不同強度運動對自體富含血小板血漿中生長因子濃度之影響

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(1)國立台灣師範大學運動與休閒學院體育學系博士學位論文. 不同強度運動對自體富含血小板血漿中生長因子濃度之影響. 研究生：姜義彬指導教授：方進隆. 中華民國 104 年 6 月中華民國台北市.

(2) 不同強度運動對自體富含血小板血漿中生長因子濃度之影響 104 年 6 月研究生：姜義彬指導教授：方進隆摘要研究背景：人類血小板內含有多種生長因子，可促進組織再生與修補。臨床上抽取血液加以離心後，可以得到較高濃度的「富含血小板血漿」（簡稱 PRP），用於局部肌肉、肌腱或關節的治療。過去研究較少探討單次運動對 PRP 中血小板與生長因子的影響。研究目的: 本研究目的在比較單次三十分鐘中等強度和高強度運動前後 PRP 中血小板與生長因子濃度之變化。方法：本研究徵求 15 位平均年齡為 31.9 歲之健康男性自願受試者，在相隔一周的時間分別從事三十分鐘(含十分鐘走路熱身) 50% (中等強度)及 85% (高強度) 儲備心跳率之跑步機運動，並於每次跑步運動後收集血液製作 PRP。所得資料以二因子變異數分析，比較運動前後與不同強度在全血及 PRP 中血小板濃度之差異，並以成對 t-檢定檢測不同強度下運動前後血小板及各種生長因子濃度之差別。結果：1, 全血中血小板之濃度，在中等強度與高強度運動後較運動前分別上升了 6.12%及 18.09%，在 PRP 中血小板濃度則分別上升了 10.25%及 17.19%。2, 在中等強度運動後，PRP 中 IGF-1、PDGF、VEGF、TGF-β 四種生長因子濃度分別上升 0.86%, 12.18%, 22.18%, 13.73%，但只有 VEGF 濃度的增加達顯著差異（p<0.05）； PRP 中生長因子數量增加分別為 0.11%, 17.48％, 25.48%, 15.72%, 且 PDGF、VEGF、TGF-β 三項升高均達顯著差異(p<0.05)。3, 在高強度運動後，IGF-1、PDGF、VEGF、TGF-β 濃度分別上升 10.35%, 8.20%, 4.67%, 19.06%, 而生長因子數量則上升 7.57％, 7.45%, 5.85%, 19.05% ，其中只有 IGF-1 與 TGF-β 的濃度及 TGF-β 的數量有顯著上升(p<0.05)。結論：單次三十分鐘中等和高強度運動後，全血和 PRP 中血小板濃度和數量皆有上升，而且某些生長因子濃度和數量會增加。. 關鍵詞: 血小板衍生生長因子，血管內皮生長因子，轉化生長因子，類胰島素生長因子，活化。 iii.

(3) Effect of Different Intensity of Exercises to the Growth Factor Concentration in Homologous Platelet-Rich Plasma June 2015 Graduate： Yi-Pin Chiang Advisor：Chin-Lung Fang ABSTRACT BACKGROUND: The human platelets contain many kinds of growth factors and play important roles in tissue repair and regeneration. The blood must be collected and centrifuged to obtain so-called “Platelet-rich plasma” (PRP) to reach a higher concentration for clinical use. To date, there are only few articles discussing about the effect of exercise to the platelet and growth factors in PRP. The purpose of this study was to investigate the effect of 30-minute acute exercise to concentration and count of platelet and growth factors in PRP. METHODS: Fifteen male volunteers at average age of 31.9 years were recruited in the study. Thirty-minutes of running exercises (including 10 minutes of walk as warm-up) with intensity of 50% (moderate) and 85% (intensive) of heart rate reserve were performed by all the participants in two consecutive weeks. Blood samples were drawn before and after each exercise to produce PRP. Two-way ANOVA was utilized to check the interaction between intensity and status of exercise. Paired-t test was used to determine the significance of change regarding to platelet and growth factors before and after exercises. RESULTS: 1, Platelet concentration increased by 6.12% and 18.09% in whole blood while 10.25% and 17.19% in PRPs after moderate and high intensity exercises. 2, After moderate exercise, concentration of IGF-1, PDGF, VEGF and TGF-β in PPR increased by 0.86%, 12.18%, 22.18% and 13.73%, with only VEGF increased significantly (p<0.05). The amount of those growth factors in PRP raised by 0.11%, 17.48％, 25.48% and 15.72% respectively while PDGF, VEGF and TGF-β increased significantly (p<0.05). 3, After intensive exercise, concentration of IGF-1, PDGF, VEGF and TGF-β increased by 10.35%, 8.20%, 4.67% and 19.06%. Their amount raised by 7.57％, 7.45%, 5.85% and 19.05% in the mean time. The concentration of IGF-1 and TGF-β as well as amount of TGF-β increased significantly (p<0.05). CONCLUSIONS: After 30 minutes of either moderate or high intensity exercise, platelets in whole blood and PRP as well as some growth factors in PRP significantly increased in the concentrations and amount. Key words: platelet-derivated growth factor, vascular endothelial growth factor, transforming growth factor, insulin-like growth factor, activate iv.

(4) 謝. 誌. 能夠順利完成博士學位的口試及論文寫作，最要感謝的當然是我的指導老師方進隆教授。從九年前入學開始，方老師便不斷給我很多的啟發。不論在人生哲理方面，還是永不中斷的運動習慣與英語學習，都是我最敬佩與效法的榜樣。最感謝方老師的，是九年來對我的體諒與寬容。方老師一直非常體諒我工作時間有限，也一直非常寬容我在課業完成上的一再拖延，更在我差一點錯過論文研究計劃口試申請的那個下午，專程趕到學校幫忙我完成手續，讓我能夠臨門一腳進入學位口試的流程。我想，方老師絶對是我得以完成博士學業的最大恩師。其次要感謝馬偕醫院的呂衍達醫師。在整個研究計劃的進行過程中，呂醫師給我許多指導與建議，並無私地分派他的研究助理吳凌巧小姐全程協助，不但幫助我搜集相關論文，更負責全部的實驗室工作；沒有呂醫師研究團隊的協助，我便無法完成整個研究。此外，擔任這次口試委員的卓教授俊辰校長、王副教授鶴森老師、台大醫院復健部主任王教授亭貴醫師，都在這次的論文中給我許多寶貴的意見與指導，個人深感萬分感謝！另外，還要感謝馬偕醫院醫學研究部提供的研究經費，讓研究的過程順利完成。最後要感謝我親愛的家人。我的妻子劉小瑜醫師，在這段研究時間裏幾乎負起一切家事與兒子的教養，讓我無後顧之憂地常常在下班後及假日間，留在醫院和圖書館內寫作論文，直到很晚才回家。想起九年前小瑜與我同時進入研究所、兒子理元也進入小學，一家三口都是一年級新生。小瑜的研究所早已畢業多年，理元今年也上了高中，而我卻在年過半百後才畢業，不覺莞爾，更感謝上天賜給我們全家人的平安與喜樂。. 姜義彬. 謹誌. 中華民國 104 年 6 月. v.

(5) 目. 次. 中文摘要……………………………………………………………………………………iii 英文摘要……………………………………………………………………………………iv 謝誌…………………………………………………………………………………………v 目次…………………………………………………………………………………………vi 圖次…………………………………………………………………………………………ix 表次…………………………………………………………………………………………x. 第壹章緒論第一節、前言……………………………………………………………………………1 第二節、研究問題…………………………………………………………………………2 第三節、研究目的………………………………………………………………………3 第四節、研究假設………………………………………………………………………3 第五節、研究範圍與限制………………………………………………………………3 第六節、名詞操作性定義………………………………………………………………4 第七節、研究的重要性…………………………………………………………………4. 第貳章文獻探討第一節、血小板的生成與代謝…………………………………………………………5 第二節、血小板的構造…………………………………………………………………7 第三節、血小板的凝血功能……………………………………………………………9 第四節、血小板的活化…………………………………………………………………12 第五節、血小板的生長因子……………………………………………………………13 vi.

(6) 第六節、富含血小板血漿與其製作……………………………………………………16 第七節、富含血小板血漿對組織修復的影響…………………………………………19 第八節、運動對血小板濃度的影響……………………………………………………22 第九節、運動對富含血小板血漿中生長因子濃度之影響……………………………24 第十節、本章總結………………………………………………………………………25. 第參章研究方法第一節、研究對象………………………………………………………………………26 第二節、實驗設計與方法………………………………………………………………26 第三節、統計分析………………………………………………………………………30 第四節、預期結果………………………………………………………………………30. 第肆章結果第一節、受試者基本資料………………………………………………………………31 第二節、實驗數據………………………………………………………………………32 4.2.1 兩次運動前後之生理數據變化…………………………………………………32 4.2.2 兩次測驗運動前後所採全血生理檢測數據……………………………………33 4.2.3. PRP 與 PPP 中血球變化之數據…………………………………………………34. 4.2.3.1 PRP 體積與血球變化之數據……………………………………………34 4.2.3.2. PPP 體積與血球變化之數據……………………………………………36. 4.2.3.3. 運動前後全血與 PRP、PPP 中血小板濃度之比較……………………37. 4.2.3.4. PRP 與 PPP 中血小板之萃取率…………………………………………38. 4.2.4. PRP 與 PPP 中生長因子之數據…………………………………………………39 4.2.4.1 生長因子濃度……………………………………………………………39 vii.

(7) 4.2.4.2 生長因子量………………………………………………………………40. 第伍章討論與分析第一節、不同強度運動對全血中血球濃度之影響……………………………………43 第二節、運動對PRP中血球濃度之影響………………………………………………45 第三節、運動對PRP中生長因子濃度之影響…………………………………………47. 第陸章結論與建議 ……………………………………………………………………54. 參考文獻中文文獻…………………………………………………………………………………56 英文文獻…………………………………………………………………………………56. 附錄附錄一、馬偕紀念醫院醫學研究部專題研究計畫申請書 ……………………………66 附錄二、馬偕紀念醫院人體研究倫理審查委員會同意臨床試驗證明書 ……………67 附錄三、馬偕紀念醫院人體研究倫理審查委員會通過之受試者同意書 ……………69 附錄四、運動自覺量表(Borg Rate of Perceived Exertion Scale) ………………………72 附錄五、不同強度運動前後全血中血小板濃度之二因子變異數分析 ………………73 附錄六、不同強度運動前後 PRP 中血小板濃度之二因子變異數分析 ………………74. viii.

(8) 圖次圖1、正常血小板的生成 …………………………………………………………………6 圖2、血小板之細胞構造……………………………………………………………………7 圖3、血小板栓塞之形成機轉. …………………………………………………………11. 圖4、未活化與活化後血小板血球形狀之比較…………………………………………12 圖5、市售PRP製作流程示意圖……………………………………………………………17 圖6、本研究實驗室 PRP 之製作與生長因子之檢測……………………………………29 圖7、中等強度與高強度運動後 PRP 中生長因子濃度增減率…………………………49 圖8、中等強度與高強度運動後 PRP 中生長因子數量增減率…………………………51. ix.

(9) 表次表1、血小板內生長因子及其作用…………………………………………………14 表2、生長因子對軟組織之功效………………………………………………………21 表3、不同運動型態與強度之血小板數量變化………………………………………22 表4、受試者基本資料………………………………………………………………31 表5、運動前後之生理數據…………………………………………………………32 表6、運動前後全血之生理檢測數據………………………………………………33 表7、運動前後PRP之檢測數據………………………………………………………35 表8、運動前後離心後血漿PPP之檢測數據…………………………………………36 表9、運動前後血小板濃度 ………………………………………………………………37 表10、運動前後血小板數量(x1000) 及萃取率……………………………………38 表11、中等強度與高強度運動前後PRP中生長因子濃度之比較…………………39 表12、中等強度與高強度運動前後PPP中生長因子濃度之比較………………………40 表13、運動前後PRP中生長因子總量之比較………………………………………41 表14、運動前後PPP中生長因子總量之比較………………………………………41 表15、運動前後PRP＋PPP中生長因子總量之比較……………………………………42. x.

(10) 第壹章緒論. 第一節. 前言. 人體的構造十分複雜而奧妙，它包含了許多與生俱來的結構，無時無刻不斷地進行生長代謝與修補的工作。人體中無數的細胞與組織，經年累月不斷地更新與替換，使得身體維持正常功能，因應日常生活一切的活動。人體一旦受到損傷，身體也有非常微妙的自然修補功能，修復受傷的組織，讓身體機能回復到受傷前的狀況。然而，身體的修補功能因人而異，不但取決於個人的身體機能，也與傷害的程度有關。千百年來，人類不斷的在醫學方面尋求進步，希望能夠在傷害或疾病後得到最佳的醫療，延年益壽。外科手術的進步，讓許多退化性或創傷性疾病得到很好的清創及復位；抗生素的發明，使得傷口免於感染而提高存活與復原的機會。但是，不論在手術或藥物治療後，身體組織的修復與再生，所需要的時間及最終修復的程度，往往不是醫療人員所能完全控制的。因此，促進受傷組織的再生，一直是許多醫療從業人員不斷追求的目標。許多方法例如：體外震波治療(Bannuru, Flavin, Vaysbrot, Harvey, & McAlindon, 2014; Maffulli, Hemmings, & Maffulli, 2014; Visco et al., 2014)、增生劑的注射治療(Martins et al., 2012; Rabago et al., 2014)、幹細胞治療(Carvalho et al., 2014; Hirzinger et al., 2014; Stanco et al., 2014)、及富含血小板血漿注射治療(Gobbi, Karnatzikos, Mahajan, & Malchira, 2012; Paoloni, De Vos, Hamilton, Murrell, & Orchard, 2011)等等，都已被使用為促進身體修補的工具。近年許多醫學研究發現，人類的血小板對於組織修復及再生，扮演著重要角色，它不但可以在局部組織受傷後造成局部的凝集，防止傷害範圍的擴大，並且能夠釋放多種生長因子，促進血管增生及組織的再生與修復。血小板這樣的修復功能，目前已被越來越多的臨床醫師使用於退化性關節炎(Dold, Zywiel, Taylor, Dwyer, & Theodoropoulos, 2014; Laudy, Bakker, Rekers, & Moen, 2014)、運動傷害(Engebretsen et al., 2010; Middleton, 1.

(11) Barro, Muller, Terada, & Fu, 2012; Nguyen, Borg-Stein, & McInnis, 2011)及肌肉軟組織傷害(Andia & Maffulli, 2013; Mazzocca, McCarthy, Chowaniec, Dugdale, et al., 2012)…等等疾患之治療。然而，體內的血小板對於小範圍的傷口而言，其濃度與數量足以達到修復傷口的目的，但臨床上若要將血小板使用於局部或關節的治療，體內血小板的濃度及數量往往不足，必需將一定量的血液抽出後，加以離心、濃縮、純化之後，才能得到足夠濃度的血小板量以供使用，此濃縮後的血漿稱為「富含血小板血漿」（platelet-rich plasma，簡稱 PRP）。目前世界上己已有許多知名的運動選手選擇使用 PRP，如洋基隊的田中將大，湖人隊的 Kobe Bryant 及世界高爾夫球王 Tiger Woods 等人，均在運動傷害後選擇使用 PRP 來進行治療；不論將 PRP 當作術後的修補增强劑，或是以 PRP 取代傳統手術治療，據稱都得到不錯的療效。國內亦有許多名人、藝人在使用 PRP 治療關節病變後，宣稱得到很好的治療效果。目前國內外醫界雖然有越來越多人使用 PRP 治療患者，也有越來越多的文獻報告印證 PRP 的療效(Laudy et al., 2014; Vannini et al., 2014; Willits, Kaniki, & Bryant, 2013; Yuan, Zhang, & Wang, 2013)；但目前市面上 PRP 每次治療的費用，根據不同廠商及製作方式，收費大致為新台幣$15,000 至$50,000 不等，這對一般運動員及收入較低的民眾而言，是一項非常大的負擔；此外，由於每次抽血後製成的 PRP 數量並不多，往往在一年內需要反覆治療患處三至四次；這樣的治療方式，不論對病人時間或金錢的支出都是頗大的負擔。. 第二節. 研究問題. 有研究指出，在單次劇烈運動之後，血液中血小板的數量會明顯增加。而不同種類及強度的運動，對於血中血小板數量的增加也有促進的效果。. 2.

(12) 然而，既然運動後血液中血小板的濃度會增加，那麼在運動後立刻抽血得到的血液所製成的 PRP 中，血小板濃度理應也會增加。運動後血小板的增加，是否同時也可以使生長因子的數量成等比例地增加尚未可知；針對此一問題，目前已知只有少數具體的研究報告(Hamilton, Tol, Knez, & Chalabi, 2015)。運動後增加的血小板是否能夠同步釋出更多的生長因子？抑或運動後反而不適合生長因子的生成與釋出，目前亦尚無定論，而這也是本研究主要關切的問題。此外，在何種運動強度下，較易取得更多的生長因子？中等強度的運動或者高強度的運動？也是我們感到興趣而想要探討的。. 第三節. 研究目的. 一、本研究的目的，是希望經由運動的手段，改變血液中血小板的濃度，觀察是否利用運動的方法，在單次 PRP 的製作過程中可取得更多的生長因子。二、希望藉由研究了解不同強度運動，對體內生長因子的釋放效果。. 第四節. 研究假設. 一、單次運動可以增加血液中血小板的濃度，並因此增加 PRP 中血小板的濃度。二、PRP 生長因子的濃度及數量會隨血小板濃度的增加而增加。二、不同強度的運動後，生長因子之釋出程度有所不同。. 第五節. 研究範圍與限制. 一、本研究之研究對象自願受測之健康成年男性，研究結果將無法使用於其他如老年人或女性之族群。二、本研究測定之生長因子種類有限，無法得知其他未經測定的生長因子之生理表現。. 3.

(13) 第六節. 名詞操作性定義. 一、富含血小板血漿﹔ 即 platelet-rich plasma，簡稱 PRP。全血經適當的離心之後，分為上層的血漿及下層的血球部份。而血漿中位於較底層的的部份，比血漿上層含有較高濃度的血小板，且此部份血小板的濃度通常較全血為高。此部份的血漿即稱為「富含血小板血漿」。二、儲備心跳率即 heart rate reserve，係指預估最大心跳率減去安靜時心跳率的數值。而預估最大心跳率的算法為 220 減去年齡。通常以儲備心跳率法來介定運動強度，例如欲達 50%儲備心跳率的運動強度，則運動時需達到心跳數為：安靜時心跳率＋（儲備心跳率 x50%），此強度大約為中等的運動強度。三、生長因子指人體所生成的各種可以刺細胞生長、修復、分化功能的物質，其組成大部份為蛋白質及荷爾蒙。生長因子存在於全身各處，而血小板中含有數種的生長因子。. 第七節. 研究的重要性. 一、本研究之結果若能證實單次運動後 PRP 中生長因子數目明顯增加，即可將之應用於患者，令患者於抽血前進行適當強度之運動，以提高 PRP 中生長因子的濃度，如此便可減少患者治療時之抽血量，以及所需治療之次數及費用。二、經由本研究可以了解：在不同強度的運動下，運動對血小板內生長因子釋放的影響。. 4.

(14) 第貳章文獻探討. 血小板又名凝血細胞、血栓細胞(thrombocyte) ，是人體血液中非常重要的成分。血小板一般較為人所知的功能主要是參與人體的凝血機轉。然而，除了受傷後傷口的凝集以外，血小板內還有豐富的微粒子，內含各式各樣的許多物質，可以在受傷後釋放出來，幫助組織的修復，促進傷口的癒合；其中，血小板內所富含的各種生長因子，便是傷口修補的重要元素。因此，血小板不但能防止受傷處血液的滲漏，還能在傷害發生後扮演非常重要的修復角色。 PRP 的基本原理，乃是利用高於正常濃度的血小板注入需修復的受傷組織，藉由高濃度的血小板釋放出高濃度的生長因子，對組織造成修補、再生的作用。PRP 對於運動傷害的運用已有多年，尤其是優秀運動員，更希望藉由一項新的治療方式讓組織的加速癒合，以便能早日回到運動場上從事訓練並參與競賽；2010 年世界反禁藥機構(WADA) 以血液製劑可能造成不合生理狀況的肌肉肥大為由，將肌肉內注射 PRP 列為禁止項目，其他肌腱內、關節內注射則經申報便可施行；2011 年，WADA 將 PRP 排除於禁藥的行列之中，國際奧委會(IOC) 於是聲明，PRP 為合法的運動治療製劑(Engebretsen et al., 2010)，但仍強調更深入的 PRP 基礎研究需要被重視，以加強 PRP 對運動員好處的證據。本章分別針對血小板之生成與代謝、構造、功能、活化、生長因子進行討論，並討論利用全血製作 PRP 之方法、及 PRP 之功能，最後探討目前文獻中有關運動對於血小板及 PRP 濃度之影響。. 第一節. 血小板的生成與代謝. 血小板的生成是從骨髓中的巨核芽球 (megakaryoblast)分化成前巨核球（promegakryocyte）開始，再生為顆粒巨核球(granular megakaryocyte)，最後由成熟的. 5.

(15) 巨核球(megakaryocyte)細胞質的分離膜斷裂而成。由於沒有細胞核，嚴格說來，血小板並不是一種完整的血球細胞。巨核芽球在胚胎期由肝臟、脾臟及胎盤製造，出生後則由骨髓產生。從巨核芽球分化到成熟的血小板大約需要數天的時間，一個巨核球平均可製造出 1,000 到 1,500 個血小板，核數越多的巨核球，血小板的產量也越多。血小板隨循環血進入脾臟，並停留二至四天後，再進入血液循環中，故人體之血液循環中的血小板實際只佔全身血小板的三分之二。一個健康人每天生成血小板約 1,200 億個，在循環血中，血小板的存活約為 8-12 天，平均壽命大約是 10 天，半衰期為 5-9 天。相較於紅血球，血小板體積甚小，呈不規則型，直徑大約為 2-3µm ，大約是紅血球的三分之一；厚約 0.2～1.5µm，平均體積 7µm3。一般而言，血液中血球有 93%為紅血球，而血小板的數量佔有率 6％，白血球則為 1%。血液中血小板的濃度大約為 150-400 x 109／L。血小板中大約 60%為蛋白質，15%為脂質，8%為醣類。. 圖 1、正常血球的生成資料來源: http://smallcollation.blogspot.tw/2013/07/generation-and-destruction-of-red-blood.html#gsc.t ab=0 6.

(16) 第二節. 血小板的構造. 血小板沒有細胞核，細胞質中含有許多的顆粒，目前已知約有1,100種蛋白質在血小板的內部或者表面被發現(Leslie, 2010)。細胞質的周邊部分有十幾層與細胞膜平行的環狀排列的微細管，靠近細胞膜處尚有細纖維。(圖2)。. 圖2、血小板之細胞構造。資料來源: 血液學，第四版。何敏夫編著。合計圖書出版社，2008，頁424 。. 血小板的微細構造如下:(何敏夫, 2008) 一、細胞膜 (cell membrane) 血小板的細胞膜和其他血球的細胞膜相似，細胞膜厚度約7.5nm，最外層為較厚的磷脂質，電子顯微鏡下可見到內凹的小管開口。細胞膜的糖蛋白為各種接受體，可吸附鈣、凝血酶(thrombin) 、von Willebrand (vW) 因子、纖維蛋白原、纖維蛋白網質(fibronectin)…等，以便進行血小板黏著與聚集作用。血小板另有第六因子（PF-6），和血小板第3因子（PF-3），PF-3是一種磷脂，具有部份凝血活酶的作用，在血液凝固反應中，幫助因子VIII的活化及凝血酶的形成。 7.

(17) 二、細纖維 (microfilament) 細纖維的直徑約為5-7 nm，集中在細胞膜下，並且散佈在細胞內。細纖維含有收縮蛋白（包括肌動蛋白和肌凝蛋白），含血小板收縮素，在血小板受到刺激時，使形態轉變，並促使凝固的血塊收縮。三、管道系統 (tubular system) 血小板的管道系統包括周邊微細管系統(marginal microtubules system) 及濃稠管道系統(dense tubular system)。環繞在細胞膜周邊的周邊微細管系統，以5-10條直徑約20 nm 呈束狀排列環繞細胞外圍。濃稠管道系統也靠近周邊微血管系統，管道內含有濃稠物、鈣離子、以及前列腺素轉換酶，血小板活化時，一些特殊的細胞膜複合體會藉著管道系統互相作用產生。四、粒腺體 (mitochondria) 粒腺體的數量不多，它可以合成肝醣、ADP、serotonin、adrenaline、prostaglandin 等代謝作用有關的物質，血小板是利用肝糖的醣解作用以產生能量，供應血小板收縮及分泌之能量。五、肝醣顆粒 (glycogen granule) 肝醣在電子顯微鏡下呈密度極高的小粒子，大多分散在細胞內，他可產生能量以供血小板利用六、α-顆粒(α-granules) α-顆粒為血小板內含量最多的胞器，直徑約0.3-0.5 µm，為橢圓形囊狀構造，在電子顯微鏡下有一層薄膜，內容均勻，其總數大約占血小板的十分之一體積(Blair & Flaumenhaft, 2009)，一般在染色時呈天藍色。α-顆粒含有20種以上的蛋白質，包括: 血小板特有蛋白質（platelet specific protein）及血漿類蛋白質(homologous of plasma protein)。 (一) 血小板特有蛋白質包括：血小板的第4因子、血栓球蛋白、thrombospondin、以及許多的生長因子。α-顆粒中的生長因子包括血小板衍生生長因子 8.

(18) （platelet-derivated growth factor， PDGF）、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉化生長因子(transforming growth factor, TGF-β)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor 1, IGF-1)、纖維母細胞生長因子(fibroblastic growth factor, FGF)…等等。 (二) 血漿類蛋白質包含：白蛋白、纖維蛋白原(fibrinogen)、纖維蛋白網質 (fibrinectin)、第十因子、vW因子、D因子、纖溶酶原(plasminogen) 、α 2-antiplasmin、α 1-antitrypsin、α 2-macroglobulin、多組胺酸醣蛋白(histidin-rich glycoprotein)…等，為凝固作用中血小板提供凝血活酶的部分來源。七、緻密體 (dense body) 緻密體又稱暗體（dark body）、電子非常濃稠體(very electron dense granules)、δ 粒子等。因為緻密體含有鈣，他在電子顯微鏡下看起來密度非常高，每一個血小板的顆粒中約有1- 5個緻密體，其功能主要是儲存和分泌，內含有可以使平滑肌收縮的血清素（serotonin），以及ATP、ADP、GTP、GDP、鈣質等，當血小板活化聚集時，這些物質經由開放小管系釋出到細胞外，以促進血小板的聚集反應。. 第三節. 血小板的凝血功能. 一般傳統的認知上，血小板最主要的功能為參與止血的作用。在正常情況下，血小板有維護血管壁完整性的功能；當內皮細胞受損時，血小板能隨時附著於血管壁，以填補內皮細胞脫落後留下的空隙，而且能夠滲透內皮細胞並對其進行修復。(梅林, 2004) 在正常的血管中，完整的血管內皮會產生一種前列腺環素(prostacyclin)，它可以造成血小板與血管內皮的互斥作用，避免血小板黏著於血管，防止不正常的凝血。當血管被切斷和受到傷害時，會依以下的步驟機制來達到止血的目的。其步驟如下： 1. 血管收縮，2. 形成血小板栓塞，3. 血液凝固成血凝塊，纖維組織增生進入血塊中，關閉血管上的孔洞。(Guyton & Hall, 2006; 何敏夫, 2008; 梅林, 2004) 以上的幾個步驟，血小板 9.

(19) 都有其角色，其參與的功能如下: 1. 局部血管收縮：血管被切斷或破裂後，受傷血管所受到的刺激會立刻使血管壁的平滑肌收縮，同時減少血管壁裂口處血液的流失。血管壁的收縮是經由肌肉的痙攣、神經的反射、與受傷組織和血小板的局部因子所造成的，與血小板釋出的血管收縮物質凝血栓素A2 (thromboxan A2)有關。 2. 形成血小板栓塞：在血管上有任何裂口的地方，受傷的血管壁會引起一連串的活化循環，逐漸的增加血小板的數量，這些血小板又會吸引更多的血小板，於是形成了血小板栓塞，以堵住傷口。血小板栓塞可分為沾黏(adhesion)及凝結(aggregation)的反應。當血小板受傷血管表面接觸時，尤其是與血管壁的膠質蛋白纖維接觸，會很戲劇化的立刻改變他們本身的性質。這時的血小板很具有連著性，會經由內皮細胞所分泌的 vW因子，與受傷後暴露在血液的血管內皮內的膠質蛋白緊密相連，並滲入受傷組織中，此步驟稱為血小板的沾黏反應。在沾黏的反應之後，便進入凝集的作用。血小板發生沾黏作用之後，細胞會釋放出ADP，他會開啟血小板之間的橋樑，將相隣的血小板間鍵接在一起，並吸引更多的血小板的聚集，此步驟稱為凝集作用。在凝集作用之後，血小板的數量增多到足以阻塞住小的傷口，形成了血小板栓塞，便逹到初步的止血功能。. 10.

(20) 圖3 血小板栓塞之形成機轉資料來源: http://veraloft.net/tag/platelet-plug-formation/。. 3. 血液凝固成血凝塊，纖維組織進入血塊中，封閉受傷的部位除了血小板栓塞的形成可以防止出血，第三種止血的機轉是形成血凝塊。受傷的血管壁、血小板、以及附著於受傷血管壁上的血液蛋白質，都會提供活化物，共同引發凝血作用的進行。這個凝血的機制分為外在路徑與內在路徑兩種途徑，而血小板在二者均扮演著非常重要的角色。不論是經由內在路徑與外在路徑形成血凝塊，其最終的目的是在將稱為凝血第二因子(factor II)的凝血酶原(prothrombin) 轉化為凝血酶(thrombin)；這個階段的進行，需要足夠的鈣離子及凝血酶活化劑的參與。一旦凝血酶產生之後，便會執行其酶的作用，將凝血第一因子(factor I)的纖維蛋白原(fibrinogen) 轉化為纖維蛋白絲(fibrin fibers)；密密麻麻絲狀的纖維蛋白絲會網住血小板、血球及血漿而形成血塊。這時的血塊密度較大並且較為硬實，血塊的力量較大，可以止傷口再裂開。. 11.

(21) 第四節血小板的活化血小板身負體內修補的作用，其功能十分重要，平時巡行於全身的血管之中，與正常的血管間並無作用，不會吸附在血管內皮之上；這時的血小板處在安定的狀態下，其形狀為扁球形。而血管的內皮細胞也會分泌一氧化氮，防止血小板的附著。當少量的血小板與受傷血管壁的膠原蛋白纖維接觸時，膠原蛋白會令血小板改變他們本身的性質。此時血小板會開始膨脹，成為不規則的形狀。血小板的表面會生出許多放射狀的偽足突起，並釋出許多的內部因子，此少量血小板的形變及內容物的釋出即稱為活化(activation)。活化的血小板細胞將胞內的物質釋出，造成血小板的凝集之後，同時啟動了內、外在路徑而產生大量的凝血酶。凝血酶不但將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白絲，本身更是強有力的血小板活化劑，他能將血凝塊中的血小板大量活化，並釋放出血小板內大量的物質。. A B 圖4：未活化與活化後血小板血球形狀之比較。未活化前(休息態)的血小板(A)呈顆粒狀，其大小較紅血球為小；活化後(B)的血小板則會伸出許多突觸。資料來源： http://www.vet.uga.edu/ivcvm/courses/VPAT5200/01_circulation/hemostasis/hemostasis03.ht ml. 目前已知多種因素可以活化血小板，包括血流的剪力(shear force)(Wurzinger, Opitz, Wolf, & Schmid-Schonbein, 1985)、血管內的膠原蛋白、鈣離子以及凝血酶(Arnoczky & 12.

(22) Sheibani-Rad, 2013)。目前在體外進行血小板活化的研究，主要是以氯化鈣 (CaCl2)(Hamilton et al., 2015)、人類凝血酶(human thrombin)(Su, Chiang, Lai, Lin, & Burnouf, 2004)及牛凝血酶(bovin thrombin)三種作為活化劑，另外第一型膠原蛋白(Type I collagen)也被用於體外血小板活化之研究(Fufa, Shealy, Jacobson, Kevy, & Murray, 2008)。血小板一旦經活化後，其中的生長因子便會被釋放出來。在體外的實驗中，血小板經牛凝血酶活化後的10分鐘內，細胞內70%的生長因子會被釋放，而在1小時內，幾乎100%的生長因子均由血小板內釋出(Arnoczky & Sheibani-Rad, 2013; Bennett & Schultz, 1993a; Marx, 2001)。若以氯化鈣作為活化血小板的活化劑，則血小板會立刻被纖維素所包覆，而在一星期內緩慢釋放出其內的生長因子。因此，單純使用氯化鈣作為血小板的活化劑，則血小板在一小時內釋放的生長因子數量有限，必需等待一星期才能將血小板中的生長因子完全釋出。陽明大學蘇堯教授的經驗，自體人類凝血酶對於血小板活化的效能比牛凝血酶要好，加上牛凝血酶有使用後出血及庫－賈氏症感染的疑慮，使用於人體的PRP製作應以人體自體人類凝血酶較佳(Su et al., 2004)。鈣離子是凝血酶原轉變為凝血酶的重要因子，但作用時尚需要凝血酶原活化劑(prothrombin activator)，而此步驟的速率決定因素在凝血酶活化劑而非鈣離子。因此，人類凝血酶才是在短時間內活化血小板的強力因子 (Guyton & Hall, 2006)。然而人類凝血酶之價格非常昂貴，較牛凝血酶之要價高出甚多，本研究考量研究經費，故採取牛凝血酶加氯化鈣作為活化劑，使血小板在短期間內將大部份之生長因子釋出。. 第五節血小板的生長因子血小板除了凝血功能之外，其細胞內還有含有許促進組織修復的生長因子，這些生長因子能夠在受傷後參與組織的修復。血小板的生長因子主要包含在細胞內的α-顆 13.

(23) 粒裡面，其中最主要的生長因子包括：血小板衍生生長因子（platelet-derivated growth factor，PDGF）、血小板衍生外皮生長因子（platelet-derivated epidermal growth factor， PDEGF）、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉化生長因子 (transforming growth factor, TGF-β)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor 1, IGF-1)、纖維母細胞生長因子(fibroblastic growth factor, FGF)、上皮細胞生長因子 (epidermal growth factor, EGF) 、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)…等等。這些生長因子具有影響細胞的趨化性、及促使細胞移動的能力，並有引導細胞的有絲分裂、細胞外間質產生、及血管新生的能力(Nguyen et al., 2011)，使得他們對於肌腱、靱帶、軟骨、肌肉，有著一定的修復功能。血小板內生長因子的名稱與功能如表1所示。正常的傷口在受傷à止血à血栓形成à血凝塊形成的步驟的同時，纖維蛋白絲會將血小板局限在固定的範圍。與體外實驗時使用活化劑大量地活化血小板後快速釋放出生長因子不同，未經活化的血小板在體內接觸膠原蛋白或鈣離子等，也會因被活化而釋出各種生長因子，但釋放的速度較為緩慢。. 表1、血小板內生長因子及其作用生長因子. 作用. PDGF. 活化巨大細胞(macrophage)及血管生成(angiogenesis) 促進纖維母細胞之趨化(chemotaxis)及增殖(proliferation) 促進膠原蛋白(collagen)之合成促進骨細胞增生. VEGF. 血管增生(angiogenesis) 內皮細胞之移行及分裂製造血管管壁吸引巨大細胞及顆粒細胞經由促進一氧化氮的分泌而促使血管鬆弛 14.

(24) TGF-β. 促進纖維母細胞的增殖能力刺激第1型膠原蛋白(type 1 collagen)及纖維蛋白網質(fibronectin)之生物合成強化第1型及第3型膠原蛋白產生腱鞘強化肌腱修復時之機械力誘發蝕骨細胞(osteoclast)生成及骨吸收誘發骨基質(bone matrix)之積沉(deposit) 調節肌細胞增殖與纖維間之作用刺激未分化間質細胞 (undifferentiated mechenchymal cell)增殖刺激內皮細胞之化學趨向性抑制巨大細胞增殖在細胞發炎期具免疫抑制功能. IGF-1. 吸引纖維母細胞並刺激蛋白質合成促進成骨細胞(osteoblast)之增殖及分化，促使骨形成調整骨骼肌之生長及修復參與發炎反應早期. FGF. 刺激血管新生之作用幫助調整細胞移動刺激微血管內皮細胞增殖影響纖維母細胞產生膠原蛋白促進肉芽組織(granulation tissue)之生成促進肌肉細胞生成. PDEGF. 刺激表皮纖維母細胞及角化細胞(keratinocyte)的生成，進而促進傷口癒合. EGF. 促進細胞增殖促進上皮細胞(epithelial cell)分化. HGF. 刺激肝臟細胞增殖及肝組織再生 15.

(25) 血管增生上皮細胞之有絲分裂原抗纖維化. (Ahmad et al., 2012; Middleton et al., 2012; Nguyen et al., 2011). 第六節富含血小板血漿與其製作所謂「富含血小板血漿」(PRP)，即含有血小板數量較多的血漿，而這種血漿是經由抽取人體自身的血液所製成的，因此又稱為「自體富含血小板血漿」。由於血球的組成與比重的不同，全血經過適當的離心之後會將血液大致分為三層。紅色的紅血球會在最底層, 而淡黃色的血漿會在上層。淡黃色的血漿又可分為位於下層血小板含量較多的富含血小板血漿，以及位於上層且含血小板較小的「血小板稀少血漿」 (platelet-poor plasma，PPP)。富含血小板血漿的定義是：血漿中的血小板濃度大於全血中的血小板濃度，此血漿即為PRP。目前對於PRP的定義，並沒有限定在血漿中小板的濃度需為全血中的多少倍才能算是PRP。一般而言PRP中血小板的濃度大約為全血中的 3-8倍(Nguyen et al., 2011)，但是目前對PRP中血小板的定義是較為模糊的，而各家廠商所做製作出的PRP商品，其血小板濃度的高低及內含白血球數量的多寡差異頗大 (Mazzocca, McCarthy, Chowaniec, Cote, et al., 2012; Russell, Apostolakos, Hirose, Cote, & Mazzocca, 2013)。 PRP的製作隨各廠家的製作方法及處理用劑而有所不同，但不外乎是在血液中加入抗凝血成分後，以預設的離速度興離心時間將紅血球及血漿分離，取出離心後的PRP，再將活化後或未經活化的PRP注入體內欲修補之患處（圖3）。根據不同廠家的商品，抽取的血量由10至100 cc不等，製出的PRP也因製作方式及抽取血量而有不同的濃度及體積。離心的次數分為一次離心與二次離心等方法，但目前何者較優則尚未有定論。. 16.

(26) 步驟一：消毒後抽血. 步驟二：將抽取之血液注入無菌的離心管後（PRP儲存器），與抗凝劑充份混合。. 步驟三：置入離心機內離心。試管中上層淡黃色為PRP及PPP，下層為紅色的紅血球。. 步驟四：利用長針，將淡黃色血漿之下層，亦即PRP層抽出。. 步驟五：所得之PRP可注入體內。. 圖5、市售PRP製作流程示意圖。圖片來源：Regenlab妮傲絲翠股份有限公司根據不同的廠家所建議，抽取的血液在處理過程中，其離心的次數有所不同，所 17.

(27) 製作出的PRP濃度及血漿中白血球成分比例均有所差異(Castillo, Pouliot, Kim, & Dragoo, 2011; Mazzocca, McCarthy, Chowaniec, Cote, et al., 2012; Mazzucco, Balbo, Cattana, Guaschino, & Borzini, 2009)。本節就製作過程中之步驟分別予以探討如下，並說明本研究採用方式之考量： 1. 抗凝血劑：抽取自人體的血液需要事先加入抗凝血劑，以避免血液在開始實驗之前便已凝集，妨礙下一步的實驗進行。不加入抗凝血若，則血液會在30秒至數分鐘內開始凝集。目前已知有許多種抗凝血劑，但可以支持血小板的代謝需求並在分離血小板的過程中不致損傷血球的只有Anticoagulant Citrate Dextrose Solution-A (ACD-A) 及citrate phosphate dextrose兩種(Marx, 2001)，其功能可以與血中的鈣離子結合，防止進一步的凝血機轉。本研究採用ACD-A作為抗凝血劑，主要因為其商品取得容易且為多數學者採用。 2.. 抽血量：根據不同廠家所建議，製作PRP時之採血量為10-100 cc 不等，當然所製得之PRP量也有所不同。目前市售ACD-A試管之容量為8 cc，考量受試者之接受度、實驗的需求及採血之一致性，本研究單次採血以抽取四支ACD-A試管血量(即32 cc) 進行研究。. 3.. 離心時間與轉速：Mazzocca (2012) 等人比較三種不同的商品，檢驗其離心後所產生的PRP產物，發覺以3200 rpm 離心15分鐘所得的血小板及生長因子量，均明顯高於其他兩種以1500 rpm 離心5分鐘之後所得的產品。然而在此研究中，影響血小板量的因素包括轉速與離心時間，無法得知究竟何者影響較大。本研究為避免血小板的破壞，影響實驗結果，故採用1100 rpm的轉速進行第一次離心20分鐘，再以2500 rpm 進行第二、三次離心5分鐘，以提高PRP中血小板量。. 4. 離心次數：目前一般PRP的商品製作分為一次離心與二次離心兩種方法。一次離心的方法即以單次離心後，上層之淡黃色血漿作為研究，有產品取上層血槳中之濃稠部份(buffy coat)作為施打的PRP血漿，而另一些產品則以全部的上層血漿作為PRP 施打入患處。研究顯示二次離心所得之PRP量並未比單次離心所得之血小板數或生 18.

(28) 長因子濃度為高(Mazzocca, McCarthy, Chowaniec, Cote, et al., 2012)；然而，本研究為避免血球的破壞，決定採用三次離心的方法分離血小板。第一次離心以低速(1100 rpm)離心20分鐘後，除去紅血球後取出上清液；第二次離心則以高速(2500 rpm)離心5分鐘，將上清液分離出PRP 與PPP, 再將PPP做第三次離心5分鐘，取得其底層之血漿加入第二次離心之PRP產品中。 5. 血小板的活化方式：根據Bennett指出(Bennett & Schultz, 1993b)，經凝血酶活化後的血小板在1小時內會將幾乎全數的生長因子釋出，但血小板在其仍存活期間，仍然會繼續緩慢釋出少量的生長因子。本研究設計是在運動後抽取血液，在短時間內測量生長因子的濃度，因此採用人類凝血酶作為活化劑。受試者的PRP經活化後仍置於血漿之中，於靜置24小時後存放於－80 ℃環境中保存，等待測量生長因子。 6. 生長因子的測量： PRP中有多種生長因子存在，其中最重要的生長因子如表1所示。本研究參考目前所收集有關PRP對於肌肉軟組織傷害修復之研究，並考量研究經費之支出，以IGF-1、PDGF-AB、VEGF及TGF-β四種生長因子做為研究項目。FGF 的作用因為與IGF-1之功能較為類似，大多作用在肌肉細胞為主，因研究經費之考量，不列入本次研究中。至於其他生長因子，則因目前相關之研究較少(PDEGF)或與最常被研究的VEGF功能相近(EGF與HGF)，限於經費有限並未於本次研究中一併加入測量。. 第七節 PRP對組織修復的影響。 PRP最早被應用於臨床目的是在1987年，義大利的心臟外科醫師Farrari將PRP應用於手術中，其目的並非使用PRP中的生長因子進行修補，而是利用PRP減少心臟外科手術中輸血的需求(Ferrari et al., 1987)。1994年Tayapongsak等人在33位口腔患者手術中，植入含有血小板的植入物 (當時稱之為autologous fibrin adhessive, AFA), 結果發現骨骼的癒合提早了50%(Tayapongsak, O'Brien, Monteiro, & Arceo-Diaz, 1994) ；1998年，Mark 19.

(29) 等人在口腔手術中使用PRP，發覺植入PRP後的患者，在X光下可見其骨骼成熟幅度較未植入PRP的患者多了1.62-2.16 倍，因此認為PRP中的生長因子對於口腔手術後之骨骼生長有十分大的幫助(Marx et al., 1998)。其後，PRP應用於醫學的論文便日趨增多。 PRP 對於組織的修復作用，一般認為經由的途徑包括：經由血小板釋放α-顆粒內的生長因子而產生細胞的修復，或是PRP內白血球的細胞激素(cytokine)作用(Park, Yang, & Chung, 2011; Saucedo, Yaffe, Berschback, Hsu, & Kalainov, 2012), 引發後續的發炎、細胞召集等作用。由於離心後所產生的血小板較正常生理濃度為大(Middleton et al., 2012; Saucedo et al., 2012)，PRP對局部的病灶產生作用的功能遠大於人體自然的修補作用。過去的十多年來，研究學者已發表了許多PRP對於受傷組織效果的研究論文。其中許多研究對PRP的效果仍有質疑，但也有不少報導指出PRP對於軟組織傷害的修復有明顯助益，其中尤其以運動傷害的研究最常被報導。2012年Sheth等人針對PRP對於14 種軟組織傷害的統合分析，認為目前大部份論文的研究方式、PRP製作方式、及效果評估方式並未統一，以致無法從中確認PRP對軟組織傷害的修補效果(Sheth et al., 2012)。即便如此，目前在臨床上使用PRP治療軟組織的應用日益增多，患者投入治療的花費也比以往更多；尤其在台灣，近年來PRP的使用頻率較以往增加甚多，因此有必要更深入進行PRP 的基礎研究。在肌腱與韌帶的修補方面，Yuan在其論文中指出(Yuan et al., 2013)，PRP對於肌腱與韌帶的修補功能主要作用在纖維母細胞與膠原蛋白(fibrobast and collagen)、肌腱幹細胞與源祖細胞(tendon stem/progenitor cells )及血管增生(angiogenesis)效果，致使肌腱的修補並增強其抗拉力強度。Fallouh (Fallouh et al., 2010)將手術患者之前十字韌帶在體外以培養，發覺加入PRP 之十字韌帶之細胞存活率及膠原蛋白之生成量均優於加入PPP之十字韌帶。在肌肉方面，Menetray以IGF-1、b-FGF及NGF(nerve growth factor)三種生長激素注射到老鼠肌肉內，發覺在IGF-1及b-FGF注射後，實驗組老鼠肌肉不論在快速收縮(fast 20.

(30) twitch) 與強直力量(tetanus strength)的收縮力較對照組均有增強(Menetrey et al., 2000)。他認為實驗組肌力的增強與生長因子刺激肌纖維的再生有關。肌纖維的再生與肌源性前趨細胞(myogenic precursor cells)或衛星細胞(satellite cells)的活化有關(Huard, Verreault, Roy, Tremblay, & Tremblay, 1994)，而PRP中的生長因子IGF-1即參與此反應。 Kasemkijwattana在其論文中指出，FGF、IGF及NGF與肌肉的修補均有關係，他認為以生長因子治療肌肉的拉傷(muscle strain)應是未來的方向。. 表 2、生長因子對軟組織之功效組織. 作用. 肌腱. 促進細胞基質內基因表現，促進肌腱細胞分化，合成促血管素與其他生長因子活化循環衍生細胞增加血管新生與代謝活力增進肌腱強度. 韌帶. 促進組織學及生物學的性質. 軟骨. 減少軟骨纖維化及滑液膜的增生及出血加速軟骨細胞擴展強化幹細胞的增殖及軟骨細胞分化. 肌肉. 加速衛星細胞的活化增加修復後纖維的直徑刺激肌細胞的生成加速肌肉拉傷後的回復時間. 21.

(31) 第八節運動對血小板數量的影響血液中血小板的數量可以因為外在的影響而有所變化，其中運動的因素是常被討論的項目之一。據研究，單次運動後，血中血小板的數量會明顯增加，而血小板數量的上升與血液中其他血球數目的變化量不成比例(Davis, Abildgaard, Bernauer, & Britton, 1976)；運動後血小板增加的幅度視運動的形態與強度以及受試者族而有所不同（表3）。. 表3、不同運動型態與強度之血小板數量變化作者. 年份. 運動型態. 運動強度. 血小板. 參與. 平均年. 增加量. 人數. 齡(歲). 42. 41.1. 受試者特性. （％） Lamprecht. 2013. Walk. 70 % VO2max. 7.5. ♀obesity /overweight. Whittaker. 2012. Ergometer. 80% VO2max. 23.9. 12. 22.7. ♂. Sossdorf. 2011. Bicycle. 80% AIT, 90 min. 18.5~. 16. 25. ♂. 22.6 Lobardi. 2011. Cold. 150 m , <6℃. 25. ♂: 12. 14. ♀: 2. swimming Chaar. 2011. Bicycle. 70 rpm to VO2. ↓. 7. 19.8. ♂. ♂. max Hanke. Lippi. 2010. 2010. 1. Marathon. 42 km. 19.5. 24. 43. 2. Triathlon. 2.5+90+21km. 16.4. 22. 36. 3. Cycling. 151 km. ↓. 22. 41.7. Half marathon. 21 km. 27. 17. 47. ♂healthy trained. Li. Ersoz. 2007. 2002. Computerized. Borg gr. 20 to. cycle. exhaust,. ergometer. ~ 24 min. UE ergometer. 75 % MHR. 33.2. 21. 30. ♂. 20.1. 24. 19.5. ♂. 6. 16. 19-24. ♀. 15 min Ersoz. 2002. Bicycle. 50 rpm to 75 % MHR. midfollicular. 15 min. /midlutral phase 22.

(32) (Chaar et al., 2011; Ersoz, Zergeroglu, Ficicilar, et al., 2002; Ersoz, Zergeroglu, & Yakaryilmaz, 2002; Hanke et al., 2010; Lamprecht et al., 2013; Li, He, Blomback, & Hjemdahl, 2007; Lippi et al., 2010; Lombardi, Ricci, & Banfi, 2011; Sossdorf, Otto, Claus, Gabriel, & Losche, 2011; Whittaker, Linden, & Coffey, 2013). 由表3 可見，隨著不同的運動形式、運動強度、受試者族群，血小板數量上升之比率亦有所不同。綜觀表3中，各研究之受試者之年齡差異頗大，由19歲至47歲不等；而運動種類包含走路、自行車、游泳、鐵人三項、馬拉松運動…⋯等，大部份的運動均使血中血小板濃度上升。然而在Chaar (2011) 的自行車運動及Hanke (2010)的150公里自行車運動後，受試者血中血小板的濃度卻不增反減。在Chaar的研究中，受試者進行三次腳踏車運動，每次運動以60W的強度為起始強度，每分鐘增加30W，直至最大預估心跳率即減速，而每次運動之間則有10 分鐘的休息時間。Chaar的運動測驗方式在達到最大估計心跳率後即不再維持運動強度，是否因強度不足或運動時間較短而影響血小板的釋出，值得進一步研究。而在Hanke (2011) 的研究中指出，受試者在馬拉松及鐵人三項運動後，血小板的濃度分別上升了19.5%及16.4%，然而在151公里的自行車運動後血小板的濃度卻不升反降。自行車運動後血小板不升降的原因，是否因為在行進間可以令雙腿短暫休息並使自行車滑行所致？或因為自行車運動時較無身體震動及重心上下位移的變化所致？實需進一步的研究。至於運動後血小板濃度上升的原因為何？值得進一步探討。人體血循中，約有三分之一的血小板是儲存在脾臟中而不在血管中流動(Susan, 2014)。Bakovic的研究發現，血管內注射低劑量腎上腺素後會造成脾臟的收縮而使脾臟中的血小板排出，導致血液中血小板濃度上升31%(Bakovic et al., 2013)。在劇烈運動後，由於腎上腺素的分泌造成脾臟等器官的收縮，血小板會由脾臟、骨髓中被釋出(El-Sayed, Ali, & El-Sayed Ali, 2005)。此外，肺臟的血管系統也可能是血小板暫時儲存的地點(Freedman, Altszuler, & Karpatkin, 1977)，運動後血小板可由肺臟血管床中釋放到體循環系統(Bierman et al., 1952)。Komassi 認為，運動後血小板濃度的上升與運動強度有關，而與運動的時間長短較為無關(Comassi 23.

(33) et al., 2015)。這些運動後迅速增加的血小板約有55%由脾臟中被釋放，而16 – 45 %是由脾臟之外的器官而來(Freedman et al., 1977; Susan, 2014)，他們的體積較大，而且被認為是較年輕的血小板細胞，但也有作者持反對的意見(Schmidt & Rasmussen, 1984)；目前尚未知這些運動後增加的血小板之特性，也無法得知這種可能為年輕的血小板中所含生長因子較其他血小板的多寡。除了血小板數量的增加之外，Peatfield等人也發覺，在大於 85%最大心跳率的運動之後，血小板的體積也有小幅的上升現象(Peatfield, Gawel, Clifford-Rose, Guthrie, & Pearson, 1985)。此外，由表3中可知，不同形態及不同強度的運動，在運動前後血液中血小板濃度亦有所不同。本研究以不同強度運動後所抽取的血液做為研究，可做為日後運動之參考。. 第九節. 運動對PRP中生長因子濃度之影響. 既然運動後血小板數量會有所增加，那麼所製造出來的PRP中的血小板理應也隨之增加。然而，運動後所增加的血小板是由脾臟等器官所釋出的，這些血小板可能屬於較年輕的細胞；而血小板細胞內的α-顆粒乃由脫離巨核球前由巨核球分泌而來，越年輕的細胞內α-顆粒是否含有越豐富的生長因子尚未可知。假設年輕的血小板比一般血小板含有更多的生長因子，那麼運動後所生成的生長因子濃度應該比血小板濃度的增加比例更高。然而，這些運動後所增加的血小板，尤其是仍未真正進入血循中的血小板，其細胞中α顆粒內的生長因子究竟是尚未製造完成？抑或是年輕的血小板細胞具有更旺盛生長因子？尚未有研究探討過。截至目前為止，只有一篇論文曾經探討此一問題。2015年Hamilton等人的研究指出，跟據其對10名平均年齡為34.4歲的高加索人進行運動測試，運動強度為50%最大動力輸出(peak power output)，運動時間1小時後，其血小板數量並未上升，而其PRP中的生長因子濃度在運動後不但未有上升，反而在PDGF及VEGF有明顯的下降。作者因此推估，運動可能會妨礙生長因子由血小板的釋出。此結果與本研究之假設不符(Hamilton et 24.

(34) al., 2015)。綜觀本研究之設計，作者採用之運動強度為50%最大動力輸出，其運動強度可能不足以使血小板增加，因此所測得之生因子濃度並未上升。另外，Hamilton 所採用的運動時間為一小時，運動的時間較長，是否會影響研究的結果亦未可知。作者所採用氯化鈣為唯一的活化劑為，而氯化鈣活化血小板的較果較凝血酶緩慢，是否因此無法將運動後的生長因子釋出亦未可知。查閱pubmed資料庫，再無其他論文討論運動前後PRP 中生長因子的多寡。. 第十節. 本章總結. 在運動傷害的情況中，骨骼肌肉的傷害是非常見的。除了骨折和大量出血意外，傷害最常見的就是肌肉、肌腱和韌帶的受傷。運動員常常因為意外的發生造成損傷而縮短運動上場的時間，甚至減短其運動生命。許多的肌肉骨骼傷害可以經過醫師的治療而痊癒，但是傷害往往會留下很多後遺症。因此，傷害的修復便十分重要。血小板中的 α-顆粒內含有多種生長因子，包括類胰島素的生長因子、血小板衍生生長因子、血管內皮生長因子等，都可以促進細胞的修補，協助傷口的癒合。全血經離心後取得的 PRP，其血小板濃度較全血中為高，可被運用於受傷組織的修復之用。單次運動後可以使血中血小板的濃度提高約 6%~33.2%，但此提高濃度的血小板是否同時也能夠製作出更高濃度的生長因子，目前尚無定論。本研究的目的便是希望經由運動，提高血液中血小板的濃度，以期使 PRP 中血小板的濃度也同步提高，進而提升生長因子的濃度。. 25.

(35) 第參章. 研究方法. 本章針對研究對象、實驗設計與方法、及統計分析進行敍述，並說明本研究之預期結果。. 第一節、研究對象納入條件：本研究收集自願參與研究之健康成年男性共 15 位。排除條件：有以下之狀況事先排除於本研究之外： 1.. 下肢曾有嚴重受傷者. 2.. 患有血小板功能疾病, 或血小板數目<105/µL. 3.. 貧血（血色素<10 g/dl）. 4.. 服用抗凝血藥物製劑者. 5.. 敗血症，血液動力學不穩者. 6.. 48 小時內曾服用或注射非類固醇性消炎止痛藥者. 7.. 兩週內曾使用類固醇藥物者. 8.. 目前有發燒症狀者或病毒感染症狀者. 第二節、實驗設計與方法本研究經由採取受試者運動前後血液，測得全血及PRP中血小板濃度，探討不同強度運動前後血小板增減的幅度與生長因子濃度的變化。一、受試者運動及抽血： (一) 每位試者均接受兩次運動測試，兩次測試之間相隔一星期。第一次測試以中等運動強度，第二次運動測試為高強度運動測試 26.

(36) (二) 受試者於測試前 24 小時內不可做任何有氧運動或阻力運動，以排除運動累積效果。 (三) 所有運動測試的時間均於上午 8：00 ~ 12:00 之間。 (四) 受試者身著適當之運動服裝進行測試。所有受試者均簽署同意書，測量其身高、體重、安靜心跳率等基本資料後，於受試場地靜坐 30 分鐘。 (五) 開始運動前，由研究團隊對受試者抽取 32 cc 血液(8ml ACD-A 採血管 x 4 管，共 32 cc) ，及 CBC 管 2 cc，共計 34 cc。 (六) 受試者以血氧含量及心率監測器夾住手指以監測心跳速率。本研究以 220-受試者年齡為受試者之估計最大心跳率，並以儲備心跳率（Heart Rate Reserve , HRR）做為運動強度之指標。 1.. 中等強度運動（50％ HRR）：以受試者之安靜心跳率+ (估計最大心跳率 - 安靜心跳率) x 50% 做為中等強度運動之心跳率目標值。. 2.. 高強度運動（85 ％ HRR）：以受試者之安靜心跳率+ (估計最大心跳率安靜心跳率) x 85% 做為高強度運動之心跳率目標值。. (七) 受試者於跑步機上，以每小時 4-6 公里之起始速度開始跑步，跑步期間視心跳數隨時調整跑步速度以符合本次測試之目標心跳數。受試者於運動測試的前 10 分鐘內以快走作為暖身，第 10 分鐘後跑步加速至目標心跳率，並隨時調整跑步速度維持心跳率，直到運動測試結束。 (八) 開始測試 25 分鐘時開始測量血壓，並於跑步 30 分鐘運動測試結束時立刻抽血 34 cc。 (九) 受試者於運動測試期間可視需要任意飲水。 (十) 受試者受試流程如下： à 受試者報到 à 受試者靜坐休息 30 分鐘，並填寫基本資料及受試者同意書。 à 運動前採血 34cc 並計錄血壓、心跳率。 27.

(37) à 開始運動，前 10 分鐘以快走為暖身運動，後 20 分鐘依當次試驗設定之強度跑步至目標心跳率後，維持至測驗結束＞ à 第 25 分鐘測量並計錄血壓及心跳。 à 第 30 分鐘結束跑步，立刻抽血 34cc，完成患者之測試流程。二、實驗室研究： (一) 每次運動前後之血液於運動測試完成後立刻送驗。 (二) 其中 2 cc 之 CBC 管血液檢驗全血中血小板的濃度，其餘 32 cc 之 ACD-A 管血液作為離心製作 PRP 之用。 (三) 將 ACD-A 管中 32 cc 血液分裝於兩個離心管中置入離心機，以 1100 RPM 離心 20 分鐘，抽出離心後之血漿置入另一試管，再將血漿以 2500 RPM 離心 5 分鐘，取出底層含血小板之液體後，將殘存之上清液再以 2500RPM 離心 5 分鐘，將底層含血小板之血漿抽出，併入前次抽出富含血小板之血漿中。 (四) 所有血液經離心分離為 PRP 與 PPP 後，取出部份做為血球之分析，其餘血漿均加入活化劑 bovin thrombin 及 CaCl2。加入活化劑後之血漿放置在桌面上於攝氏 37 度境下靜置 1 小時，待充分活化後置入攝氏 -80 度之冰箱中保存。 (五) 將分離出的 PRP 酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 方式檢測其中生長因子之濃度。本研究測量之生長因子來源為離心後所取得的 PRP 及 PPP。欲測量之生長因子根據參考的文獻，以最常被研究者所測量、並與肌肉軟組織的修復有直接關係的四種生長因子作為研究標的，包括 IGF-1、PDGF-AB、VEGF、TGF-β。 (六) 本研究借助馬偕醫院淡水院區共同實驗室之研究人員與儀器設備完成實驗室之研究部份。實驗室操作如下圖所示：. 28.

(38) 全血第一次離心，設定轉速與時間為1100轉，20 分鐘。. 第一次離心後血球與血漿分離。上層為血漿，下層為紅血球。. 抽取上層血漿，將下層紅血球去除。. 將上層血漿以2500 RPM，每次5分鐘進行第二次及第三次離心。. 離心後PRP位於試管底部。. 取出後並活化後之PRP。血小板活化後凝結成塊，生長因子釋放至血漿中，檢測生長因子時取血漿進行測定。. 29.

(39) 以ELISA進行生長因子濃度之檢測。. 圖 6: 本研究實驗室 PRP 之製作與生長因子之檢測. 第三節、統計分析本研究之統計分析各種生長因子於運動前後之濃度比較，使用IBM SPSS Data Collection進行二因子變異數分析，檢定運動前後及運動強度對全血及PRP中血小板濃度的交互作用，並以Microsoft Office for Mac 2011之Excel軟體，進行paired t-test 比較各項數據的組間差異，設定P<0.05為統計上有意義之差別。比較的項目包括：一、比較中等強度運動前後血小板及四種生長因子濃度之差異二、比較高強度運動前後血小板及四種生長因子濃度之差異三、比較中等強度與高強度運動後血小板及四種生長因子濃度之差異. 第四節、預期結果一、本研究預期運動後之血小板數量比較運動前上升，高強度運動組上升之比例較中等強度組為多。二、運動後之生長因子濃度與血小板同時上升，但各種生長因子上升幅度並不相同。. 30.

(40) 第肆章. 結果. 本章說明受試者基本資料、受試者運動前後之生理數據、運動前後全血中血球數、 PRP 中血小板及生長因子濃度與生長因子量，其數據分別列於表 4 ~表 15。本研究經 2014 年馬偕紀念醫院醫學研究部專題研究計劃申請案過過，補助一般型研究，院內計劃編號為 MMH104-098（附錄一）。本研究計劃經馬偕紀念醫院人體研究倫理審查委員會審查通過後進行，通過編號為 15MMHIS017（附錄二）。所有受試者均簽署馬偕紀念醫院人體研究倫理審查會所通過之受試者同意書（附錄三），並且均完成兩次測試。受試期間所有受測者除呼吸、心跳加速，感覺運動後疲勞外，並未出現任何併發症狀。. 第一節、受試者基本資料本研究共招募 15 位平均年齡為 20-45 歲之符合條件男性志願者，受試者均無規律運動習慣，並已排除前述八項排除條件。受試者基本生理資料如表 4。. 表 4、受試者基本資料身高 (cm). 173.4 ± 4.8. 體重 (kg). 73.5 ± 11.7. 身體質量指數(BMI). 24.4 ± 3.2. 年齡(歲). 31.9 ± 5.2. 中等強度運動之目標心跳數(次/分鐘). 131.2 ± 3.7. 高強度運動之目標心跳數(次/分鐘). 171.5 ± 3.8. 31.

(41) 第二節、實驗數據本研究每位受試者均接受兩次運動測試，分別為中等強度及高強度運動，兩次測驗時間相隔一周。每位受試者於測驗前一日均未進行任何中等強度以上之運動，未飲用咖啡及含酒精之飲料，並有充份睡眠，測驗前均有 30 分鐘休息時間。. 4.2.1 兩次運動前後之生理數據變化受試者運動前後血壓之平均收縮壓及運動最後五分鐘時所計錄之運動自覺量表 (Borg Rate of Perceived Exertion Scale，附錄四)分數如表 5。血壓之量法在安靜時為受試者抽血前靜坐 30 分鐘後之血壓，而運動後之血壓量法為運動結束前 3-5 鐘時在跑步機上量測所得。中等強度與高強度運動後收縮壓較運動前增高，且與運動前有明顯差異 (p<0.05)，而高強度運動後平均血壓明顯高於中等運動後之血壓。心跳率部份則與血壓相同，中等強度與高強度之運動後心跳率均有明顯上升(p<0.05)，而高強度運動後心跳率明顯高於中等運動後之心跳率(p<0.05)。運動自覺量表部份，高強度運動之 Borg Rate of Perceived Exertion Scale 明顯高於中等運動後(p<0.05)。. 表 5、運動前後之生理數據 p 值. 中等強度運動. 高強度運動. 運動前. 119.1 ± 9.4. 114.9 ± 8.9. 0.241. 運動後. 150.5 ± 7.6 *. 158.1 ± 7.6 *. 0.026. 運動前. 74.2 ± 7.5. 77.0 ± 10.0. 0.865. 運動後. 131.2 ± 3.7 *. 171.5 ± 3.8 *. < 0.001. 11.2 ± 0.4. 15.7 ± 0.7. < 0.001. 收縮壓 (mm Hg). 心跳率 (beat / min). 運動自覺量表. * 表單次運動前後之比較，p 值< 0.05 32.

(42) 4.2.2. 兩次測驗運動前後所採全血生理檢測數據兩次運動前、後之抽血量均無明顯差異，兩次測驗之運動前血小板、紅血球及白. 血球濃度均無明顯差異，而運動後不論血小板、紅血球及白血球濃度均有提高。高強度運動後三者濃度上升之程度均較中等強度運動為多。每次採血量、血小板濃度、紅血球濃度及白血球濃度如表 6 所示。本研究以 IBM SPSS Data Collection 軟體對全血中血小板濃度進行二因子變異數分析，發現運動前後（因子 1）與運動強度（因子 2）對全血中血小板的濃度並無交互作用（p>0.05，附錄五）。. 表 6、運動前後全血之生理檢測數據中等強度運動. 高強度運動. p 值. 平均採血量(ml) 運動前. 30.18 ± 1.02. 29.87 ± 3.05. 0.279. 運動後. 30.46 ± 1.22. 29.01 ± 2.89. 0.393. 運動前. 232.07 ± 34.49. 234.40 ± 36.09. 0.489. 運動後. 246.27 ±35.65. 276.80 ± 39.41. < 0.001. 增減率(%). 6.12 *. 18.09 *. < 0.001. 運動前. 4.84 ± 0.27. 4.79 ± 0.29. 0.108. 運動後. 4.91 ± 0.27. 5.08 ± 0.27. < 0.001. 增減率(%). 1.59 *. 6.00 *. < 0.001. 運動前. 5.70 ± 0.85. 5.60 ± 0.99. 0.593. 運動後. 6.30 ± 0.82. 8.31 ± 1.43. < 0.001. 增減率(%). 10.53 *. 48.33 *. < 0.001. 3. 血小板濃度(10 /ul). 6. 紅血球濃度(10 /ul). 3. 白血球濃度(10 /ul). 33.