行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
子計畫六:肺正常和癌症組織中的轉移酵素表現和受
curcumin 的影響(1/3)
計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC93-2745-B-039-003-URD 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 中國醫藥大學微生物學科 計畫主持人： 鍾景光 共同主持人： 張建國 計畫參與人員： 鍾景光.張建國.陳柔亘；.楊鈞隆.黃宣榜 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 94 年 5 月 26 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
□ 成 果 報 告
V 期中進度報告
提昇私校研發能量專案計畫-癌症的基礎與臨床研究-子計畫六:肺
正常和癌症組織中的轉移酵素表現和受 curcumin 的影響(1/3)
計畫類別：□ 個別型計畫 V 整合型計畫
計畫編號：NSC
93-2745-B-039-003-URD
執行期間： 2004 年 8 月 1 日至 2005 年 7 月 31 日
計畫主持人： 鍾景光
共同主持人：張建國
計畫參與人員： 陳柔亘(研究生)、楊鈞隆(研究生)、黃宣榜(大學生)
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：V 精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計畫
及下列情形者外，得立即公開查詢
□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：中國醫藥大學微生物學科/中國醫藥大學醫學研究所
中 華 民 國 94 年 5 月 26 日
中文摘要 關鍵詞：、MMPs、TIMP、侵入轉移、curcumin 肺的正常主織和癌主織主織中基質轉移酶的表現和受到 curcumin 的影響 很多癌細胞匯轉移到其他器官，造成這些器官形成變異的腫瘤，這現象稱為癌細的入侵和轉移。 在人類很多的癌症中 Matrix Metalloproteinase (MMPs)已經被證實可能為癌細胞的入侵和轉移其他組 織的媒介者，基質轉移酶被合成 e-酶之後接著被分泌進入細胞基質或插入細胞質上作為先前酶後再由 移去先前脂解才能成為活性酶。MMPs 和其組織內的抑制劑(Tissues inhibitors of metalloproteinase: TIMPs)同時調節細胞外和其他組織的包外蛋白質，這些因子如細胞生長因子和其接受器，然後這些相 關基因(MMPs 和 TIMPs)的改變普遍發生於大多數的癌症中。肺癌是台灣國人男性和女性最主要制死因 子之一，由於缺乏完整的報導有關國人肺正常和癌組織中 MMP 和 TIMP 這些基因的表現，本計劃的目的 就是去檢測肺正常和癌症組織中檢測 MMPs 及 TIMPs 及其基因的表現有無異常和相關蛋白質的量有否改 變同時也利用體外(In Vitro)和體內(In Vivo)這些轉移相關酵素是否受 Curcumin 的影響。因為文獻 已經報導有很多藥劑促進這些基因的表現，我們利用定量 PCR 及 DNA 定序來找出相關基因的表現並利 用統計分析來檢測肺癌細胞轉移與這些基因的關聯性。我們利用流式細胞儀(Flow cytometry)和西方 墨點法(Western blotting)分析及定量癌細胞轉移酵素(MMPs 和 TIMPs)的情形。指出相關基因是否受 Curcumin 影響而抑制肺癌細胞在體內的轉移。
英文摘要
Keywords： Matrix metalloproteinase (MMPs), tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), invasion, metastasis, curcumin.
Summary
Many cancer cells are able to migrate to other organs then to cause malignant tumors in these organs were called invasion and metastasis. A group of matrix metalloproteinases (MMPs) have been implicated as possible mediates of invasion and metastasis in some cancers. MMPs are synthesized a e-enzyme and are secreted into the extracellular matrix or inserted into the plasma memberane on pro-enzyme upon the proteolytic remoral of prepeptide. It is well documented that MMPs and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) regulate proteolysis of the extracellular matrix and other extracellular proteins, including growth factors and their receptors. However, the aberrant expression of these genes (MMPs and TIMPs) is common in most cancers. Lung cancer is one of major death for man and women in Taiwan. There is no available information to address these genes expression and effects in lung normal and cancer tissues from Chinese population in Taiwan. Our objective of this proposal is to investigate MMPs, TIMPs and both associaten genes with proteins were constitutely expressed in lung normal and cancer tissues. We also use curcumin for selecting agent to examine the effects of curcumin on MMPs and TIMPs in in vitro and in vivo. It is well known those that could be up-regulated by a number of agents known to effect MMP and TIMP expression in other cell systems. Therefore, we will profile the RNA and proteins levels of MMP and TIMP in lung normal and cancer tissues using quantitative PCR, Western blotting and flow cytometry, with the aim of identifying novel expression patterns, potential bi-directional relationship and effects of curcumin on RNA and protein levels that enhance lung tumor aggressiveness and metastasis.
（一） 近五年內主要研究成果說明。（連續性計畫申請時，應檢附上年度研究進度報告）
本人過去 5 年中研究有關人類各種癌組織及相關癌細胞株中 N-acetyltransferase 的表現、活 性、基因表現、差異及受中草藥及成份的影響，同時也檢測微生物如細菌和黴菌等此酵素的表 現及受中草藥成份的影響。
經由利用 Flow cytomety Western blotting 和 PCR 、 DDRT PCR、M PCR、Immunnobloting、 cDNA 晶片等方法來作實驗。同時也檢測中草藥對癌細胞株的影響（細胞毒性、細胞增生、細胞 週期和相關週期的停滯(cell cycle wrest)、細胞計劃性死亡，其相關基因的表現及相關訊號 傳遞之路線包含相關蛋白及該基因的表現）、mRNA 等，這些結果已發表在國外 SCI 雜誌中最近發 表有關 Baicalenin 引起人類血癌細胞計劃性死亡及相關機轉【1】。最近也由上面敘述的方法研 究人類肺癌組織因而找到新的蛋白酶在肺癌細胞膜之表面與該癌細胞之訊息傳遞(Signal Transduction)有相關聯，這結果刊登於 Cancer Research 的雜誌中【2】，因而受到各國學著的 重視，目前仍在持續研究最近更發現此蛋白與肺癌細胞的抗藥訊號傳遞有關聯，此種新的相關 路線，其他學著未有任何報導，因而已在重複檢測中，不久將來將可發表於國外知名雜誌。最 近更收邀擔任國際 SCI 雜誌 In Vivo 的編輯委員，目前也同時積極進行癌症細胞轉移 (Metastasis)的機制及無相關訊息傳遞造成轉移及相關基因表現的研究，因而提出本研究計劃 檢測國人肺正常和癌主織中轉移酵素的分佈和能受到 curcumin 的影響因而找出抑制轉移的機 轉。本人研究室一定能在預定時間內如期完成。 （二） 研究計劃及背景 癌症是國人重要的死亡因素之一，肺癌又是目前國人男性和女性排名死亡的第一位， 因而每年死於癌症的人口與日劇增，由於很多癌細胞俱轉移分化(Differentation)之特性所以 使癌症在治療上更加困難，與癌細胞轉移有關的最重要現象是基質 extracellular matris(EMC) 的降解【3-5】，因為基質降解是各種癌細胞轉移侵入其他主織及器官的必經程序，然而學者 報告已經指出 EMC 的降解卻受控於其相關蛋白分解酶 proteolytic enzymes 的活化及 matalloproteinases (MMPs)【6,7】的調控。EMC 降解之酵素中最大的族群為 MMPs ，目前 已 知 MMPs 最 少 包 含 了 23 種 酵 素 (MMP-1,-2,-3,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14,-15,-16,-17,-19,-20,-21,-23,-24,-25,-26,-27,-28),各具有 降解不同癌細胞中所特有 EMC 之 proteinaceous components 成分【5,8】, 然而這些相關酵素 分別在很多不同癌細胞中陸續被發現。這酵素首先被合成時為非活性酵素，需靠其他相關酵 素來將其 pro-peptide 降解後方俱活性（active-enzymes ），利用 MMPs 對於 EMC 之調控可 將 EMC 斷碎成數個成份。 另一方面文獻報導也指出許多不同的癌細胞會產生許多相同或類似的生理特徵，如刺 激本身癌細胞增生、增加血管的增生、原位癌的的入侵等，但在各種癌細胞中這些相關的生 理現象其正確的機轉及相關作用目前卻發現不盡相同因而抗癌及預癌的作用更加困難。不論 如何凡舉所有惡性腫瘤拿來進一步分析與相關的正常組織做比較結果發現該癌組織中其所 含之 MMPs 皆高於正常組織。但各癌組織中所表現之 MMPs 之種類及程度的多寡卻因不同 的癌症有所差異，舉例而言 MMP-1 則大量表現於乳癌【9】及腦瘤【10】之中，但並不出
現於前列腺癌之中【11】，而 MMP-3 則大量出現於乳癌之中【9】但並不出現於前列腺癌及 腦瘤之中【12】，更值得一提的是 MMP-11 大量表現於乳癌、肺癌及大腸癌之中，並不出現 於淋巴腫瘤【13】，故 MMPs 種類的分佈和量之多寡之測定因隨著器官或組織或其他相關癌 主織的不同而有所不同，但是目前其與 MMPs 有關的 TIMPs 之測定是否隨著器官和組織的 不同而有所不同，仍待進一步的研究。
此 MMPs 酵素受控的程度亦受其 tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMPs)( 四種 TIMP-1,-2,-3,-4)之活性及其基因表現的影響【14】。更值得一提的是最近文獻報導已經指出 TIMPs 及 MMPs 之間的不平衡是導致癌細胞轉移(Metastasis)及侵入(Invasion)其他主織和器 官的關鍵之一。 最近學者也指出 TIMPs 及 MMPs 目前已知是由癌細胞所製造，並非移至巨 噬細胞、單核球、体纖維細胞等【3,4】，而是受控於數個調控因子引起自體、周圍和隨血液 循環到其他主織和器官中(autocrine ,paracine,endocrine)而這些調控因子有些卻來自於致癌環 境中。 最近文獻指出 MMPs 除了與癌細胞之轉移及侵入其他組織及器官有關外，其另一功 能即是調控癌細胞之生長(Growth)，舉例而言許多 MMPs 可組斷生長因子(Growth factor)， 相關接受器(Receptor)，及生長相關之蛋白。MMP3 可組斷 Heparin-binding growth factor , 並 將釋出於細胞膜外【15】。MMP9 在 angiogenesis 時釋放出血管表皮生長因子。故 MMPs 可 調控細胞週圍之環境，其扮演癌細胞在組織中生長及抑制之角色【16】。在許多癌症如腦瘤、 乳癌中已有學著報導 MMPs 可受細胞外 matrix metalloproteinase 刺激而生成【17,18】。 在上皮細胞增生的過程中，EMC 的降解是一必須的過程，在其血管增生的早期，MMPs 扮演一重要的角色，MMPs 的抑制引起抑制血管增生劑的活化及相對的促進其活性【19】，更值 得注意的是有許多研究反而已證實腫瘤細胞在生長及血管增生的過程中發現其 MMPs 活性的量 是被抑制的【20-22】，因而最近有關 MMPs 的抑制劑又更受到學著們的重視。相對的許多 MMPs 的抑制被證明是與癌細胞增生有關，例如引起增生在早期的 angiogenesis 過程中，MMPs 則擔任 重要的任務，因而引起更多學者的注意有關抑制 MMPs 的抑制劑，也就是說找尋有關 MMPs 的 抑制劑進而讓抑制劑能進一步抑制 angiogenesis 則該抑制劑也就是有 anti-ogenesis 的作用【19】。 由於過去數年來一些文獻已報導人工合成的 MMPs 抑制劑能抑制相關癌症的 angiogenesis 和生長【20-22】雖然這些有關 MMPs 抑制劑（MMPs Inhibitiors）已被證實能經由 抑制 angiogensis 而達到減少癌細胞轉移的功效，反而也有學者發現有些 MMPs 的抑制劑(MMPIs) 給於病人之後其結果卻有不良的副作用【23-24】，故本研究主要檢測國人肺正常和癌組織中 MMPs 酵素的種類和其分佈的量做比較，同時也與其他固定的癌比較，相生差異，接著在 in vitro 做肺癌細胞轉移有否受 curcumin 的抑制欲利用由老鼠體中由化學致癌物所引起的肺癌在該其轉 移至到及肝臟而這些轉移過程中是否受到 curcumin 的影響；由以上結論可知抑制劑可能影響 MMPs 之基因及蛋白質表現的階段，而這些可能抑制過程呈現於圖一所示，同時我們也測定 curcumin 是否影響 MMPs 的 m RNA、蛋白質的表現及 MMPs 的活性。另一方面我們實驗的重 點在於檢測 curcumin 是否影響 N-κB 及 I-κB 之基因表現，其作用及流程呈現於圖二中。圖二 中所顯示抑制劑可能其作用與標的階段位置，因為 MMPs 及 Ti MMPs 的釋放取決於 N-κB 及 I-κB 的表現與否。
相關訊息 細胞表面接受器 可能信號傳遞抑制劑 相關 Tyrosine Kinases 活性進入細胞核內 再傳入轉錄 MMP promotor 抑制轉錄功能的目標 最後形成 MMP mRNA 轉譯形成 pro MMP 抑制其 MMP 的形成 形成 MMP 圖一 MMP 形成過程中可能藥物作用而抑制其表現 相關因子訊息因子 細胞膜上的接受器 信號傳入 N-κB 和 I-κB 的結合體 抑制劑或促進劑作用目標 而 I-κB 的裂解則 N-κB 就會把信號進一部轉入細胞核內 則引起 MT1-MMP mRNA 的形成 抑制劑作用目標 MT1-MMP mRNA 移到內質網上由核糖體型成 MT1-MMP 然後 TMP 就把 Pro –MMP 蛋白裂解 抑制劑作用目標 就形成活化的 MMP 圖二 N-κB 和 I-κB 可能功能途徑及抑制劑抑制目標
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（三） 研究方法、進行步驟及執行進度 本研究計劃分為三部份，第一部份人體肺正常和癌組織中 MMPs 和 TIMPs 的表現檢測。第二部分人類肺 癌細胞在 In Vitro 轉移有否受 Curcumin 的影響及找出其抑制的機轉。第三部份則利用動物模式作為 Curcumin 在 In Vivo 影響肺癌細胞的轉移。 第一部份 人類肺正常和癌組織的實驗 國人肺癌組織由中國醫藥大學附設醫院人體實驗委員會提供。再經由 RNA 和作 PCR（如 E.所列，primer 則如第二部分所列的 primer）然後也進一步做 DNA 定序將由生技公司協助。最後再做進一步比較,分析 找出差異和找出關聯性。 第二部分 1.人類肺癌細胞株（A549） 人類肺癌細胞（A549）購由新竹食品科學研究所。肺癌細胞先放入 75 cm3 培養瓶，養於含有 10%胎 牛血清（購於 Gibco BRL, Grand Island, NY）、2% penicillin-streptomycin（10,000 U/ml penicillin 和 10mg/ml streptomycin）的 DMEM medium（購於 Sigma Chemicals Company, St. Louis. MO ），放入 37℃，5% CO2培養箱中培養。得大量細胞產生後，將做下面實驗。
2.活細胞的測定
肺癌細胞數以每 well 5×105
cells 種植入 12 well plate 培養 24 小時，然後分別加入不同濃度的 curcumin，而控制組以 DMSO 當 slovent，接著放入於 37℃，5% CO2培養箱中培養不同的時段。利 用 trypan blue exclusion 的方法來檢測 cell viability。首先，先取 10μl 的細胞懸浮液加入 40μl 的 trypan blue 混和均勻，使用血球計數器來計算被染色（死細胞）與沒被染色（活細胞） 的細胞數目。 同時利用流式細胞計數儀來加以分析比較。
3.分析肺癌細胞入侵和轉移受 curcumin 的影響
肺癌細胞的侵入活性以 Chemotaxicell chamber（購於 Kurabo Inc.）來檢測。第一，將濾紙覆蓋 於 1μg 的 fibronectin 上，接著在室溫下自然風乾。第二，將已風乾的 membrane Matrigel（購於 Collabortaive Research Co.）置於濾紙（購於 5μg/50μl/filter）上，然後在室溫下自然風乾。 接著以 PBS 沖洗濾紙，後風乾。至於 migration assay，將濾紙覆蓋於 1μg 的 fibronectin 上， 而此濾紙不需要覆蓋 membrane Matrigel。第三，用有無加入 curcumin 的 1×105
cells/100μl 細 胞數三重複，放入上層的 chamber 中，培養於 37℃，5% CO2培養箱中。培養 6 小時後的細胞拿來作 migration assay，培養 24 小時後的細胞拿來作 invasion assay。入侵或轉移的細胞定量以 crystals violet staining method 來測定。
抽取培養 24 小時加入有無 50μM Curcumin 的肺癌細胞 total RNA，依據 Qiagen Rneasy Mini Kit 的 protocol 處理。抽取出來的 totoal RNA（1.5μg）,0.5μg oligo-dT primer 和含有 DEPC（diethyl pyrocarbonate）的滅菌去離子水混和均勻，放入微離心管，其總體積為 12.5μl。接著將全部的混 和物以 70℃,10 分鐘加熱，後冷卻至少 1 分鐘。接下來的步驟皆與反轉錄的步驟一樣（First-strand cDNA synthesis kit, Novagen）。其反轉錄出來的產物可來當作 PCR 的模板。當放大目標 cDNA 時， 他的所有產物總體積為 50μl，內含有：1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP mix、20 pmoles primer（如 下所列 primer），而此 cDNA 的模板是經由 50 ng 的 total RNA 與 2 units 的 DyNAzyme DNA Polymersae 所合成。這些 primer 設計來自於基因銀行。Primer 的序列如下：
Name Primer Primer length (bp) Amplicon length (bp) Sequence MMP1 Forward 24 121 GAGGAAATCTTGCTCATGCTTTTC Reverse 19 TGAGCCGCAACACGATGTA MMP2 Forward 20 102 TGCGGTTTTCTCGAATCCAT Reverse 21 GGAGTCCGTCCTTACCGTCAA MMP3 Forward 19 151 GACTCGGTTCCGCCTGTCT Reverse 24 AAAGGACAAAGCAGGATCACAGTT MMP7 Forward 23 151 CCAAATAGCCCAAAATGGACTTC Reverse 22 CTTTGCCCCACATGTTTAAAGC MMP8 Forward 20 101 GCCATCCCTTCCAACTGGTA Reverse 22 CATAGCCACTCAGAGCCCAGTA MMP9 Forward 21 130 AGACCTGGGCAGATTCCAAAC Reverse 15 GAAGGCGCGGGCAAA MMP10 Forward 22 121 TTGGTCACTTCAGCTCCTTTCC Reverse 22 GCTTTCTCAATGGCAGAATCAA MMP11 Forward 18 152 CCCGCAACCGACAGAAGA Reverse 21 CGTCACATCGCTCCATACCTT MMP12 Forward 22 141 GCCTCTCTGCTGATGACATACG Reverse 21 TTCCCACGGTAGTGACAGCAT MMP13 Forward 20 131 CACGATGGCATTGCTGACAT Reverse 22 TGGGCATCTCCTCCATAATTTG MMP14 Forward 19 130 TCAAGGAGCGCTGGTTCTG Reverse 23 AATTTGCCATCCTTCCTCTCGTA MMP15 Forward 18 101 TGGTCTGCCCGGTGACAT Reverse 20 CCAGGTTCGCTTCTCGAAAG MMP16 Forward 20 101 TTCGTCGAAAGCGATATGCA Reverse 25 AGTCTCAGGGTCTCCTACTTTTGGA MMP17 Forward 21 101 GTGGCTAAGCAGGTTCGGTTA Reverse 20 ACTGCTGCATGGCTGTGATG
MMP19 Forward 23 101 AAGTTCCCCTGTTCAAGGCATAC Reverse 22 GAATGCCCATCACTGTCCCTTA
Name Primer Primer length (bp) Amplicon Length (bp) Sequence MMP 20 Forward 21 123 CCATCCATCCCTGACCTCTGT Reverse 20 TCCTGTCCGCAAGTGAACCT MMP 21 Forward 22 121 ACTTTGACGACGACGAGCACTT Reverse 21 GATCCCGTCCTGTAGGTGTGA MMP 23 Forward 19 151 AGGGCAGGAACGTGACCTT Reverse 16 ACGGCGTTGGCGATGA MMP 24 Forward 21 106 ACCGGTGTGTTGGATCAGACA Reverse 20 GGGCATAGCGCTTGTTTCTC MMP 25 Forward 22 119 CTGACATGGAGGGTACGTTCCT Reverse 22 TCATGAAATGTGAGGCCTGACT MMP 26 Forward 20 101 TGGAGCAATGTGACCCCTTT Reverse 20 AAGGGCCAACCATCTTCATG MMP 27 Forward 22 101 AAATAGATGCAGCCGTCTGTGA Reverse 21 TTTGTCCATGGTTTGGGTCAT MMP 28 Forward 22 121 CCAAAATGAGGCGTAAGAAACG Reverse 15 ACGGCGCCCCGAACT TIMP 1 Forward 20 88 TGTTGGCTGTGAGGAATGCA Reverse 20 CTGGTCCGTCCACAAGCAAT TIMP 2 Forward 17 101 ACCCGCAACAGGCGTTT Reverse 24 GATAGGGTTGCCATAAATGTCGTT TIMP 3 Forward 20 126 CCCCATGTGCAGTACATCCA Reverse 20 GCACAGCCCCGTGTACATCT
TIMP 4 Forward 21 101 TCTGAACTGTGGCTGCCAAAT Reverse 20 GCTTTCGTTCCAACAGCCAG NF-κB Primer Forward: GATGAATATGTGTGTATCCG Reverse: TTTGTTGTGCTTGAGAACC I-κB Primer Forward: CATGTTTCACACACACAATCAGC Reverse: GGAGTAGGAGACTTTCACAAGTGG 5.利用流式細胞儀測定人類肺癌細胞之蛋白質的 MMPs 及 TI-MMPs
利用流式細胞儀（購於 Becton Dickinson FACS Cailbur） 及單株抗體來測定人類肺癌細胞(colo 205)內之 MMPs。利用不同濃度之 curcumin(0.5 、5 、25、 50、100μM)培養 24 小時的細胞來檢定 細胞內 MMPs。將細胞收集後 wash 二次，再加入 100μl 1% formaldehyde 靜置 5 分鐘，後再加入 100 μl 99% methanol 混和靜置 30 分鐘。每株細胞株利用內含 0.1% BSA 之 PBS 清洗 3 次，然後再加入 含 0.1% triton X-100 之 PBS（內含 0.1% sodium citrate）100μl，置於冰上 45 分鐘。細胞再清洗 3 次，加入單株抗體於 4℃下反應 2.5 小時，再利用內含 0.1% BSA 之 PBS 清洗 3 次。清洗後的細胞加 入 FITC –labeled secondary antibody（goat anti-mouse IgG; Jackson ImmunoResearch; Laboratories, West Grove, PA, USA）於 4℃下反應 30 分鐘，利用 PBS 清洗 3 次後使用流式細胞儀 分析。
6.西方點墨法測定人類肺癌細胞之 MMPs、TIMPs、NF-κB、I-κB 肺癌細胞數以每 well 1×107
cells 種植入 6 well plate 分別加入不同濃度的 curcumin 後培養 24 小時。收集細胞並離心後移除培養液，再利用 PBS 清洗。加入 100μl triple detergent buffer（50 mM Tras-Cl [pH8.0], 150mM NaCl, 0.02% NaN3, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 100μg /ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1μg/ml aprotinin, 1μg/ml leupeptin, 1μg/ml pepstatin A）溶解細胞。將樣本均質化後，於冰上培養 20 分鐘，離心 1200g 10 分鐘。利用 Bradford assay 檢測懸浮液的的蛋白質濃度。利用 12﹪SDS-polyacrylamide gels 將蛋白進行分析並轉印用 polyvinyliene difluoride membranes，polyvinyliene difluoride membranes 利用 PBS 清洗三次 （內 含 0.04﹪Tween-20(PBST)），在室溫之下與 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibody 於 5﹪牛乳中進行結合 2 小時，而後利用 PBS 清洗並用 ELC detection system (Amersham Piscatway, NJ) 進行分析，ImageQuant image 加以定量。
7.cDNA 微矩陣 雜交法（c DNA Microarray hybrridization）
利用 Qiagen Rneasy Mini Kit 抽取經 50μM curcumin 處理過之人類肺癌細胞 RNA ，所有的 RNA 將反轉錄成 c DNA, 同時進行標定，將標有螢光之 c DNA 與微矩陣上 c DNA 進行雜交。藉由螢光的 強度加以測定及定量（Asia BioInnovatuons Corporation, Taipei, Taiwan）, 用以評估 curcumin 對於肺癌細胞的 MMPs、TIMPs、NF-κB、I-κB 之影響。
第三部份 體內試驗
利用動物模式來評估 curcumin 對於肺癌細胞增生和轉移的抑制將 150 g 的 SD rats 分為五組（每 組十隻老鼠）進行餵食；第一組：不餵食、第二組：控制組, 餵食 100 μl DMSO、第三組：餵食 10 μ M 的 curcumin、第四組：餵食 100 μM 的 curcumin、第五組：餵食 500 μM 的 curcumin；
每組老鼠注射肺癌的 inducer, 每週一次, 持續 6 個月。6 個月後,犧牲老鼠, 取出各部器官, 檢視是 否有肺癌細胞增生及轉移。所有動物實驗處理皆遵照中國醫藥大學動物中心之條例。我們實驗最主要 證明 curcumin 對於鼠體中抑制肺癌 inducer 引起肺癌細胞的變化及其轉移。Curcumin 抑制動物體內肺 癌之 MMPs，此實驗是利用犧牲動物後抽取出肺癌組織之 RNA。然後測定 MMPs 基因及蛋白質的表現過程 如上所示。 提出子計劃的原因 提出此研究計劃的主要原因及其背景，本實驗室已經利用早期萃取經由肺癌病人癌組織的檢體， 經由 lysin buffer 抽取蛋白質並由分光光度儀的吸光值來定量這些蛋白液，利用西方點墨法及生技公 司取得對抗 MMPs 的初級抗體而經由二級抗體染色所得六個病人肺癌組織皆有呈現 MMP3 的表現，如圖 三所示。其量依不同病人而有差異，但每人肺癌細胞組織中卻有 MMP3 的表現；同時我們也利用肺癌細 胞株(A549)分別有無加入不同濃度 curcumin，經由培養 24 小時收集細胞再利用 lysin buffer 萃取細 胞之蛋白質利用西方點墨法檢測確實可看到隨著 curcumin 濃度上升其 MMPs 的表現相對降低，結果呈 現如圖四，同時為了進一步有關 MMP 基因表現有否受影響，我們也事先用 NF-κB、I-κB 抗體檢測結 果也顯示 curcumin 確實可影響 NF-κB、I-κB 的表現如圖五所示，本實驗室也利用 PCR 的方式利用上 面所列之 primer，例如 MMPs 作 PCR 來檢測 curcumin 影響人類肺癌細胞株 A549 MMPs 基因表現，結果 如圖六顯示 curcumin 可降低 MMPs 之基因表現，此與蛋白測定相一致。
由於先前初步實驗結果已發現檢測有關人類肺癌組織 MMPs 的表現對 curcumin 能抑制肺癌細胞株 MMPs 表現，因而產生值得研究之本計劃。
圖三 人類肺癌組織 MMP3 表現 Sample 1 2 3 4 5 6 MMP3 Curcumin C 0.05 0.5 5 25 50 (μM) MMP3 圖四 curcumin 影響人類肺癌細胞株 A549 MMP3 之表現 Curcumin C 0.5 5 25 50 (μM) NF-κB 圖五 curcumin 影響人類肺癌細胞株 A549 NF-κB 之表現
（四）.預期完成之工作項目及成果 甲.預期完成之工作項目。 第一年 完成檢測國人肺癌和正常組織的 Matrix Metalloproteinance 的表現及其相關基因之變化和這 些基因相關之蛋白質量的表現。找出這些改變與癌細胞轉移的關聯性以及國外學者所發表的結 論，相關研究成果論文撰寫及發表於國際雜誌。 第二年 完成項目如下
1. 檢測 Curcumin 對人類肺癌組織中 Matrix metalloproteinase 酵素活性和 TIMPs 的影響 2. 檢測 Curcumin 對人類肺癌細胞轉移及該細胞內對 Matrix metalloproteinase 的影響 相關研究成果論文撰寫及發表於國際雜誌。 第三年 完成項目如下 1. 利用肺癌 Inducer 引發老鼠肺癌之產生 2. 利用餵食含 Curcumin 之老鼠來檢測老鼠肺癌轉移的影響及相關機轉，相關研究成果論文撰寫 及發表於國際雜誌。 3. 經由本研究的所抽取之 RNA 所作之 PCR，可得到國人肺癌的 MMPs 和 TIMPs 分部之表現，在經 由統計和臨床病人資料可作為癌症轉移原因之探討。 4. 經由 DNA 之定序得知這些病人的 MMPs 和 TIMPs 是否有基因的突變，這些病人是否又合病人癌 症轉移有直接的相關聯。 乙.對於學術研究、國家發展及其他應用方面預期之貢獻 經由本研究之結果可的到國人肺正常及癌組織中 MMPs 表現差異（相關蛋白的量、基因表現差異） 及人體內轉移的程度進一步與世界其他人群相比較，然後可得到相關的肺癌轉移的預知。由於在 動物體內 curcumuin 抑制肺癌細胞轉移的了解可提共臨床病人可使用 curcumuin 達到抑制肺癌轉 移的效果,最後開發 curcumuin 相關之藥物以達預防肺癌轉移之目的及推廣其商業價值。 丙.對於參與之工作人員，預期可獲之訓練 研究生及參與相關的研究人員可由實驗中可習得癌細胞之培養、轉移 PCR 之技術、及西方點墨法、流 式細胞儀之相關知識及技術和統計分析比較的訓練。
第一年期中報告
利用 PCR 和 DNA 定序檢測在台灣華人正常和癌組織中 Matrix Metalloproteinase 的表
現
人類肺正常和癌組織的實驗
國人肺癌組織由中國醫藥大學附設醫院人體實驗委員會提供。再經由 RNA 和作 PCR（如下所列的 primer） 然後也進一步做 DNA 定序將由生技公司協助。最後再做進一步比較,分析找出差異和找出關聯性。
MMPs；TIMMP；N-κB 和 I-κB 在肺癌細胞的表現
抽取肺癌 samples total RNA，依據 Qiagen Rneasy Mini Kit 的 protocol 處理。抽取出來的 totoal RNA （1.5μg）,0.5μg oligo-dT primer 和含有 DEPC（diethyl pyrocarbonate）的滅菌去離子水混和均 勻，放入微離心管，其總體積為 12.5μl。接著將全部的混和物以 70℃,10 分鐘加熱，後冷卻至少 1 分鐘。接下來的步驟皆與反轉錄的步驟一樣（First-strand cDNA synthesis kit, Novagen）。其反轉 錄出來的產物可來當作 PCR 的模板。當放大目標 cDNA 時，他的所有產物總體積為 50μl，內含有：1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP mix、20 pmoles primer（如下所列 primer），而此 cDNA 的模板是經由 50 ng 的 total RNA 與 2 units 的 DyNAzyme DNA Polymersae 所合成。這些 primer 設計來自於基因銀行。Primer 的序列如下：
Name Primer Primer length (bp) Amplicon length (bp) Sequence MMP1 Forward 24 121 GAGGAAATCTTGCTCATGCTTTTC Reverse 19 TGAGCCGCAACACGATGTA MMP2 Forward 20 102 TGCGGTTTTCTCGAATCCAT Reverse 21 GGAGTCCGTCCTTACCGTCAA MMP3 Forward 19 151 GACTCGGTTCCGCCTGTCT Reverse 24 AAAGGACAAAGCAGGATCACAGTT MMP7 Forward 23 151 CCAAATAGCCCAAAATGGACTTC Reverse 22 CTTTGCCCCACATGTTTAAAGC MMP8 Forward 20 101 GCCATCCCTTCCAACTGGTA Reverse 22 CATAGCCACTCAGAGCCCAGTA MMP9 Forward 21 130 AGACCTGGGCAGATTCCAAAC Reverse 15 GAAGGCGCGGGCAAA MMP10 Forward 22 121 TTGGTCACTTCAGCTCCTTTCC Reverse 22 GCTTTCTCAATGGCAGAATCAA MMP11 Forward 18 152 CCCGCAACCGACAGAAGA Reverse 21 CGTCACATCGCTCCATACCTT MMP12 Forward 22 141 GCCTCTCTGCTGATGACATACG
Reverse 21 TTCCCACGGTAGTGACAGCAT MMP13 Forward 20 131 CACGATGGCATTGCTGACAT Reverse 22 TGGGCATCTCCTCCATAATTTG MMP14 Forward 19 130 TCAAGGAGCGCTGGTTCTG Reverse 23 AATTTGCCATCCTTCCTCTCGTA MMP15 Forward 18 101 TGGTCTGCCCGGTGACAT Reverse 20 CCAGGTTCGCTTCTCGAAAG MMP16 Forward 20 101 TTCGTCGAAAGCGATATGCA Reverse 25 AGTCTCAGGGTCTCCTACTTTTGGA MMP17 Forward 21 101 GTGGCTAAGCAGGTTCGGTTA Reverse 20 ACTGCTGCATGGCTGTGATG MMP19 Forward 23 101 AAGTTCCCCTGTTCAAGGCATAC Reverse 22 GAATGCCCATCACTGTCCCTTA
Name Primer Primer length (bp) Amplicon Length (bp) Sequence MMP 20 Forward 21 123 CCATCCATCCCTGACCTCTGT Reverse 20 TCCTGTCCGCAAGTGAACCT MMP 21 Forward 22 121 ACTTTGACGACGACGAGCACTT Reverse 21 GATCCCGTCCTGTAGGTGTGA MMP 23 Forward 19 151 AGGGCAGGAACGTGACCTT Reverse 16 ACGGCGTTGGCGATGA MMP 24 Forward 21 106 ACCGGTGTGTTGGATCAGACA Reverse 20 GGGCATAGCGCTTGTTTCTC MMP 25 Forward 22 119 CTGACATGGAGGGTACGTTCCT Reverse 22 TCATGAAATGTGAGGCCTGACT MMP 26 Forward 20 101 TGGAGCAATGTGACCCCTTT Reverse 20 AAGGGCCAACCATCTTCATG MMP 27 Forward 22 101 AAATAGATGCAGCCGTCTGTGA Reverse 21 TTTGTCCATGGTTTGGGTCAT MMP Forward 22 121 CCAAAATGAGGCGTAAGAAACG
28 Reverse 15 ACGGCGCCCCGAACT TIMP 1 Forward 20 88 TGTTGGCTGTGAGGAATGCA Reverse 20 CTGGTCCGTCCACAAGCAAT TIMP 2 Forward 17 101 ACCCGCAACAGGCGTTT Reverse 24 GATAGGGTTGCCATAAATGTCGTT TIMP 3 Forward 20 126 CCCCATGTGCAGTACATCCA Reverse 20 GCACAGCCCCGTGTACATCT TIMP 4 Forward 21 101 TCTGAACTGTGGCTGCCAAAT Reverse 20 GCTTTCGTTCCAACAGCCAG NF-κB Primer Forward: GATGAATATGTGTGTATCCG Reverse: TTTGTTGTGCTTGAGAACC I-κB Primer Forward: CATGTTTCACACACACAATCAGC Reverse: GGAGTAGGAGACTTTCACAAGTGG 初步結果
初步結果如下圖(Fig 1A,B and C) PCR 顯示，經由所有列出的 MMP primer 配合由肺癌組織所抽出的 RNA 做 PCR 跑膠後發現，人類肺癌組織含有 MMP-2，MMP-3，MMP-9。結果在不同的組織有不同的表現量。 雖然大部分檢體的 MMP 是相同的， 但是 MMP-2 與 MMP-3 和 MMP-9 各分別比對後，再進一步做 DNA 定序 結果如下圖(Fig2A,B,C and D)所列。發現在這些檢體中有不同 sequence 這些結果是值得進一步探討。
Primary Results Fig. 1A PCR Sample no __________________________________________________ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 MMP-2 β-actin 1B Sample no ____________________________________________________ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 MMP-3 β-actin 1C Sample no ________________________________________________________ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 MMP-9 β-actin
Fig. 2A
Representative sequences of MMP-2 from 1 sample
2B
Representative sequences of MMP-7 from 2 samples
2C
Representative sequences of MMP-7 from 2 samples
2D
Representative sequences of MMP-9 from 2 samples
西方點墨法測定人類肺癌細胞之 MMPs、TIMPs、NF-κB、I-κB 肺癌細胞數以每 well 1×107
cells 種植入 6 well plate 分別加入不同濃度的 curcumin 後培養 24 小時。收集細胞並離心後移除培養液，再利用 PBS 清洗。加入 100μl triple detergent buffer（50 mM Tras-Cl [pH8.0], 150mM NaCl, 0.02% NaN3, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 100μg /ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1μg/ml aprotinin, 1μg/ml leupeptin, 1μg/ml pepstatin A）溶解細胞。將樣本均質化後，於冰上培養 20 分鐘，離心 1200g 10 分鐘。利用 Bradford assay 檢測懸浮液的的蛋白質濃度。利用 12﹪SDS-polyacrylamide gels 將蛋白進行分析並轉印用 polyvinyliene difluoride membranes，polyvinyliene difluoride membranes 利用 PBS 清洗三次 （內 含 0.04﹪Tween-20(PBST)），在室溫之下與 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibody 於 5﹪牛乳中進行結合 2 小時，而後利用 PBS 清洗並用 ELC detection system (Amersham Piscatway, NJ) 進行分析，ImageQuant image 加以定量。
Sample no ________________________________________________ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MMP-1 MMP-2 MMP-3 MMP-9 β-Actin NF-κB I-κB β-Actin 經由西方墨點法利用抗體(由 PCR 已經先前找出檢體有 MMP 的表現及發現各檢體間的 MMP-1，-2，-3， 和-9 在人類肺癌組織)來進一步檢測各樣品 MMP 的表現則依其結果發現表現量之間也差異很大。同樣 有關 NF-KB 和 F-KB 也有相類似的情形，目前正在進一步的利用這些方法及檢測相關檢體。 以便所得 結果作進一步定量及統計分析。
cDNA 微矩陣 雜交法（c DNA Microarray hybrridization）
利用 Qiagen Rneasy Mini Kit 抽取經人類肺癌 RNA ，所有的 RNA 將反轉錄成 c DNA, 同時進 行標定，將標有螢光之 c DNA 與微矩陣上 c DNA 進行雜交。藉由螢光的強度加以測定及定量用以評估 肺癌細胞的 MMPs、TIMPs、NF-κB、I-κB 之 mRNA 量。
