植物生長調節劑與兩階段培養對薑組織培養苗增殖與生長之影響
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(2) 402. 台灣農業研究 第 67 卷 第 4 期. 氧化及抗癌等作用 (Mishra et al. 2012; Singh et al. 2014; Zadeh & Kor 2014; Agrahari et al. 2015)。 近 年 來， 產 薑 量 最 大 的 國 家 為 印 度， 其 次 為 中 國 (Food and Agriculture Organization of the United Nations 2017)。 薑 在 台 灣 約 有 1,000 ha 的栽培面積，年產量約 3 萬公噸，主 要 產 區 在 南 投、 台 東、 宜 蘭 及 苗 栗； 栽 培 品 種多為俗稱大指薑之「廣東薑」(又名南洋薑， Zingiber officinale ‘Guang Dong’)， 其 次 為 俗 稱小指薑的「竹薑」(又名本島薑，Z. officinale ‘Chu’)；依據薑不同生育階段採收之產品可分 為嫩薑、粉薑、老薑 (或稱薑母) 及種薑 (Tsai et al. 2013; Chen et al. 2014; Council of Agriculture, Executive Yuan 2017a, 2017b; Hsieh et al. 2017)。 薑 栽 培 以 無 性 繁 殖 根 莖 種 苗 為 主， 除 了 可 供 選 擇 之 品 種 極 少 外， 且 種 薑 品 質難以維持，主因是受到軟腐病 (soft rot, 病 原為 Pythium myriotylum) 與青枯病 (bacterial wilt, 病 原 為 Ralstonia solanacearum) 造 成 之 根莖腐爛，此兩病原均可藉由種薑或田間留存 傳 播， 因 此 連 作 薑 田 病 害 發 生 機 率 最 高， 嚴 重影響產量與品質；次為根瘤線蟲 (root-knot nematode, Meloidogyne incogntia) 的危害，傳 播途徑也是藉由種薑或土壤中蟲卵擴散，蟲體 入侵根莖後所造成的傷口更有利其他病菌侵入 (Han 2000; Kambaska & Santilata 2009; Kavyashree 2009; Abbas et al. 2011; Sathyagowri & Seran 2011; Tsai et al. 2013)。 此 外， 由 於 種薑儲存不易，因此栽種適期常面臨薑苗缺乏 之困境。為解決上述問題，優質種薑量產技術 之建立實屬必要。 組織培養技術常用於作物種苗繁殖，具有 繁 殖 倍 率 大、 繁 殖 週 期 短、 可 週 年 生 產 等 優 點， 是 快 速 量 產 品 質 均 一 種 苗 的 有 效 方 法。 目 前 薑 產 業 均 利 用 塊 狀 根 莖 種 植 栽 培， 此 種 無 性 種 苗 之 繁 殖 效 率 偏 低， 且 易 成 為 病 害 擴 散 之 感 染 源， 採 用 組 織 培 養 技 術 建 立 薑 種 苗 繁 殖 體 系 不 僅 可 排 除 田 間 病 原 汙 染， 更 具 有 繁 殖 率 高 之 優 點， 是 目 前 無 性 繁 殖 根 莖 種 薑 所不能及 (Huang et al. 2004; Luo et al. 2006; Lincy & Sasikumar 2010; Seran 2013; David. et al. 2016; Li 2016)。薑之微體繁殖多利用生 長點 (Han 2000; Huang et al. 2004) 或根莖芽 體 (rhizome bud) (Kavyashree 2009; Abbas et al. 2011; Ayenew et al. 2012)，培養於含有苯 甲 基 腺 嘌 呤 (6-benzylaminopurine; BA) 與 奈 乙酸 (α-naphthalene acetic acid; NAA) 組合之 培 養 基 中 以 建 立 其 組 織 培 養 繁 殖 體 系， 惟 芽 體 繁 殖 倍 率 僅 在 2−5 之 間。 針 對 薑 之 組 織 培 養 程 序 而 言， 則 各 研 究 報 告 存 有 差 異， 部 分 學者指出其繁殖體系須經芽體伸長與發根階 段 (Han 2000; Huang et al. 2004; Kambaska & Santilata 2009; Abbas et al. 2011; Sathyagowri & Seran 2011; Ayenew et al. 2012)，而有些報 告則指出可同時進行芽體誘導、伸長及發根而 成 苗 (Kavyashree 2009)。 此 外， 液 態 培 養 可 促進組培芽體增殖率，而後將叢生芽體培養於 固 態 培 養 基 中， 即 可 形 成 發 根 良 好 的 組 培 苗 (Lincy & Sasikumar 2010)。 本研究擬以薑根莖芽體建立微體繁殖，利 用液態培養促進芽體增殖率，再將叢生芽體轉 移至固態培養基之液-固態兩階段培養方式， 生產不帶真菌或細菌病原之優質種苗作為生產 種薑之用，提供農民更多元之選擇。. 材料與方法 植物材料來源與消毒條件 本研究利用「廣東薑」與「竹薑」根莖芽體 作 為 建 立 組 織 培 養 之 材 料。 取 自 田 間 之 根 莖 以 清 潔 劑 清 洗 去 除 表 面 殘 土 後， 置 於 室 溫 約 26℃環 境 下 誘 導 芽 體 萌 發。 切 取 長 約 1–2 cm 之「廣 東 薑」 與「竹 薑」 根 莖 新 生 芽 體， 剝 去 2–3 層 鞘 葉 後 作 為 培 植 體。 先 以 75% 酒 精 溶 液 (ethanol) 浸泡手搖 30 s，而後浸入 0.6% 次 氯酸鈉 (NaOCl, The Clorox Co., CA. USA) 溶 液，置於水平迴轉振盪器 (orbital shaker, SK302AB, SanKuan Co., Taichung, Taiwan)， 利 用 80 rpm 速度振搖 15 min 進行消毒。取出後 以無菌水沖洗 3 次，而後接種於含有 0.4 mg L -1 BA (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) 之 B5 (Gamborg et al. 1968) 固態培養基，用 以建立薑之組織培養瓶苗。.
(3) 403. 薑組織培養大量繁殖. 培養基配製與試驗培養條件 培 植 體 係 培 養 於 含 有 3% 蔗 糖、0–4 mg L -1 BA 配 合 0.1 mg L -1 NAA (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) 之 B5 固 態 或 液 態 培養基；固態培養基於加入 9 g L -1 洋菜 (Difco Bacto-agar, Carolina Co., Burlington, VT, USA) 前， 先 以 0.1–1 N NaOH 或 HCl 將 pH 值調為 5.7 ± 0.1，液態培養基則未添加洋菜， 且 pH 值調為 5.2 ± 0.1。培養基以 121℃、1.05 kg cm -2 滅菌 20 min 後，冷卻備用。 固態與液態培養均是將培植體接種於內含 20 mL 培 養 基 之 125-mL 三 角 瓶 (Erlenmeyer flask)；固態培養置於 26℃ ± 2℃、光照 14 h、 光強度 38 μmol m -2 s -1 的環境；液態培養除使 用 10 μmol m -2 s -1 低光照外，其餘環境條件與 固態培養相同，並置於水平迴轉式振盪器，以 80 rpm 速 度 進 行 振 盪 培 養。 試 驗 採 3 重 複， 每瓶接種 3 個培植體，共接種 9 個培植體。. BA 濃度於固態或液態培養對薑組培苗增 殖與生長之影響 將「廣東薑」與「竹薑」組培苗之假莖與根 部切除後，取直徑約 5 mm 根莖作為培植體，培 養 於 含 不 同 BA 濃 度 (0、0.5、1、2、4 mg L-1) 與 0.1 mg L-1 NAA 之 B5 固態或液態培養基。培 養 8 wk 後，調查每個培植體誘導形成瓶苗數與 芽數；調查時依瓶苗或芽體之生長形態分別記錄 葉片展開苗 (plantlet with unfolded leaves; PL Fig. 3)、葉片未開之綠色芽 (green shoot-bud; GS) 於 結果及淡黃色芽 (yellowish shoot-bud; YS) 標註 的數量，三者總和為總芽數；瓶苗數或芽數除 以總芽數，則表示不同形態芽苗的占比。苗高 僅調查葉片展開苗，自假莖基部至頂葉之葉身 基部的高度。. 液-固態兩階段培養對薑組織培養苗增殖 與生長之影響 利用源自上述不同 BA 濃度液態培養所得 之叢生芽苗團塊作為培植體，不經分割而直接 繼代培養於內含 100 mL 固態培養基之 500-mL 蘭花瓶 (Orchid Flask, Taiwan Glass Ind. Corp., Taipei, Taiwan) 中。 培 養 基 為 含 有 0.5 mg L -1. BA 與 0.1 mg L -1 NAA 之 B5 固 態 培 養 基， 培 養 8 wk 後，調查每個培植體形成之瓶苗數與 高度；以具有葉片展開苗之培植體數除以總培 植體數代表其成苗率。. 試驗設計和統計分析 本 研 究 採 用 完 全 逢 機 設 計 (completely randomized design; CRD) 進 行 試 驗。 試 驗 所 得 數 據 若 為 比 例 資 料， 須 先 經 角 度 轉 換 後 再 進行分析。經 SAS Enterprise Guide 7.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 套 裝 統 計 分 析 軟體進行變方分析 (analysis of variance; ANOVA)，若處理間差異顯著 (P < 0.05)，則以最 小顯著差異性測驗 (least significant difference test; LSD) 比較各處理平均值間之差異。. 結果 薑組織培養無菌培植體之建立 本研究切取長約 1–2 cm「廣東薑」新生根 莖 芽 體 (圖 1A、1B) 為 材 料， 剝 除 2–3 層 鞘 葉後，以 75% 酒精與 0.6% 次氯酸鈉溶液進行 兩階段消毒處理。之後接種於含有 0.4 mg L -1 BA 之 B5 培 養 基，4 wk 後 即 可 萌 發 成 苗 (圖 1C)。而後將小苗接種於相同組成之新鮮培養 基，經 8 wk 培養後可建立薑的無菌組培苗 (圖 1D)；「竹薑」之無菌組培苗，亦以上述方法建 立 (資料未列)。. 固態培養下 BA 濃度對薑組培苗增殖與 生長之影響 將直徑約 5 mm 之「廣東薑」與「竹薑」組 培根莖，培養於含有 0.5–2.0 mg L -1 BA 與 0.1 mg L -1 NAA 之 B5 固態培養基培養 8 wk 後， 兩品種在此條件下表現相類似，每個培植體平 均可誘得 4.8–6.0 株組培苗，苗高約為 1.3–2.6 cm (表 1)。提高 BA 濃度至 4 mg L -1 雖可增加 苗數，兩品種分別獲得 7.2 與 7.7 株組培苗， 但 其 苗 高 卻 明 顯 降 低， 分 別 僅 約 1.3 與 1.8 cm。反之，對照組之苗高雖然較高，分別達 2.2 與 3.2 cm， 其 苗 數 與 0.5–1.0 mg L -1 BA 處 理 組之結果相近，但明顯較 2–4 mg L -1 BA 處理.
(4) 404. 台灣農業研究 第 67 卷 第 4 期. (A). (B). 廣東薑. (C). (D). 圖 1. 建立「廣東薑」組織培養初代培養。新生根莖芽體萌發於採自田間之根莖 (A, Bar = 5 cm; B, Bar = 2 cm)；根莖芽體培養於含有 0.4 mg L-1 BA 之 B5 固態培養基 4 wk 後，芽體生長之情形 (C, Bar = 1 cm)；將此 無菌芽體繼代培養於相同組成之固態培養基達 8 wk 後，組培苗增殖與生長之情形 (D, Bar = 1 cm)。 Fig. 1. Establishment of in vitro culture of Zingiber officinale ‘Guang Dong’. New rhizome bud germinated on rhizome derived from field (A, Bar = 5 cm; B, Bar = 2 cm), in vitro shoot grew while rhizome bud cultured on B5 medium supplemented with 0.4 mg L-1 6-benzylaminopurine (BA) for 4 wk (C, Bar = 1 cm), and multiple shoots were induced after in vitro shoot cultured on the same fresh medium for another 8 wk of culture (D, Bar = 1 cm).. 組少，每個培植體僅獲得約 4.4 與 4.1 株組培 苗 (表 1)。此外，對照組與各 BA 濃度處理之 瓶苗均可發根良好 (圖 2)。 就組培苗高度而言，「廣東薑」除 8.1% 對 照 組 組 培 苗 高 於 4 cm 外， 於 0.5–2.0 mg L -1 BA 處理條件下之苗高占比均類似，苗高小於 2 cm 的比率約為 32.6–43.5%，而苗高介於 2–4 cm 者 約 為 56.5–67.4%；4 mg L -1 BA 處 理 之 組培苗以低於 2 cm 的比率最高，達 71.2% (表 1)。「竹薑」結果顯示，BA 處理組之組培苗大 多介於 2–4 cm，比率約為 67.9–80.1%；對照 組之組培苗則以大於 4 cm 苗高比率最高，達 50.0% (表 1)。. 液態培養下 BA 濃度對薑組培苗增殖與 生長之影響 將 直 徑 約 5 mm「廣 東 薑」 與「竹 薑」 組 培 根莖培養於含 0.0–4.0 mg L -1 BA 與 0.1 mg L -1 NAA 之 B5 液態培養基中，經培養 8 wk 後所 得瓶苗或芽體呈現 3 種形態，分別為葉片展開 苗 (PL, 圖 3A2)、葉片未開之綠色芽 (GS, 圖 3B3) 及 淡 黃 色 芽 (YS, 圖 3A4)， 其 中 若 綠 色 芽與淡黃色芽高度小於 1 cm 則不予記錄。「廣 東薑」與「竹薑」每個培植體分別獲得 7.6–7.8 芽與 7.1–7.3 芽，苗高僅 1.2–1.3 cm (表 2、圖 3)。將 BA 濃度提高至 4 mg L -1 時，則「廣東薑」 所得均為葉片未展開之綠色芽與淡黃色芽。兩.
(5) 405. 薑組織培養大量繁殖. 表 1. BA 濃度於固態培養下對「廣東薑」與「竹薑」組培苗增殖與生長之影響。 Table 1. Effect of BA in the solid medium on plantlet proliferation and growth of in vitro Zingiber officinale ‘Guang Dong’ and ‘Chu’z. Plant growth regulator BA (mg L-1) ‘Guang Dong’. Percent of plantlet height (%) No. of plantlets. Plantlet height (cm). < 2 cm. 2‒4 cm. > 4 cm. 0.0. 4.4 ± 0.4 cy. 2.2 ± 0.1 a. 34.2 ± 11.2 b. 57.6 ± 17.5 a. 8.1 ± 2.1 a. 0.5. 5.6 ± 0.7 bc. 1.8 ± 0.2 b. 32.6 ± 12.6 b. 67.4 ± 12.6 a. 0.0 b. 1.0. 5.4 ± 1.1 bc. 1.8 ± 0.2 b. 43.5 ± 18.8 b. 56.5 ± 18.8 a. 0.0 b. 2.0. 6.0 ± 0.5 ab. 1.8 ± 0.1 b. 33.8 ± 11.7 b. 66.2 ± 11.7 a. 0.0 b. 4.0. 7.2 ± 0.5 a. 1.3 ± 0.2 c. 71.2 ± 10.6 a. 28.8 ± 10.6 b. 0.0 b. 0.0. 4.1 ± 0.4 c. 3.2 ± 0.3 a. 19.6 ± 8.2 ab. 30.4 ± 9.3 b. 50.0 ± 1.1 a. 0.5. 4.8 ± 0.4 bc. 2.6 ± 0.3 b. 13.3 ± 3.1 b. 80.1 ± 6.8 a. 6.7 ± 1.7 b. 1.0. 4.9 ± 0.2 bc. 2.2 ± 0.2 bc. 22.8 ± 5.0 ab. 77.2 ± 6.4 a. 0.0 c. 2.0. 6.0 ± 0.6 b. 2.1 ± 0.1 cd. 27.0 ± 8.4 ab. 73.0 ± 8.4 a. 0.0 c. 4.0. 7.7 ± 1.8 a. 1.8 ± 0.1 d. 32.1 ± 8.1 a. 67.9 ± 8.1 a. ‘Chu’. z. y. 0.0 c -1. Explants were cultured on B5 medium containing various concentrations of 6-benzylaminopurine (BA) and 0.1 mg L α-naphthaleneaceticacid (NAA) for 8 wk. Nine explants were used in each treatment. For each variety, means in the same column followed by different letters are significantly different at the 5% level by least significant difference (LSD) test.. 品種在葉片展開苗數與綠色芽數上皆隨著 BA 濃 度 提 高 而 減 少， 但 是 淡 黃 色 芽 數 則 隨 之 增 加；BA 濃度對於芽體型態之影響以「廣東薑」 較「竹薑」明顯，前者在 BA ≥ 1 mg L -1 處理下， 淡黃色芽之比率皆超過 80% (表 2)。. 液-固態兩階段培養對薑組培苗增殖與生 長之影響 將上述「廣東薑」與「竹薑」於液態培養所 得含葉片展開苗、綠色芽或淡黃色芽之叢生芽 苗團塊，不經分割直接繼代培養於含 0.5 mg L-1 BA 與 0.1 mg L -1 NAA 之 B5 固態培養基 8 wk 後，多數芽體均可發育成為葉片展開苗 (圖 4)； 成苗率則以「竹薑」較「廣東薑」高，前者在對 照 組 與 處 理 組 均 可 達 100.0%， 而 後 者 以 4.0 mg L -1 BA 處理僅 55.6% 為最低，其餘 BA 處 理組與對照組之成苗率則介於 66.7–88.9% 之 間 (表 3)。表 3 結果顯示，源自 0.5–2.0 mg L -1 BA 處 理 之「廣 東 薑」 可 得 11.2–13.0 苗， 與 對 照 組 所 得 10.2 苗 之 間 無 顯 著 差 異， 苗 高 約 為 2.8–3.1 cm， 較 對 照 組 之 4.1 cm 低， 而 源. 自 4.0 mg L -1 BA 處 理 之 苗 數 明 顯 低 於 其 他 BA 處 理 組。「竹 薑」 結 果 顯 示， 源 自 0.0–4.0 mg L -1 BA 處理之苗數間並無顯著差異，約在 11.2–14.9 苗之間，而源自 4.0 mg L -1 BA 處理 之苗高雖顯著低於其他 BA 處理組，但仍可達 約 4.2 cm (表 3)。. 討論 薑組織培養所用之材料為根莖，因其位於 地 下 而 易 附 著 塵 土， 並 含 有 較 多 的 細 菌 與 真 菌，導致初代培養的消毒成功率不佳。酒精、 次氯酸鈉及氯化汞 (mercuric chloride; HgCl 2) 是較常用的消毒藥劑，部分學者也利用殺菌劑 (fungicide) 或 抗 生 素 (antibiotic) 克 服 真 菌 或 細菌汙染，但須搭配多種藥劑方能達成消毒效 果 (Deng & Pan 2009; Kambaska & Santilata 2009; Kavyashree 2009; Abbas et al. 2011; Sathyagowri & Seran 2011; Seran 2013; David et al. 2016; Li 2016)。對於初代培養之效率而 言，除上述消毒藥劑外，薑培植體大小亦為影 響無菌培養成功與否的因子之一。雖然使用較.
(6) 406. 台灣農業研究 第 67 卷 第 4 期. (A1). (A2). (A3). (A4). (A5). (B1). (B2). (B3). (B4). (B5). 圖 2. BA 濃度於固態培養下對「廣東薑」與「竹薑」組培苗增殖與生長之情形。「廣東薑」(A) 與「竹薑」(B) 之組培根莖分別培養於含有 0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg L-1 BA (依序為 A 與 B 圖中之 1、2、3、4、5) 配合 0.1 mg L-1 α-naphthalene acetic acid (NAA) 之 B5 固態培養基 8 wk 後之瓶苗；Bar = 2 cm。 Fig. 2. Effect of 6-benzylaminopurine (BA) concentration in the solid medium on plantlet proliferation and growth of in vitro Zingiber officinale ‘Guang Dong’ (A) and ‘Chu’ (B). Explants cultured on B5 solid medium supplemented with 0.0, 0.5, 1.0, 2.0, and 4.0 mg L-1 BA (1, 2, 3, 4, and 5 in A and B, respectively) and 0.1 mg L-1 α-naphthaleneacetic acid (NAA) for 8 wk of culture. Bar = 2 cm.. 大 培 植 體 具 有 較 佳 之 芽 體 誘 導 效 果， 但 同 時 伴隨著污染率提高的問題 (Seran 2013)；一般 而言，薑多以 5–10 mm 根莖芽體作為培植體 (Kavyashree 2009; Seran 2013)； 而 利 用 較 小 培植體 (0.3–0.5 mm)，則有避免病毒污染的優 點 (Han 2000)。本研究以取自田間之「廣東薑」 (圖 1) 與「竹 薑」 根 莖 經 清 潔 後， 誘 導 萌 發 新 生根莖芽體為培植體，以酒精與次氯酸鈉溶液 進行兩段式消毒的成功率約 70% (資料未列)， 顯示在清潔環境下萌發之新生芽體不僅再生能 力佳，且能提高後續之消毒成功率。 培養基中所含之植物生長調節劑對芽體的 誘 導 與 生 長 有 直 接 影 響， 是 影 響 薑 組 培 苗 繁 殖效率的重要因子 (Seran 2013)。薑之莖頂與. 根莖芽體於不含 BA 之培養基時，並無法誘得 芽體，但是在添加 BA 後即可促使芽體萌發， 顯示 BA 為芽體誘導之必要條件 (Deng & Pan 2009; Kambaska & Santilata 2009; Kavyashree 2009)。Han (2000) 利用 0.3–0.5 mm「廣東薑」 莖 頂， 培 養 於 含 有 2 mg L -1 BA 與 0.1 mg L -1 NAA 之 B5 培 養 基 90 d (約 3 mo) 後， 每 個 莖 頂 可 得 約 5.5 個 芽 體。Huang et al. (2004) 將 0.4–0.5 mm「竹 薑」 生 長 點， 培 養 於 含 有 2 mg L -1 BA 與 1 mg L -1 NAA 之 MS (Murashige & Skoog 1962) 培 養 基， 增 殖 倍 率 為 每 月 3.5 芽。Ayenew et al. (2012) 以 15 mm 衣索比亞 薑 (Ethiopian) 根莖芽體，培養於含有 2 mg L -1 BA 與 1 mg L -1 kinetin 之 MS 培養基 6 wk 後，.
(7) 407. 薑組織培養大量繁殖. (A1). (A2). (A3). (A4). (A5). (B1). (B2). (B3). (B4). (B5). 圖 3. BA 濃度於液態培養下對「廣東薑」與「竹薑」組培苗增殖與生長之情形。「廣東薑」(A) 與「竹薑」(B) 之組培根莖分別培養於含有 0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg L-1 BA (依序為 A 與 B 圖中之 1、2、3、4、5) 配合 0.1 mg L-1 α-naphthalene acetic acid (NAA) 之 B5 液態培養基 8 wk 後所形成之葉片展開苗 (PL, A2)，以及葉片未開 之綠色芽 (GS, B3) 與淡黃色芽 (YS, A4)；Bar = 2 cm。 Fig. 3. Effect of 6-benzylaminopurine (BA) concentration in the liquid medium on plantlet proliferation and growth of in vitro Zingiber officinale ‘Guang Dong’ (A) and ‘Chu’ (B). Plantlets with unfolded leaves (PL, A2), green shootbud (GS, B3), and yellowish shoot-bud (YS, A4) were obtained from the in vitro rhizome explant cultured on B5 liquid medium supplemented with 0.0, 0.5, 1.0, 2.0, and 4.0 mg L-1 BA (1, 2, 3, 4, and 5 in A and B, respectively) and 0.1 mg L-1 α-naphthaleneacetic acid (NAA) for 8 wk. Bar = 2 cm.. 可形成約 7 株組培苗，且參試兩品種 (‘Yali’ 與 ‘Boziab’) 有相類似的結果。埃及薑 (Egypt) 根 莖芽體培養於含有 4.5 mg L -1 BA 之 MS 培養 基 12 wk 後 (4 wk time -1, 3 times)，可形成約 8 株 組 培 苗 (Abbas et al. 2011)。Kavyashree (2009) 利 用 5–10 mm 印 度 薑 (‘Varada’) 根 莖 芽體，培養於含有 17.76 μM (約 4 mg L -1) BA 之 LS (Linsmaier & Skoog 1965) 培養基 4 wk 後，芽體增殖率達 4 倍。綜合上述研究結果顯 示，生長點或根莖芽體培養於 2–4 mg L -1 BA 處理下，每 4 wk 之芽體增殖率分別為 1.8–3.5 芽與 2.7–4.7 芽，似乎培植體種類與大小對芽 體增殖率並無明顯影響。Han (2000) 與 Huang. et al. (2004) 分別以「廣東薑」或「竹薑」莖頂 進行培養，每月芽體增殖率分別達 1.8 芽與 3.5 芽。本研究以「廣東薑」根莖芽體培養結果顯 示， 根 莖 芽 體 於 含 有 0.4 mg L -1 BA 之 B5 固 態培養基 4 wk 後即可誘使生長。而後將此芽 體繼代培養於相同組成之新鮮培養基 8 wk 後， 僅 獲 得 約 3–4 芽， 亦 即 每 4 wk 之 增 殖 率 僅 1.0–1.1 芽 (資料未列，參考圖 1)，推測 BA 濃 度對於薑芽體增殖率之高低具有明顯影響。此 外，由於考量「廣東薑」與「竹薑」根莖芽體初 代培養之高汙染率問題，因此先以較低 BA 濃 度誘使根莖芽體生長後，再以較高 BA 濃度進 行芽體增殖的培養策略。.
(8) 408. 台灣農業研究 第 67 卷 第 4 期. 表 2. BA 濃度於液態培養下對「廣東薑」與「竹薑」組培苗增殖與生長之影響。 Table 2. Effect of BA in the liquid medium on plantlet proliferation and growth of in vitro Zingiber officinale ‘Guang Dong’ and ‘Chu’z. Percent of shoot-bud (%) BA (mg L-1). No. of plantlets Plantlet height (cm) Plantlet with unfolded leaves (%) Green shoot-bud. Yellowish shoot-bud. ‘Guang Dong’ 0.0. 6.1 ± 0.2 by. 1.4 ± 0.1 a. 29.0 ± 11.3 a. 32.8 ± 10.1 a. 38.1 ± 4.4 c. 0.5. 7.8 ± 0.2 a. 1.3 ± 0.2 a. 25.4 ± 18.8 a. 22.9 ± 6.8 a. 51.7 ± 20.6 c. 1.0. 7.6 ± 0.5 a. 1.3 ± 0.3 a. 6.2 ± 4.7 ab. 13.6 ± 9.8 a. 80.3 ± 17.1 bc. 2.0. 7.6 ± 0.4 a. 1.2 ± 0.0 a. 5.9 ± 2.1 bc. 7.4 ± 9.5 a. 86.6 ± 12.2 ab. x. 6.3 ± 0.9 b. -. 0.0 ± 9.5 c. 4.9 ± 4.6 a. 95.1 ± 4.6 a. 0.0. 6.7 ± 1.0 a. 1.6 ± 0.4 a. 54.2 ± 7.7 a. 23.7 ± 11.7 a. 22.1 ± 4.3 c. 0.5. 7.1 ± 0.2 a. 1.3 ± 0.1 a. 48.8 ± 18.8 a. 29.7 ± 1.9 a. 21.6 ± 16.9 c. 1.0. 7.2 ± 0.6 a. 1.3 ± 0.2 a. 43.9 ± 4.7 ab. 22.9 ± 6.5 a. 33.2 ± 11.3 bc. 2.0. 7.3 ± 0.6 a. 1.2 ± 0.1 a. 27.4 ± 2.1 bc. 24.7 ± 9.1 a. 47.9 ± 8.0 ab. 4.0. 7.8 ± 1.3 a. 1.3 ± 0.3 a. 9.9 ± 9.5 c. 24.6 ± 9.6 a. 65.5 ± 14.0 a. 4.0 ‘Chu’. Explants were cultured on B5 medium containing various concentration of 6-benzylaminopurine (BA) and 0.1 mg L-1 α-naphthaleneacetic acid (NAA) for 8 wk. Nine explants were used in each treatment. y For each variety, means in the same column followed by different letters are significantly different at the 5% level by least significant difference (LSD) test. x No buds with unfolded leaves. z. 薑 組 培 苗 繁 殖 常 利 用 1–5 mg L -1 BA 配 合 0.1–2 mg L -1 NAA 之 MS 培 養 基， 此 組 成 可誘導芽體形成而達到增殖效果，且 BA 配合 NAA 處理對芽體增殖效率顯著優於單獨使用 BA (Deng & Pan 2009; Kambaska & Santilata 2009; Seran 2013)。Li (2016) 將 山 東 薑 根 莖 芽 體 培 養 於 含 有 1.5 mg L -1 BA 與 0.5 mg L -1 NAA 之 MS 培養基 30 d 後，芽體增殖率達 3.5 倍。印度薑 ‘Suprava’ 與 ‘Suruchi’ 的研究結果 顯示，長約 1 cm 根莖芽體培養於含有 2 mg L -1 BA 配 合 0.5 mg L -1 NAA 之 MS 培 養 基 6 wk 後，誘得株高約 6.2 cm 之組培苗達 7.5 苗；若 將 BA 濃度提高至 2.5–3 mg L -1，則會形成癒 傷組織且降低芽體數量 (Kambaska & Santilata 2009)。本研究結果顯示，提高 BA 濃度至 4.0 mg L -1 雖可促進苗數增加，但苗高顯著降低； 此 外， 本 研 究 中 使 用 2.0–4.0 mg L -1 BA 濃 度 處理「廣東薑」與「竹薑」並未形成癒傷組織， 亦未見芽數減少之現象。上述兩研究顯示不同 的 結 果， 推 測 其 原 因 可 能 是 品 種 間 差 異 所 造 成。. Seran (2013) 之評論報告指出，薑組培芽 體若培養於含有較高 BA 濃度之培養基中，則 其伸長與發根均會受抑制，因此在芽體量化繁 殖後，培養基需要調降 BA 濃度，誘使芽體伸 長 與 發 根 後 才 能 成 為 組 培 苗。Han (2000) 於 「廣東薑」莖頂培養研究指出，其誘導所得之 芽體並無法同時發根成苗，必須將芽體繼代培 養於含有 1 mg L -1 NAA 之 MS 培養基中誘導 發 根。「竹 薑」 (Huang et al. 2004) 與 衣 索 比 亞薑 (Ayenew et al. 2012) 利用生長點為培植 體之研究結果亦顯示，芽體須經過伸長與發根 階 段 才 能 成 為 組 培 苗。Sathyagowri & Seran (2011) 利 用 斯 里 蘭 卡 薑 ‘Local’、‘Chinese’ 及 ‘Ragoon’ 的 研 究 結 果 也 顯 示， 組 培 苗 的 養 成 需要經過兩個階段，先將 5 mm 根莖芽體培養 於含有 5 mg L -1 BA 與 0.5 mg L -1 NAA 之 MS 培養基 6 wk 後，誘導芽體成為叢生芽，而後 再將叢生芽分切後，繼代培養於含有 3 mg L -1 BA 與 0.5 mg L -1 NAA 之 MS 培養基中，促進 芽體伸長與發根而成為組培苗。印度薑 (Kambaska & Santilata 2009)、埃及薑 (Abbas et al..
(9) 409. 薑組織培養大量繁殖. (A1). (A2). (A3). (A4). (A5). (B1). (B2). (B3). (B4). (B5). 圖 4. 源自不同 BA 濃度液態培養之「廣東薑」與「竹薑」於液-固兩階段培養後組培苗增殖與生長之情形。「廣 東薑」(A) 與「竹薑」(B) 之組培根莖先於含有 0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg L-1 BA (依序為 A 與 B 圖中之 1、2、3、4、 5) 配合 0.1 mg L-1 NAA 之 B5 液態培養基中培養 8 wk 後，將未經切割之葉片展開苗、綠色芽及淡黃色芽直接 繼代培養於含有 0.5 mg L-1 BA 與 0.1 mg L-1 NAA 之 B5 固態培養基 8 wk 後之瓶苗生長情形；Bar = 1 cm。 Fig. 4. Effect of 6-benzylaminopurine (BA) and liquid-solid two-stage culture on plantlet proliferation and growth of in vitro Zingiber officinale ‘Guang Dong’ (A) and ‘Chu’ (B). Uncut explants were derived from B5 liquid medium containing 0.0, 0.5, 1.0, 2.0, and 4.0 mg L-1 BA (1, 2, 3, 4, and 5 in A and B, respectively) and 0.1 mg L-1 α-naphthaleneacetic acid (NAA) for 8 wk of culture before subculturing on the B5 solid medium containing 0.5 mg L-1 BA and 0.1 mg L-1 NAA for another 8 wk of culture. Bar = 1 cm.. 2011) 及山東薑 (Li 2016) 均利用類似之組培 苗量化繁殖策略，亦即先以較高 BA 濃度誘導 大 量 芽 體 形 成， 而 後 再 將 其 繼 代 培 養 於 調 降 BA 濃度之培養基中，則可促進芽體伸長與發 根而成為正常瓶苗。 然而 Kavyashree (2009) 於印度薑 ‘Varada’ 的 研 究 指 出， 根 莖 芽 體 培 養 於 含 有 17.76 μM (4 mg L -1) BA 之 LS 培 養 基 4 wk 後， 可 誘 導 芽體形成，再經過 2–3 次繼代於相同組成培養 基，只須一種培養基組成即可發根成苗。本研 究結果顯示，將根莖芽體培養於含有 0.4 mg L -1 BA 之 B5 培 養 基 2 次， 共 12 wk 之 培 養 後， 即形成每苗含 3–4 芽且發根之組培苗 (圖 1C、 1D)。 由 上 述 研 究 來 看， 不 同 之 培 植 體 與 BA 濃度會影響薑組培苗繁殖之效率；以生長點為 培植體，須經芽體增殖與伸長發根兩個階段才 能成為組培苗，而利用根莖芽體作為培植體，. 則其芽體較易發根而成苗，然而提高 BA 濃度 則會抑制芽體伸長發根，必須將芽體繼代培養 於調降 BA 濃度之培養基中，藉以促使芽體伸 長與發根。推測根莖芽體基部可能是已分化之 根莖組織，因此根系發育極為容易；然而，莖 頂係尚未分化之地上部組織，因此根系發育則 相對困難；而其他需要兩個階段才能成苗的相 關研究，則可能是品種差異或 BA 濃度過高所 導致的結果，抑或是組培苗量化繁殖的策略應 用。 Seran (2013) 的評論指出，薑的芽體若培 養 於 含 有 1–5 mg L -1 BA 配 合 0.0–0.5 mg L -1 NAA 之 MS 培 養 基， 可 同 時 增 殖 芽 體 與 發 根 而成苗。David et al. (2016) 將 5–10 mm 馬來 西 亞 薑 ‘Tambunan’ 根 莖 芽 體， 培 養 於 含 有 3 mg L -1 BA 與 1 mg L -1 NAA 之 MS 培 養 基 中 10 wk 後，可獲得 6.14 株發根組培苗。Lincy.
(10) 410. 台灣農業研究 第 67 卷 第 4 期. 表 3. 源自不同 BA 濃度液態培養基之「廣東薑」與「竹薑」培植體於固態培養基中對組培苗增殖與生長之影響。 Table 3. Effect of explants derived from various BA concentrations in the liquid medium on plantlet proliferation and growth after subculturing in the solid medium of Zingiber officinale ‘Guang Dong’ and ‘Chu’z. BA (mg L-1). No. of plantlets. Plantlet height (cm). Plantlet formation (%). ‘Guang Dong’ 0.0. 10.2 ± 1.4 aby. 4.1 ± 0.6 a. 88.9 ± 19.2 a. 0.5. 12.5 ± 2.9 a. 2.8 ± 0.3 b. 88.9 ± 19.2 a. 1.0. 13.0 ± 4.5 a. 3.1 ± 0.3 b. 66.7 ± 0.0 ab. 2.0. 11.2 ± 1.5 a. 2.8 ± 0.4 b. 88.9 ± 19.2 a. 4.0. 3.9 ± 5.3 b. 2.4 ± 0.8 b. 55.6 ± 19.2 b. 0.0. 11.2 ± 1.2 a. 6.1 ± 0.6 a. 100.0 a. 0.5. 14.9 ± 3.3 a. 5.2 ± 0.9 ab. 100.0 a. 1.0. 13.5 ± 1.3 a. 5.0 ± 0.3 bc. 100.0 a. 2.0. 13.3 ± 2.5 a. 4.6 ± 0.2 bc. 100.0 a. 4.0. 14.9 ± 2.0 a. 4.2 ± 0.3 c. 100.0 a. ‘Chu’. z. Explants derived from B5 liquid medium containing 0‒4 mg L 6-benzylaminopurine (BA) and 0.1 mg L-1 α-naphthaleneacetic acid (NAA) for 8 wk of culture, and the explants without cutting were subcultured on the B5 solid medium supplemented with 0.5 mg L-1 BA and 0.1 mg L-1 NAA for another 8 wk of culture. Nine explants were used in each treatment. y For each variety, means in the same column followed by different letters are significantly different at the 5% level by least significant difference (LSD) test.. & Sasikumar (2010) 將 1.0–1.5 cm 印 度 薑 根 莖芽體，培養於含有 1.0 mg L -1 賽本隆 (thidiazuron, TDZ) 配 合 0.5 與 1.0 mg L -1 吲 哚 丁 酸 (indole butyric acid; IBA) 之 MS 培養基中 2 mo 後，兩品種 ‘Jamaica’ 與 ‘Varada’ 分別達 8.8–12.9 個 芽 與 6.8–8.1 條 根。 本 研 究 結 果 顯 示，0.5–2.0 mg L -1 BA 配 合 0.1 mg L -1 NAA 處 理 之 每 個 培 植 體 可 誘 得 約 5–6 苗， 苗 高 約 1.8–2.6 cm (表 1)；提高 BA 濃度至 4.0 mg L -1 雖 可 增 加 苗 數， 但 苗 高 顯 著 較 低； 反 之， 對 照組之苗高雖然較高，但苗數卻顯著較少 (表 1)；此外，在此增殖階段之組培芽體均可同時 發根良好而成苗 (圖 2)，因此本研究並未調查 各 BA 處理所得組培苗之根數與根長。綜合上 述研究結果指出，薑根莖培植體培養於含有適 當 細 胞 分 裂 素 (BA 與 TDZ) 與 生 長 素 (NAA 與 IBA) 濃度組合之處理，則可具有促進芽體 增殖、伸長及發根的效果。本研究於「廣東薑」 與「竹薑」組培苗數量與高度之結果顯示，雖 然對照組之組培苗顯著較高，且芽數上與 0.5 mg L -1 BA 處理組並無顯著差異，但是 BA 處 理具有較多芽數，考量為維持後續培養時之增. -1. 殖、伸長及發根效率，建議可利用 0.5 mg L -1 BA 配合 0.1 mg L -1 NAA 之 B5 培養基，作為 薑組培苗之繼代培養基。 Luo et al. (2006) 利用 30 mL 固態培養基 或 於 固 態 培 養 基 上 添 加 少 量 10 mL 液 態 培 養 基的淺層液態培養方式，進行「廣東薑」組培 苗繁殖研究，結果顯示固態與淺層液態培養方 式 在 培 養 1 mo 後 之 發 根 率 均 可 達 100%， 但 是淺層液態處理之組培苗葉片較大且植株較為 健壯。Lincy & Sasikumar (2010) 利用 1.0–1.5 cm 印度薑 ‘Jamaica’ 與 ‘Varada’ 地上部芽體， 培養於只含有 TDZ 的固態培養基，所誘得的 芽體數較少且大多發育異常，若以液態培養則 可 顯 著 提 高 芽 體 增 殖 率； 而 後 將 叢 生 芽 體 培 養於含有 1 mg L -1 TDZ 配合 0.5 或 1.0 mg L -1 IBA 之 MS 液態培養基中 3 wk 後，芽體伸長且 發根成為白色叢生苗；而後再將每叢含有 4–5 芽之叢生苗作為培植體，培養於含有 1 mg L -1 BA 與 1 mg L -1 NAA 之 MS 固 態 培 養 基 中 約 45 d 後， 即 可 形 成 發 根 良 好 的 綠 色 叢 生 組 培 苗。雖然報告中並未提及芽體增殖率，但可知 液 - 固兩階段培養方式具有促進組培苗增殖與.
(11) 411. 薑組織培養大量繁殖. 生長效果。本研究於「廣東薑」與「竹薑」也顯 示相類似結果，雖然液態培養下每個培植體獲 得 約 6.1–7.8 芽， 但 卻 存 在 大 量 小 於 1 cm 的 淡黃色芽 (表 2、圖 3)。因此，後續再將叢生 芽繼代培養於固態培養基中，以促使大量芽體 伸長且發根成為正常苗。表 3 與圖 4 之結果顯 示，「廣東薑」與「竹薑」於液態培養下所得叢 生芽團塊，不經切割而直接繼代培養於固態培 養基中，可使「廣東薑」芽苗團塊中部分芽體 長成正常苗，其成苗率約 55.6–88.9%，而「竹 薑」之成苗率更可達到 100%；就瓶苗增殖率 而 言， 兩 品 種 均 以 源 自 0.5–2.0 mg L -1 BA 液 態處理之結果較佳，顯示液-固態兩階段培養 可利用於薑組培苗之大量繁殖。此外，「廣東 薑」 與「竹 薑」 經 液 態 與 固 態 兩 階 段 共 16 wk 培養後，每 8 wk 的平均增殖率分別為 6.50 (13 苗/2 次) 與 7.45 (14.9 苗/2 次) (表 3)；相較於 固態培養 8 wk 後所得 7.2 與 7.7 之增殖率的差 異不大，但兩階段培養方式之優點在於所得瓶 苗較高 (表 1、表 3)，且在液態培養後繼代培 養時，無須切割直接轉入固態培養基中。而固 態培養則因根系已發育完成，繼代培養時必須 切除部分假莖與根系，兩培養方式在操作程序 比較下，液-固態兩階段培養方式顯然較為省 工，但是卻也存在液態培養所需振盪培養設備 需求的問題。 本研究利用「廣東薑」與「竹薑」之根莖芽 體，已建立其微體繁殖方式，可將組培芽體培 養於含有 0.5 mg L -1 BA 與 0.1 mg L -1 NAA 之 B5 固態培養基，可達瓶苗增殖、伸長及發根 成苗之目的。此外，本研究同時建立液-固態 兩階段培養方式，不僅有效促進組培苗之增殖 率，且可縮短組培操作之時間；後續將針對苗 數與苗高對於薑苗生長的重要性，並探討組培 苗之適當馴化條件，完成量產優質薑種苗之生 產鏈，提供薑種苗產業之應用。. 誌謝 本文稿承農業試驗所花卉研究中心蔡媦婷 博士協助審閱，特此申謝。. 引用文獻 Abbas, M. S., H. S. Taha, U. I. Aly, H. M. El-Shabrawi, and E. I. Gaber. 2011. In vitro propagation of ginger (Zingiber officinale Rosco). J. Gene. Engine. Biotech. 9:165–172. Agrahari, P., P. Panda, N. K. Verma, W. U. Khan, and S. Darbari. 2015. A brief study on Zingiber officinaleA review. J. Drug Dis. Therap. 3:20–27. Ali, B. H., G. Blunden, M. O. Tanira, and A. Nemmar. 2008. Some phytochemical, pharmacological and toxicological properties of ginger (Zingiber officinale Roscoe): A review of recent research. Food Chem. Toxicol. 46:409–420. Ayenew, B., W. Tefera, and B. Kassahun. 2012. In vitro propagation of Ethiopian ginger (Zingiber officinale Rosc.) cultivars: Evaluation of explant types and hormone combinations. Afr. J. Biotechnol. 11:3911– 3918. Chen, W. L., R. S. Li, Z. H. Tsai, and C. H. Hsiao. 2014. Study on improving sprout forcing methods for early ginger (Zingiber officinale) production. J. Taiwan Soc. Hort. Sci. 60:253–264. (in Chinese with English abstract) Council of Agriculture, Executive Yuan. 2017a. A survey of vegetable production in Taiwan. http://agrstat. coa.gov.tw/sdweb/public/official/OfficialInformation.aspx (visit on 2017/6/6) (in Chinese) Council of Agriculture, Executive Yuan. 2017b. Yearly report of Taiwan’s agriculture. http://agrstat.coa. gov.tw/sdweb/public/book/Book.aspx (visit on 2017/6/6) (in Chinese) David, D., T. Y. Ji, and J. A. Gansau. 2016. In vitro propagation of Zingiber officinale Rosc. ‘Tambunan’. Trans. Sci. Technol. 3:162–167. Deng, N. F. and B. L. Pan. 2009. Research progress on tissue culture of ginger. J. Anhui Agric. Sci. 37:12406–12407, 12410. (in Chinese with English abstract) Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2017. Ginger visualize data in Food and Agricultural Organization of the United Nations. http:// www.fao.org/faostat/en/#data/QC/visualize (visit on 2017/6/6) Gamborg, O. L., R. A. Miller, and O. Ojima. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151–158. Han, C. M. 2000. Study on the shoot tip culture of ginger (Zingiber officinale Roscoe). Res. Bull. KDARES 11:37–46. (in Chinese with English abstract) Hsieh, L. Y., C. J. Tsai, C. Y. Huang, and H. I. Chen. 2017. Production forecast for May 2017. http://.
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(13) 薑組織培養大量繁殖. Effect of Plant Growth Regulator and Two-Stage Culture on Proliferation and Growth of In Vitro Ginger Plantlets Uei-Chern Chen1, Chin-Yi Tsao1, Tzu-Ying Wu2, and Chi-Ni Hsia3,*. Abstract Chen, U. C., C. Y. Tsao, T. Y. Wu, and C. N. Hsia. 2018. Effect of plant growth regulator and two-stage culture on proliferation and growth of in vitro ginger plantlets. J. Taiwan Agric. Res. 67(4):401–413.. Efficient protocols for in vitro multiplication of Zingiber officinale ‘Guang Dong’ and ‘Chu’ were established in this study. Newly germinated rhizome buds (about 1 cm) were treated with 75% alcohol for 30 s, followed by 0.6% NaOCl for 15 min, before cultured on a B5 basal medium containing 0.4 mg L-1 6-benzyladeninepurine (BA) for 12 wk to establish in vitro culture. Proliferation of 4.8–6.0 plantlets per explant with 1.8–2.6 cm in height were obtained by using 5 mm rhizome explants culturing on a B5 solid medium containing 0.5–2.0 mg L-1 BA and 0.1 mg L-1 α-naphthalene acetic acid (NAA) for ‘Guang Dong’ and ‘Chu’. Good rooting was found for all plantlets derived from all treatments. Although more plantlets were obtained in the 4.0 mg L-1 BA treatment, shorter plantlets were observed. On the contrary, higher plantlets with less numbers were found from the control. Proliferation of 7.6–7.8 and 7.1–7.3 plantlets per explant were obtained for ‘Guang Dong’ and ‘Chu’, respectively, by using 5 mm rhizome explants culturing on the liquid medium containing 0.5–2.0 mg L-1 BA for 8 wk. However, plantlets with unfolded leaves of 1.2–1.3 cm in height were observed for both varieties. Uncut explants of plantlets with unfolded leaves, green shoot-buds, and yellowish shootbuds derived from the liquid culture were subcultured onto the fresh solid B5 medium containing 0.5 mg L-1 BA and 0.1 mg L-1 NAA for another 8 wk. Proliferation of 11.2–13.0 plantlets per explant with 2.8–3.1 cm in height and 13.3–14.9 plantlets per explant with 4.6–5.2 cm in height were obtained for ‘Guang Dong’ and ‘Chu’, respectively. This result indicated that using liquid-solid two-stage culture could be beneficial on in vitro multiplication of Z. officinale. Key words: Zingiber officinale, Liquid-solid culture, 6-benzylaminopurine, Mass propagation.. Received: September 29, 2017; Accepted: June 21, 2018. * Corresponding author, e-mail: hsia@tari.gov.tw 1 Assistant Research Fellows, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 2 Research Assistant, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 3 Research Fellow, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC.. 413.
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