運動訓練對憂鬱症老鼠影響之生理機轉評估

運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 影 響 之 生 理 機 轉 評 估

運動訓練對憂鬱症老鼠影響之生理機轉評估

李瑞娟／國立政治大學副教授

劉鎮國／樹人醫專教授

黃順顯／遠東技院副教授

摘 要

憂 鬱 已 是 現 代 社 會 的 重 要 議 題 ， 目 前 約 有 2%的 人 有 重 度 憂 鬱 的 困 擾，其中 20%左右的人有中度憂鬱症的困擾。實驗動物中發現，早期與 母 親 隔 離 的 初 生 動 物 ， 長 大 後 在 行 為 上 會 發 生 深 遠 的 影 響 。 我 們 的 實 驗 室 也 發 現 早 期 與 母 親 隔 離 的 初 生 動 物 會 有 憂 鬱 症 的 傾 向 。 在 過 去 運 動 曾 經 被 拿 來 當 作 改 善 憂 鬱 傾 向 的 方 法 ， 然 而 關 於 運 動 訓 練 如 何 影 響 大 腦 的 訊 息 傳 遞 ， 目 前 並 不 清 楚 。 本 研 究 的 目 的 就 是 要 運 用 我 們 所 發 展 出 的 憂 鬱 症 老 鼠 之 實 驗 模 式 ， 來 探 討 憂 鬱 症 的 病 理 轉 機 。 我 們 將 以 強 迫 游 泳 試 驗 來 檢 驗 早 期 隔 離 老 鼠 其 憂 鬱 症 發 展 的 情 形 。 並 檢 驗 運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 在 強 迫 游 泳 試 驗 之 行 為 表 現 改 善 狀 況 。 除 了 行 為 觀 察 外 ， 我 們 同 時 研 究 腦 細 胞 的 分 子 機 轉 。 我 們 將 觀 察 憂 鬱 症 老 鼠 其 大 腦 訊 息 調 控 的 改 變 。 同 時 再 比 較 運 動 訓 練 的 老 鼠 ， 相 同 腦 區 憂 鬱 行 為 上 有 無 差 異 。 並 探 討 可 否 直 接 以 影 像 處 理 的 方 式 ， 研 究 杏 仁 核 受 刺 激 後 鈣 離 子 訊 息 傳 遞 機 轉 有 何 差 異 ， 以 做 為 未 來 憂 鬱 症 研 究 的 基 礎 。 本 研 究 發 現 憂 鬱 症 的 老 鼠 其 MAPK 在杏仁核的活性有變高的現象。初步的研究結果發現，在老鼠 身 上 發 現 運 動 可 以 改 善 憂 鬱 的 情 形 。 同 時 我 們 也 可 以 直 接 測 定 鈣 離 子 在 杏 仁 核 的 濃 度 變 化 ， 故 此 運 動 模 式 值 得 繼 續 應 用 在 憂 鬱 症 的 研 究 上 ， 深 入研究運動訓練的機轉。 關鍵詞：憂鬱、運動訓練、MAPK 激酶

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壹、簡介

一、憂鬱症簡介 憂 鬱 症 在 精 神 疾 病 之 中 ， 情 緒 錯 亂 是 最 普 遍 的 症 狀 。 憂 鬱 症 在 情 緒 錯亂中佔有很高的比例。在美國約有 2 至 5%的人受到嚴重憂鬱的影響， 另外約有 20%的人受到中度的憂鬱困擾(Nestler et al., 2002)。然而，至目 前 為 止 ， 憂 鬱 症 的 起 因 與 病 理 生 理 機 轉 仍 不 清 楚 。 也 因 此 使 得 在 抗 憂 鬱 的藥物發展遲緩。為了有效研究憂鬱症形成機轉，本研究使用 early-life stress animal model(即早期生活隔 離 之動物模式 )來 探討憂鬱症中大腦的 特 異 性 的 生 理 機 轉 ， 並 從 運 動 訓 練 中 ， 觀 察 運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 的 改 變 情 況。 回 顧 過 去 關 於 憂 鬱 症 研 究 文 獻 顯 示 ， 憂 鬱 主 要 是 由 於 神 經 與 內 分 泌 失 衡 而 對 神 經 細 胞 造 成 的 長 期 性 傷 害 所 致 。 一 般 而 言 ， 壓 力 會 對 下 視 丘 － 腦 下 腺 － 腎 上 腺 軸 ， 簡 稱 HPA(hypothalamic-pituitary-adrenal)產 生 影 響 。 而 長 期 壓 力 可 能 是 造 成 憂 鬱 的 主 要 原 因 。 當 動 物 受 到 壓 力 刺 激 時 ， 下視丘的神經核(PVN)會分泌 CRF(corticotropin-releasing factor)而造成腦 下腺 ACTH 的分泌。ACTH 又促進腎上腺之 Glucocorticoids 如 cortisol 的 分泌。Glucocorticoids 會對動物的行為產生深遠的影響，Glucocorticoids 主 要 的 作 用 在 幫 助 身 體 應 付 外 在 的 壓 力 。 在 短 暫 壓 力 下 Glucocorticoids 會 回 饋 抑 制 下 視 丘 神 經 核 。 當 外 在 情 況 回 復 正 常 後 ， 下 視 丘 神 經 核 分 泌 的 CRF 又回到基礎狀態。外在壓力刺激會先對 hippocampus 及杏仁核 (amygdale)產生影響。而 此區的訊息會在下視丘經過整合。統 合以後的訊 息會調節 CRF 的分泌量。報告顯示，高劑量的 Glucocorticoids 分泌會使 得 hippocampus 受傷害。而造成 hippocampus 無法調節 CRF 進而導致血 中高 Glucocorticoids，這可能是憂鬱症的造成原因之一。另一個造成憂鬱 症 的 可 能 模 式 是 神 經 營 養 傷 害 理 論 (Impairment of neurotrophic mechanisms)。主要的關鍵因子是 brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 腦衍生神經營養因子。在成熟動物中，BDNF 是一個重要的分泌因子，他

運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 影 響 之 生 理 機 轉 評 估 可以幫助神經元及神經膠細胞的生長。長期壓力可能會造成 BDNF 的表 現 下 降 而 造 成 hippocampus 神 經 元 受 損 。 而 此 路 徑 主 要 也 是 受 到 Glucocorticoids 分 泌 的影響。憂鬱與 hippocampus 顯然有明顯而重要的關 係，然而除了 hippocampus 以外，杏仁核對憂鬱症可能也有重要影響。杏 仁 核 是 一 個 外 來 緊 迫 刺 激 的 整 合 中 心 ， 因 此 ， 它 被 發 現 不 僅 是 一 個 恐 懼 記 憶 產 生 的 區 域 ， 同 時 是 一 個 對 於 外 來 刺 激 而 使 身 體 引 發 自 主 神 經 性 反 應 及 神 經 內 分 泌 產 生 的 樞 紐 ， 最 近 更 發 現 它 參 與 在 憂 鬱 症 的 產 生 機 制 之 中。因為杏仁核可以正向調控 HPA 的活性，以致於可以平衡海馬迴對於 HPA 活性的負向調控，然而，一旦杏仁核神經細胞產生問題，導致對於 HPA 活性的調控失衡，則最終會引發憂鬱症 狀 的產生。另外，在憂鬱症 人的腦部解剖實驗中亦發現，這類病人的杏仁核都產生病灶現象；因此， 對於憂鬱症機轉的探討，杏仁核是一個重要的腦區。 二、憂鬱的研究模型 早 期 生 活 隔 離 之 動 物 模 式 是 將 出 生 後 的 幼 鼠 ， 即 與 其 母 代 做 適 當 隔 離 ， 根 據 過 去 的 研 究 報 告 顯 示 ， 其 於 憂 鬱 症 研 究 中 之 重 要 性 可 從兩 方 面 得知，一方面在於基礎研究，另一方面在於臨床證據。從基礎研究來談， 此 種 將 生 物 體 從 出 生 之 後 ， 就 與 母 體 隔 離 的 個 體 ， 不 論 在 非 人 類 的 靈 長 類 或 於 嚙 齒 動 物 中 ， 都 顯 示 此 個 體 的 行 為 及 生 理 功 能 都 會 產 生 異 樣 的 變 化，將到地之類個體的 HPA axis 會產生異常，而這種 HPA axis 異常的現 象 ， 根 據 文 獻 報 導 會 增 加 成 體 產 生 憂 鬱 症 狀 的 危 機 。 另 一 方 面 ， 在 臨 床 上證據顯示，對於早年被遺棄的小孩，無論是父母過世，或被刻意遺棄， 甚至小時候生活被忽略(即不被重視)，則往往這些族群成年之後產生憂鬱 症 的 流 行 率 相 當 高 。 所 以 ， 由 以 上 兩 方 面 的 證 據 顯 示 ， 就 憂 鬱 症 形 成 機 轉的研究，早期生活隔離動物模式是一個相當好的工具。Forced swimming test(即 所 謂 強 迫 性 游 泳 試 驗 )是 一 個 相 當 廣 泛 被 使 用 的 憂 鬱 老 鼠 動 物 模 式 (15，23，24，25，26，27)，並且這個模式也常被用 來 研究憂鬱劑之間的 交 互 作 用 情 形 (9 ， 10 ， 18 ， 21 ， 22 ， 31) ， 甚 至 用 來 研 究 緊 張 性 引 發

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(stress-induced)的荷爾蒙與神經傳導物質之間的作用；另外，內 分泌 系統 及免疫系統研究亦用到 forced swimming test 的動物模式(16)。而此動物 模 式 的 原 創 者 是 由 Porsolt 等 人 於 1977 年 發 表 於 ”Nature”雜 誌 的 方 法 (26)， 更 重 要 的 是 ， 此 種 測 式 中 最 重 要 的 一 項 指 標 就 是 ”immobility”， 即 老鼠於強迫性游泳的過程中，其水中不動的行為(23，24，25，26)。即在 這 種 強 迫 性 游 泳 過 程 老 鼠 所 產 生 的 不 動 情 形 則 反 應 出 老 鼠 的 行 為 沮 喪 ， 即憂鬱傾向(25)。也就是說，老鼠在此模式中所反應出不動時間的多寡， 即 可 判 定 此 老 鼠 的 憂 鬱 程 度 ， 也 就 是 說 不 動 狀 態 的 產 生 即 為 老 鼠 產 生 憂 鬱的指標。 三、以憂鬱症模型研究憂鬱基轉的可行性分析 過 去 本 實 驗 室 也 藉 此 動 物 模 式 ， 進 行 與 早 年 被 遺 棄 導 致 的 憂 鬱 症 其 形 成 機 制 之 探 討 ， 而 我 們 探 討 的 首 要 在 於 早 期 生 活 隔 離 是 否 會 引 起 老 鼠 的 杏 仁 核 細 胞 之 分 子 層 面 的 變 化 ， 若 有 所 變 化 ， 則 我 們 會 進 一 步 地 去 探 討 此 種 變 化 與 行 為 之 間 關 係 。 本 研 究 運 用 強 迫 性 游 泳 試 驗 進 行 實 驗 ， 而 此強迫性游泳試驗中之不動時間為一重要行為指標，因此，在本計畫中， 我 們 採 用 強 迫 性 游 泳 試 驗 來 測 定 早 期 生 活 隔 離 老 鼠 的 不 動 時 間 是 否 有 所 變化，以探討早期生活隔離老鼠的行為改變情形。在神經系統中，MAPK 的 路 徑 是 參 在 許 多 緊 張 性 引 發 的 神 經 突 觸 可 塑 變 化 過 程 中 (synaptic plasticity)。 另 外 ， 在 離 體 實 驗 中 亦 顯 示 ， MAPK 路 徑 參 與 在 long-term depresson(腦 被 長 期 抑 制 現 象 )之 中 。 近 年 來 在 動 物 樣 式 的 研 究 中 發 現 ， MAPK 路 徑 參 與在恐懼記憶的形成與 消除的過程；最近 更 有些微證據顯 示 MAPK 路徑參與在憂鬱症的形成過程，然而，證據仍嫌不足。因此， 本 研 究 是 要 利 用 早 期 生 活 隔 離 動 物 模 式 ， 去 探 討 大 白 鼠 杏 仁 核 細 胞 中 之 MAPK 路 徑在早期生活隔 離老 鼠中所扮演的角色，一 方面純粹探討腦部 神 經 細 胞 內 分 子 層 面 的 變 化 ， 另 一 方面 進 一 步 探 討 此 種 分 子 變 化 與 實 際 上 動 物 行 為 之 間 的 調 控 關 係 如 何 ， 由 此 範 圍 找 出 與 早 期 生 活 隔 離 相 同 的 憂鬱症形成途徑。

運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 影 響 之 生 理 機 轉 評 估 四、運動對憂鬱的影響研究 運 動 訓 練 對 心 血 管 的 影 響 已 經 廣 泛 的 被 人 們 所 接 受 。 過 去 我 們 發 現 ， 受 過 運 動 訓 練 的 動 物 ， 其 心 跳 速 率 會 下 降 ， 同 時 心 血 管 對 乙 醯 膽 鹼 的 靈 敏 度 會 上 升 ， 同 時 對 於 細 胞 內 鈣 離 子 傳 導 系 統 也 會 變 化 。 受 過 運 動 訓 練 的 老 鼠 ， 其 主 動 脈 內 皮 細 胞 對 於 鈣 離 子 通 透 性 會 增 加 ， 而 造 成 乙 醯 膽 鹼 對 內 皮 細 胞 鈣 離 子 誘 導 上 升 效 果 增 強 。 運 動 訓 練 除 了 對 心 血 管 功 能 有 提 升 的 效 果 之 外 ， 有 許 多 報 告 顯 示 ， 運 動 對 於 憂 鬱 症 的 病 人 有 減 低 病 情的效果。然而目前對於運動如何影響腦細胞的訊息調控仍不清楚。 本 研 究 結 合 三 種 動 物 模 式 ， 一 為 早 期 隔 離 的 憂 鬱 老 鼠 動 物 模 式 ， 第 二 為 運 動 訓 練 老 鼠 模 式 ， 第 三 為 強 迫 游 泳 試 驗 模 式 。 我 們 以 早 期 隔 離 的 方 法 來 誘 導 大 白 鼠 產 生 憂 鬱 的 作 用 ， 同 時 比 較 有 運 動 訓 練 及 沒 有 運 動 訓 練 的 老 鼠 ， 在 杏 仁 核 其 訊 息 傳 遞 因 子 濃 度 有 無 改 變 。 之 後 我 們 將 老 鼠 運 動訓練 2 週，藉由強迫游泳訓練的方式，去看老鼠憂鬱症改善的情形。

貳、實驗方法及步驟

一、動物來源： 本實驗所用的動物為雄性成熟 Sprague-Dawley rats，約四週至五週 大，平均重量為 150~170g。而動物來源主要由國科會動物中心及中華醫 事學院生科所 SPF 級動物飼養房供應，而運送過來的老鼠在實驗期間則 受到妥善的照顧，其生存的環境溫度為 21+_2°C 且溼度為 50+_10%RH， 另外，由動物房的固定晝夜控制，白晝開燈由 0700 到 1900，且燈光強度 為 40~130 lux。 二、動物模型的建立： 本 實 驗 老 鼠 主 要 在 中 華 醫 事 學 院 建 立 ， 實 驗 時 將 懷 孕 母 鼠 單 獨 觀 察，等到分娩的當天，算為產後第 0 天(postnatal day 0)，並於產後第二天

運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 影 響 之 生 理 機 轉 評 估 開始進行對雄性幼鼠隔離。再將公的一群以隨機方式分成 control 及隔離 實驗組，而實驗組的隔離時間為每天固定時段 1hr(60min/day)，如此隔離 方式持續到 postnatal day 14。在隔離期間，隔離者須放於保溫箱中，以 防 失 溫 導 致 身 體 代 謝 速 率 產 生 變 化 。 等 到 所 有 動 物 都 斷 奶 後 ， 則 開 始 老 鼠分籠(control 與實驗組分開)，並於 22+-1°C 的室溫及 12hr 晝夜循環的 環境下，無限自由地供給食物及自來水來飼養，預備進行實驗。

三、forced swimming test 的測試：

強 迫 性 游 泳 的 老 鼠 主 要 測 試 老 鼠 被 置 於 水 中 後 ， 其 掙 扎 的 時 間 。 老 鼠 怕 水 的 特 性 ， 所 以 正 常 老 鼠 放 入 水 中 都 會 強 力 掙 扎 ， 然 而 如 果 一 些 老 鼠 比 較 有 憂 鬱 傾 向 的 ， 則 這 些 老 鼠 投 入 水 中 其 掙 扎 情 況 會 顯 著 下 降 ， 即 所謂不動時間會增加。實驗步驟如 Porsolt 的流程所述(24，26)。我們利 用一個直徑 18cm 高 38cm 的透明圓柱壓克力桶，盛滿 20cm 的自來水(2)， 水溫維持在 25°C 左右。測試的前一天，必須先讓老鼠熟悉水性。將老鼠 置於相同環境的水桶中 15 分鐘，再將他取出。並於 24 小時之後，讓老 鼠浸入水漕 5 分鐘，並此時觀察老鼠的不動時間。所謂不動時間是採用 觀察老鼠的掙扎時間，再由總秒數 300sec 扣掉老鼠掙扎時間。游泳完後 必 須 將 老 鼠 置 於 同 樣 大 小 的 透 明 塑 膠 圓 柱 筒 中 (乾燥的)休息，並照 60W 燈泡 30 分鐘以烘乾。 四、運動訓練： 進行運動訓練的老鼠給予如下的訓練強度。每週訓練 5 天，在訓練 前先讓老鼠預跑 1 週，跑步機轉速為 9m/min，每天 10 分鐘。訓練的第一 週轉速增至 12m/min，時間由第一天的 20 分鐘開始，每天增加 10 分鐘， 直到第五天的 60 分鐘。此後，每天的訓練時間都維持一小時。第二週的 運動速度為 12m/min。之後每兩週速度增加 3m/min。對照組不運動，但 必須置於跑步機上相同的時間。

運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 影 響 之 生 理 機 轉 評 估 五、老鼠腦部定位手術： 將 control 老鼠進行杏仁核體的腦部定位手術，首先將老鼠用 sodium pentobarbital(50mg/kg，i.p.)進 行 麻醉，等到完全麻醉後 (可用針 刺 腳測試 ) 將老鼠固定在立體定位儀上。之後再將兩根 23-gauge 不銹鋼管各插入兩 側的杏仁核體中，而定位位置的方位是根據 1986 年 Paxinos 及 Watson 發 表的數據，AP-2.3mm，ML+-4.5mm，DV-7.0mm。接著，將三根 jewelry screws 固定於頭蓋骨上當作 anchors，之後用 dental cement 覆蓋頭部即完 成手術。然後再將二根 28-guge dummy cannula 插入插入各 23-gaguge 的 鋼管中以防止管內外被腦液或灰塵阻塞，最後讓老鼠術後休息 5~7 天， 然 後 才 可 進 行 實 驗 。 之 後 進 行 腦 切 片 ， 老 鼠 以 斷 頭 犧 性 之 後 ， 立 即 取 出 老 鼠 大 腦 ， 並 將 老 鼠 大 腦 固 定 在 石 蠟 上 。 再 以 切 片 機 進 行 切 片 。 將 老 鼠 的海馬回及杏仁核切出。切片的厚度約 500mm 左右。所得的切片保純於 4°C 的 CSF 中。 六、西方點墨法：

本法是將 forced swimming rats 的腦部細胞(即杏仁核細胞)取下，並 用乾冰瞬間 freeze 細胞內部的蛋白質成分，之後，再加入含蛋白酶抑制 劑，或磷酸酶抑制劑等藥物的 HBII 溶液於所取的 amygdala sample 中， 然後進行 sonication 先讓組織均質化後，再利用 7500rpm、15min 加上 50000rpml 時 (溫 度 均為 4°C)的 離 心過程萃取出所要的 cytosol protein，然 後再利用 Bradford assay 定出等量 40ug 的各 sample 的容積，以使進行跑 電泳實驗。電泳所用的材質為 8.5%濃度的 SDS-polyacrylamide gels，而 跑完電泳之後，則進行 transfer(即 blotting)約用電流量 130mA，時間 12 時的流程，之後將 blotting membrance 取出，利用 TBS 加安佳脫脂奶粉(以 20ml： 1g 的比 例 泡製 )溶液進行 blocking 且經過一夜。隔天， 利用 TBST wash 三 次 後，進 行室溫下 1oAb 的 incubation，時 間約一天，之 後，隔天 再進行三次 TBST wash 後，進行 2oAb 的 incubation，於室溫下 1 小時，

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之後，再 wash 三次，然後加上 chemiluminescemce kit 即 ECL 螢光顯示 Kit， incubate 1 min，然後迅速進入暗房以顯影劑及定影劑呈現出 X-film 上的蛋白質螢光影像，之後再利用 image analysis system 去分析定量蛋白 質。

七、鈣離子指示劑染色：

為 了 要 研 究 鈣 離 子 訊 息 對 腦 細 胞 的 影 響 ， 我 們 以 鈣 離 子 指 示 劑 去 染 腦 細 胞 以 觀 測 其 在 進 行 穿 透 作 用 所 扮 演 的 角 色 。 雖 然 過 去 我 們 有 許 多 以 fura2-AM 去 量 測 細 胞 內 鈣 離 子的經驗 (Huang et al., 2000； Huang et al 2001；Huang et al 2002)。我們以 fura2-AM 做為腦細胞之鈣離 子之螢光指 示 劑 。 其 實 驗 步 驟 如 下 ： 腦 切 片 取 下 之 後 ， 將 他 轉 移 並 固 定 至 流 體 系 統 裝中的底層，並通以氧氣。再以含 fura2 AM(2mM)的 CSF 處理 30 分鐘。 之後以 CSF 液體取代。靜置 30 分鐘使 fluo-3 AM 完全被切除之後再進行 腦 細 胞 實 驗 。 在 將 來 的 實 驗 我 們 預 計 以 刺 激 劑 探 討 不 同 的 化 學 物 質 對 正 常 的 、 運 動 的 、 憂 鬱 的 及 憂 鬱 又 運 動 的 老 鼠 腦 細 胞 ， 其 鈣 離 子 訊 息 機 轉 表現有何不同。 八、統計方法： 本實驗主要是利用 SAS version 6.08 版軟體來進行分析，實驗組與對 照組之間的比較差異，主要用 ANOVA 的分析方法，而若多組數據之間的 差異則使用 Newman-keuls analysis 來進行。P 值為小於 0.05(P<0.05)統計 結果為有差異的。

參、結果與討論

我 們 建 立 早 期 隔 離 老 鼠 的 動 物 模 式 。 新 生 的 老 鼠 分 娩 的 當 天 算 為 產 後第 0 天(postnatal day 0)，並於產後第二天開始隔離，隔離開始當天就先 分公母並標識。然後再將公的一群以隨機方式成 control 及實驗組(即預備

運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 影 響 之 生 理 機 轉 評 估 隔 離 者 )，而實驗組的隔離時間為每天固定時段 1hr(60min/day)， 如 此 隔 離方式持續到 postnatal day 14。(即隔離約二個星期)。隔離期間，隔離者 須 放 於 保 溫 箱 中 ， 以 防 失 溫 導 致 身 體 代 謝 速 率 產 生 變 化 。 等 到 所 有 動 物 都斷奶後，則開始將老鼠分籠(control 與實驗組分開)，並於 22+-1°C 的室 溫及 12hr 晝夜循環的環境下，無限自由地供給食物及自來水來飼養。經 過 13 天一小時的隔離後，在第四到五週齡時進行強迫性游泳試驗。 從 我 們 進 行 的 強 迫 游 泳 試 驗 發 現 ， 經 過 隔 離 的 老 鼠 ， 其 在 水 中 不 動 的時間明顯上升。此種測試中最重要的一項指標就是”immobility”，即老 鼠 於 強 迫 性 游 泳 的 過 程 中 ， 其 水 中 不 動 的 時 間 。 此 時 間 反 應 出 老 鼠 的 沮 喪 放 棄 掙 扎 的 時 間 ， 此 時 間 可 以 用 來 當 做 憂 鬱 傾 向 的 定 量 標 準 。 在 我 們 所得的結果顯示，正常老鼠 immobility time 約 40%左右。而早期隔離， 每天隔離 60 分鐘的老鼠之 immobility time 高達 70%左右。目前我們已 經可以得到穩定的憂鬱老鼠。 老 鼠 經 過 隔 離 後 ， 在 第 四 到 五 週 進 行 游 泳 試 驗 ， 結 果 顯 示 隔 離 老 鼠 在水中不動的時間增長。亦即表示隔離老鼠容易放棄希望的特性。 在 取 得 憂 鬱 症 的 老 鼠 後 ， 我 們 更 進 一 步 將 老 鼠 杏 仁 核 取 下 ， 藉 由 西 方點漬法對杏仁核細胞的 MEPK kinase 活性作測試。結果我們發現經由 母鼠隔離的憂鬱老鼠其杏仁核之 MEPK kinase 活性有增加的現象。我們 進一步發現老鼠杏仁核 MEPK kinase 活性與老鼠絕望的行為有相關。 在 我 們 得 到 憂 鬱 的 實 驗 動 物 之 後 ， 我 們 立 即 進 行 早 年 被 遺 棄 導 致 的 憂 鬱 症 其 形 成 機 制 之 探 討 。 由 於 老 鼠 的 杏 仁 核 細 胞 長 久 以 來 就 知 道 與 負 面 的 學 習 與 記 憶 所 造 成 的 生 物 焦 慮 情 形 關 係 。 因 此 ， 我 們 就 去 看 憂 鬱 老 鼠其杏仁核的分子表現與正常鼠有無不同(Schafe etal, 2000；Waltereit et al, 2003)。由於過去 林老 師等曾經發現杏仁核的 MAPK kinas 與焦慮的產 生很有關係(Lin et al, 2001；Lu et al, 2001)。因此我們便進一步探討憂鬱 老鼠其杏仁核的 MAPK kinas 與正常老鼠有無差異。結果我們發現，憂鬱 老鼠其杏仁核之 MAPK kinas 會持續活化的現象，其活化程度大約高於正 常鼠兩倍左右。

運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 影 響 之 生 理 機 轉 評 估 憂 鬱 老 鼠 與 正 學 老 鼠 MAPK 的 表 現 量 並 無 異 差 ， 然 而 在 憂 鬱 老 鼠 中，其 MAPK kinas 磷酸化程度增加。 我 們 接 著 探 討 運 動 效 果 對 憂 鬱 老 鼠 的 影 響 ， 結 果 我 們 發 現 ， 受 過 運 動訓練後的老鼠，其憂鬱的情形有受到改善。 憂鬱的老鼠經過運動訓練之後，類似憂鬱的行為受到改善。 本 研 究 利 用 外 加 的 腎 上 腺 皮 質 素 於 杏 仁 核 神 經 細 脆 來 觀 察 鈣 離 子 之 變化。為了進行此項研究，我們先開發 calcium image 技術將之應用於腦 組 織 上 。 我 們 將 老 鼠 斷 頭 ， 取 下 含 杏 仁 核 之 腦 片 ， 經 過 染 色 後 ， mount 在 組 織 流 體 室 中 ， 再 以 藥 物 處 理 並 取 得 處 理 過 程 的 鈣 離 子 影 像 。 結 果 我 們發現以 NE 刺激杏仁核神經細胞，會看到杏仁核細胞之內鈣離子濃度增 加的情形。由 NE、ACTH 等都是壓力 hormone，而壓力 hormone 對於憂 鬱症之產生扮演相當角色(Duman et al, 1997)，未來我們可以研究其他的 壓 力 激 素 ， 在 杏 仁 核 產 生 的 鈣 離 子 訊 息 為 何 。 並 比 較 正 常 老 鼠 與 憂 鬱 老 鼠之間的差異。

運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 影 響 之 生 理 機 轉 評 估 圖 1：壓力激素導致老鼠杏仁核的腦細胞胞內鈣離子濃度上升 圖 1 為杏仁核的 340 螢光影像圖，實驗中將腦切片之杏仁核腦區置 於顯微鏡下方，先給予灌流。之後在給予 NE 刺激。幾分鐘後以人工腦脊 髓 液 洗 掉 。 實 驗 結 束 後 ， 對 腦 切 片 做 鈣 離 子 濃 度 校 正 。 方 法 於 實 驗 步 驟 中詳述。 由於本實驗是在腦片上進行，因此所得到杏仁核細胞鈣離子的表 現 ， 即 具 有 代 表 價 值 。 為 了 更 進 一 步 純 化 所 得 的 鈣 離 子 訊 息 ， 我 們 希 望 能 夠 對 單 顆 的 杏 仁 核 細 胞 做 影 像 處 理 ， 得 到 單 顆 細 胞 的 鈣 離 子 活 性 訊 息，我們再實驗末了時，將細胞以福馬林固定。之後嘗試以硝酸銀染色， 並 在 光 學 系 統 下 ， 得 到 先 前 所 進 行 鈣 離 子 影 像 處 理 的 細 胞 位 置 。 因 此 ， 在 我 們 的 實 驗 中 ， 我 們 除 了 可 以 對 整 區 的 杏 仁 核 細 胞 做 影 像 處 理 以 外 ， 還可以對單顆杏仁核的鈣離子訊息做研究。

運 動 訓 練 對 憂 鬱 症 老 鼠 影 響 之 生 理 機 轉 評 估 圖 2：老鼠杏仁核以硝酸銀染色結果 圖 2 左圖是一個倍率比較低的鏡頭所的的影像，左圖右邊較黑的區 域為紋狀體延伸的部位。焦距較清楚的區位為杏仁核區。右區是 40X 的 鏡頭所得的影像。

肆、結論

本研究主要結論如下 1. 早期隔 離老 鼠會造成憂鬱的傾向。 2. 憂鬱的 老鼠其杏仁核中 MAPK 磷酸化活性會增高。 3. 運動訓 練會改善憂鬱的情況。 4. 鈣 離 子 影 像 可 以 用 來 量 化 杏 仁 核 的 神 經 細 胞 活 性 ， 做 為 未 來 研 究 憂鬱症基轉的工具。

伍、參考文獻：

（略）

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Abstract

Mood disorders are among the most prevalent forms of mental illness. Sever forms of depression affect 2-5%of the U.S. population and up to 20%of the population suffer from milder forms of the illness. Numerous studies have shown that early life stress in nonhuman primates produces profound and long-lasting changes in behavior ad biological function. Our previous data indicated that the maternal deprivation animal showed a depression-like behavior in response to force swimming tests. Studies on human depression revealed beneficial effects of exercise in the treatment of psychiatric disorders. However, the underlying mechanisms are largely unknown. In this study, the underlying mechanisms of depression will be test in normal, as well ad maternal deprivation rats with or without exercise training. The force-swimming test will be carried out to test the animal behavior before and after exercise treatments. The brain slice calcium image of amygdala will also be investigated for the possible application of future investigation of depression. Our study revealed that amygdala phospho-MAPK level was elevated in maternal deprivation rats. Exercise training can inhibited the immobility time during forced swim test, suggesting a inhibition on depression-like behavior through exercise training. Calcium image of amygdala were also accessible by brain slice preparation. Our data provided a basic foundation for on the application of exercise program on depression treatments.