. 哈佛大學A. Maxam與W. Gilbert發現一種可以選擇性分解鹼基的化學定序法。 2. 由F. Sanger發展出來的雙去氧核苷酸定序法，利用雙去氧核苷酸在特定位置上
造成DNA鏈合成的終止，進而推導出DNA序列。
這兩個方法，DNA都經過標記且利用凝膠電泳分離DNA片段，目前大多 數的實驗室都使用Sanger的定序方法。
45 5’ 3’ Template sequence 3’-TACTATGCCAGA-5’ deduce
Sanger method DNA定序影片(3:00)：https://www.youtube.com/watch?v=vK-HlMaitnE
46 現在DNA定序都已自動化了，自動定序的原理是改良了Sanger定序的方法，將4種 ddNTP標定上不同的螢光。如下圖所示：
49
Base specificity Chemical used for base alteration
Chemical used for altered base
removal Chemical used for strand cleavage G Dimethyl sulphate (硫酸二甲酯) Piperidine (哌啶；六氫吡啶) Piperidine
A+G Acid Acid Piperidine
C+T Hydrazine (聯氨) Piperidine Piperidine
C Hydrazine + Alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali(鹼) Piperidine Piperidine
Chemicals used for
Maxam-Gilbert sequencing method
50
Sanger方法的特點為解讀序列能力較強，每次反應約可得
到1,000個核苷酸序列，因此可提供較多的DNA訊息。但其
缺點為
操作較複雜
，不易於一定時間內分析大量檢體。
對DNA序列分析的要求通常是解讀的序列越長越好，但在
許多分子診斷工作中，時常需要在
短時間內偵測很多DNA
檢體
，而且只需短短的幾十個核苷酸序列的資訊
，就可以
提供正確診斷。
例如：在臨床分子診斷領域中，對細菌和其他
病原微生物
的分子診斷，或在偵測
單一核苷酸多型性(single nucleotide
polymorphism; SNP)
時，只需對最具代表性的十幾到幾十
個核苷酸片段進行序列分析即可。
在這種情況下，Sanger方法未必是最合適的DNA序列分析
技術。最新發展的焦磷酸定序(pyrosequencing)技術，則是
目前最適合這些目的之DNA序列分析技術。
焦磷酸定序(pyrosequencing)技術
51
Pyrosequencing 技 術 是 DNA 序 列 的
次 世 代 定 序 技 術 (next
generation sequencing technology)
，是針對短到中等長度的
DNA序列樣品進行高通量、高精確度(99%精確)和再現性佳
的分析技術。
其原理不同於傳統Sanger方法，係利用幾種生化反應之組合
來測定在DNA合成時，過程中會產生的焦磷酸基團(PPi)之特
性，進而將PPi轉換成
ATP
，ATP再促使
螢光酶(luciferase)
放
出
生物冷光(bioluminescence)。放出的冷光強度經冷光儀
(luminometer)偵測後，轉讀出DNA序列。
該技術特點包括：對DNA的序列分析
無須進行電泳
、DNA片
段
無須螢光標記
(因此無須螢光分子的激發和檢測裝置)、可
在96孔盤上進行反應，因此
能同時進行
多檢體
的序列分析
。
但也因反應特性的限制，精準讀序目前只在20~30個核苷酸
序列左右。有研究者經過改良，可使該技術的讀序長度增加
一倍以上。
52Pyrosequencing技術的基本步驟及原理如下︰
1. 一個特異性的定序引子和單鏈DNA模板結合，然後加入
酶混合物
(包括
DNA polymerase、ATP sulfurylase、Luciferase及Apyrase
)
和
受 質 混 合 物
( 包 括
Adenosine-5’-phosphosulfate (APS)
和
Luciferin)。
2. 在反應中加入
一種dNTP
，若它正好能和DNA模板的下一個鹼基
配對，則會在DNA 聚合酶的作用下，添加到引子的3’端，同時釋
放出
一個分子的焦磷酸(PPi)
。
3. 在
ATP硫酸化酶
的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP；
在
冷光酶
的催化下，生成的ATP又可以和冷光素結合形成
氧化冷
光素
，同時產生可見光。通過CCD光學系統即可獲得一個特異的
檢測峰，峰值的高低則和相匹配的
鹼基數成正比
。
4. 反應體系中剩餘的dNTP和殘留的少量ATP在
Apyrase (腺苷三磷
酸雙磷酸酶)
的作用下發生降解。
5. 加入
另一種dNTP
，重覆進行第2~4步驟反應，根據獲得的峰值圖
即可讀取準確的DNA序列訊息。
Phosphodiester bondformation and release of
pyrophosphateduring the incorporation of a nucleotide at the end of a growing DNA strand.
Pyrosequencing enzyme reactions
Apyrase is an ATP diphosphohydrolase. It catalyses the removal of the gamma phosphate
from ATPand the beta phosphatefrom ADP. The phosphate from AMPis not removed.
54 焦磷酸定序動畫(1:52):http://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA
基因定點突變(site-directed mutagenesis)技術
定點突變是加拿大科學家Michael Smith發明，他與PCR發明者Kary Mullis 在1993年共同獲得諾貝爾 化學獎。 基因突變可經由自發性或經誘導 產生。在定點突變法之前，突變 株的產生必須經由自然界或用化 學等方法讓基因突變，這屬於隨 機突變。而突變株必須在生物體 上產生改變，才能確定有突變發 生。突變位置必須利用分生或化 學方法來確定。 定點突變是經由設計好的寡核苷 酸，在任何一個基因片段上進行 隨意或設計好的突變，意即此突 變是預先設定好的，所以也有人 將它稱為“反向遺傳法”。 target gene (DNA polymerase) (M13正股) 酪胺酸(Tyrosine) 苯丙胺酸 (Phenylalanine)57
DNA交互配對(雜交)反應(DNA hybridization)
利用螢光標定之DNA 探針， 藉由hybridization的過程， 在染色體上將基因或DNA 定位。 螢光原位雜交法南方墨點法(Southern blot)
由英國科學家Edwin Southern 發明，因此命名為Southern blot，用以偵測經由膠體電泳分 離的樣品中，含有特定序列的 DNA片段。 類似的技術也被用來偵測經由 膠體電泳分離的樣品中，含有 特定序列的RNA片段，稱為北 方墨點法(Northern blot)。用以 偵測蛋白質的方法稱為西方墨 點法(Western blot)。 Southern blot 動畫: (1:17) https://www.youtube.com/watch?v=TOKhHy7rU18 Northern blot 動畫: (1:35) http://www.youtube.com/watch?v=KfHZFyADnNg&fea ture=related西方墨點法(Western blot)
Western blot , Southern blot , Northern blot , South western Blot 影片(2:18)： https://www.youtube.com/watch?v=Pt_NaNExry8
