麵包樹根栓皮與木臘樹核果黃酮類化合 物細胞毒性之研究

國立臺東大學生命科學系碩士班 碩士論文

指導教授：魏百祿 博士

麵包樹根栓皮與木臘樹核果黃酮類化合 物細胞毒性之研究

Cytotoxic flavonoids from Artocarpus communis and Rhus succedanea

研究生：王博緯 撰

中華民國一 零 四 年一月

誌謝

在實驗室度過無數個日子，一步一步的熟練實驗技術，非常感謝百祿 老師提供我實驗與生活上的幫助，讓我能夠在實驗室無後顧之憂的投 入在實驗中。

完成台東的實驗後，經由魏百祿教授的介紹，於高雄醫學大學林 忠男教授實驗室繼續精進實驗技術，雖然在高醫半年的日子裡過得比 台東更加艱辛，但經由林忠男教授與魏百祿教授的指導，學會了基礎 的光譜解析，以完成本篇論文之撰寫。

在光譜測定部分非常感謝高雄醫學大學王淇佳技佐與洪敏源技 佐協助進行核磁共振光譜與質譜之解析，在生物活性測定之部分非常 感謝中國醫藥大學翁靖如教授之協助，而在論文審稿的部分非常感謝 高雄醫學大學香粧品學系柯宏慧老師給予我許多論文撰寫上之建議。

最後要感謝家人提供最大的支持，讓我順利完成學業，將這本論 文獻給我的家人。

中文摘要

本研究是對於臺灣產麵包樹根栓皮與木臘樹核果之黃酮類化合 物分別進行成分分離及純化並進行生物活性之探討。

由臺灣產麵包樹根栓皮中分離得到兩種新的化合物，Ac-U (1) 與 Ac-N (2)，而化合物 2 為天然物界首次分離獲得的新骨架化合物。在

木臘樹核果甲醇萃取物中分離得到三種已知黃酮類化合物，分別為 8,8’’-bis-naringenin (3)、hinokiflavone (4) 與 amentoflavone (5) 三種 biflavonoids。各個成分的結構鑑定是根據各種光譜分析，並與過去文 獻進行比對。將本次分離到的五種 flavonoids 以 MTT 法進行細胞毒

性分析，發現化合物4 對於人類攝護腺癌細胞 PC3 細胞株具有相當

強的細胞毒性，其IC50值為 7.94 ± 1.48 μM。

關鍵詞：麵包樹、木臘樹、biflvonoid、PC3 細胞株

Abstract

In this research we had separated and purified flavonoids from root cortex of Formosa Artocarpus communis and drupe of Formosa Rhus

succedanea, where naturally grown in Taiwan.

Two of new compounds, the Ac-U (1) and Ac-N (2),were isolated from root cortex of Artocarpus communis. Compound 2 is a novel compound with new chemical skelton. On the other hand, three known biflavonoids were isolated from methanolic extract of drupe of Rhus

succedanea, is 8,8′′-bis-naringenin (3), hinokiflavone (4), and

Furthermore, the human prostate cancer cell, PC3, was used in the evalution of cytotoxic assay. The cytotoxic activity of meationed above were assay by standard MTT assay. These results indicated that compound 4 showed significant activity against PC3 cells with an IC50 value of 7.94

± 1.48 μM.

Keyword: Artocarpus communis; Rhus succedanea; biflavonoid; PC3 cell

目錄

第一章 研究動機與目的 ... 1

第二章 臺灣產麵包樹化學成分研究 ... 4

第一節 植物型態 ... 4

第二節 抽取與分離 ... 5

第四節 化學成分之結構式證明 ... 7

第一項 Ac-U (1) 的結構式證明： ... 7

第二項 Ac-N (2) 的結構式證明： ... 18

第三章 臺灣產木臘樹化學成分研究 ... 29

第一節 植物型態 ... 29

第二節 抽取與分離 ... 30

第四節 化學成分之結構式證明 ... 31

第一項 8,8′′-bis-naringenin (3) 的結構式證明： ... 31

第二項 hinokiflavone (4) 的結構式證明： ... 37

第三項 amentoflavone (5) 的結構式證明： ... 42

第四章 生物活性試驗結果 ... 48

第五章 結論... 50

第六章 實驗部分 ... 51

第一節 儀器與材料 ... 51

第二節 實驗方法 ... 53

第三節 生物活性試驗篩選方法 ... 54

第四節 化合物之物理化學性質 ... 56

參考文獻 ... 61

表目錄

表 一 、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of AC-U and Cyclocomuno-methonol ... 17 表 二 、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of AC-N and artocommunol CE ... 28 表三、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of 8,8′′-bis-naringenin and naringenin ... 36 表四、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of hinokiflavone and apigenin ... 41 表五、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of amentoflavone and apigenin ... 47 表六、 Cytotoxity of 1, 2, 3, 4 and 5 ... 49

圖目錄

圖1. Ac-U (1) 結構圖 ... 7

圖 1-1. Ac-U (1) 的 ESI-MS 光譜 ... 10

圖 1-2. Ac-U (1) 的紅外光譜 ... 10

圖 1-3. Ac-U (1) 的紫外光譜 ... 11

圖 1-4. Ac-U (1) 的氫光譜 ... 11

圖 1-5. Ac-U (1) 的碳光譜 ... 12

圖 1-6. Ac-U (1) 的 DEPT 光譜 ... 12

圖 1-7. Ac-U (1) 的 HSQC 光譜 ... 13

圖 1-8. Ac-U (1) 的 HSQC 放大光譜 ... 13

圖 1-9. Ac-U (1) 的 HMBC 光譜 ... 14

圖 1-10. Ac-U (1) 的 HMBC 放大光譜 ... 14

圖 1-11. Ac-U (1) 的 COSY 光譜 ... 15

圖 1-12. Ac-U (1) 的 COSY 放大光譜 ... 15

圖 1-13. Ac-U (1) 的 NOESY 光譜 ... 16

圖 1-14. Ac-U (1) 的 NOESY 放大光譜 ... 16

圖 2. Ac-N (2) 結構圖 ... 18

圖 2-1. Ac-N (2) 的 EI-MS 光譜 ... 21

圖 2-2. Ac-N (2) 的紅外光譜譜 ... 21

圖 2-3. Ac-N (2) 的紫外光譜譜 ... 22

圖 2-4. Ac-N (2) 的氫光譜 ... 22

圖 2-5. Ac-N (2) 的碳光譜 ... 23

圖 2-6. Ac-N (2) 的 DEPT 光譜 ... 23

圖 2-7. Ac-N (2) 的 HSQC 光譜 ... 24

圖 2-8. Ac-N (2) 的 HSQC 放大光譜 ... 24

圖 2-9. AC-N (2) 的 HMBC 光譜 ... 25

圖 2-10. Ac-N (2) 的 HMBC 放大光譜 ... 25

圖 2-11. AC-N (2) 的 COSY 光譜 ... 26

圖 2-12. Ac-N (2) 的 COSY 放大光譜 ... 26

圖 2-13. Ac-N (2) 的 NOESY 光譜 ... 27

圖 2-14. Ac-N (2) 的 NOESY 放大光譜 ... 27

圖 3. 8,8′′-bis-naringenin (3) 結構圖 ... 31

圖 3-1. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的質譜 ... 33

圖 3-2. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的紅外光譜 ... 33

圖 3-3. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的氫光譜 ... 34

圖 3-4. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的碳光譜 ... 34

圖 3-5. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的 DEPT 光譜 ... 35

圖 4. hinokiflavone (4) 結構圖 ... 37

圖 4-1. hinokiflavone (4) 的質譜 ... 39

圖 4-2. hinokiflavone (4) 的氫光譜 ... 39

圖 4-3. hinokiflavone (4) 的碳光譜 ... 40

圖4-4. hinokiflavone (4) 的 DEPT 光譜 ... 40

圖 5. amentoflavone (5) 結構圖 ... 42

圖 5-1. amentoflavone (5) 的質譜 ... 44

圖 5-2. amentoflavone (5) 的紅外光譜 ... 44

圖 5-3. amentoflavone (5) 的氫光譜 ... 45

圖 5-4. amentoflavone (5) 的碳光譜 ... 45

圖 5-5. amentoflavone (5) 的 DEPT 光譜 ... 46

本論文中化合物之結構式：

O HO

OH O OH OH O

O HO

OH

1: Ac-U 2: Ac-N

3: 8,8′′-bis-naringenin 4: hinokiflavone

5: amentoflavone

第一章 研究動機與目的

膀胱癌病患人數每年持續增加中，在治療上除了以外科方法切除

外，一般以化療藥物膀胱內灌注，可減少復發之風險，但如果此方法

無效時將會復發或轉移，並且此方法有發燒或血尿等副作用 ⁽⁴⁾，因此

有效化療藥物需要進行開發。

攝護腺癌 (carcinoma of the prostate) 也是高發生率之男性癌病，

目前治療上皆以攝護腺癌根除術與局部照射，但對於復發或轉移部份 療效有限，目前並無有效之化療藥物。一般而言高脂肪飲食與攝護腺 癌之發生、復發及轉移有關，相較低脂飲食並配合食用深綠色蔬菜會 減少攝護腺癌之發生，這些預防發生攝護腺癌之食物，皆屬於具抗氧 化作用之多酚類植物化學成分，如茄紅素、兒茶素與大豆雌激素，這

些成分被認為能經由抗氧化途徑和抑制細胞增殖的癌症保護作用^(5-6)。

桑科 (Moraceae) 植物為常綠喬木、灌木或草本植物，多分布在

溫帶、亞熱帶及熱帶區域，其中包含 60 屬 1400 多種，較常見的為桑

屬 (Morus)，波羅蜜屬 (Artocarpus) 以及榕屬 (Ficus) ⁽³⁾。麵包樹為波 羅蜜屬植物，近年來已進行相當多研究，1991 年 Shien 等人由麵包樹 根 皮 中 分 離 獲 得 lupeol acetate 、 artomunoxanthone 、 artomunoxanthentrione⁽⁷⁾；2003 年 Chan 等人由麵包樹根皮中分離獲得

五種新的prenylflavonoids，artocommunols CA、CB、CC、CD 與 CE⁽⁸⁾； 2005 年 Wei 等人將麵包樹與波羅蜜中分離獲得的 15 種成分進行活性

分析，發現其中dihydroisocycloartomunin 具有抗發炎活性⁽⁹⁾；2006 年 Weng 等人將麵包樹根皮分離出的六種化合物進行活性分析，發現其 中dihydroartomunoxanthone、artochamins B、artocommunol CC 具有 顯著的抑制腎上腺所引導之血小板二次凝集⁽¹⁰⁾；2009 年 Lin 等人由 麵包樹根皮中分離獲得cyclogeracommunin 與 artoflavone A 兩種新的 prenylflavonoid，經分析後發現具有 DPPH 清除活性與抑制 xanthine oxidase (XO)活性⁽¹¹⁾；2014 年 Lin 等人對麵包樹果實及葉部之甲醇萃

取物進行分析，發現其中的成分 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) 透過調控 COX-2 可減弱腫瘤之發病率與體積⁽¹²⁾。

漆樹科植物為喬木或灌木，分布於世界各地，其中包括 72 個屬 600 多種，較常見的為腰果屬（Anacardium）與鹽膚木屬（Rhus）⁽¹³⁾。 木臘樹為鹽膚木屬植物，近年來對於其中之成分進行相當多研究。

1989 年 Lin 等 人 對 於 木 臘 樹 果 實 中 成 分 進 行 分 析 ， 共 純 化 出 hinokiflavone 等 22 種成分，並經過細胞毒性分析，發現 hinokiflavone 是其中最具有細胞毒性之成分⁽¹⁴⁾。2002 年 Wu 等人由木臘樹樹液中分 離 獲 得 10′(Z),13′(E),15′(E)-heptadecatrienylhydroquinone 與 10′(Z),13′(E)-heptadecadienylhydroquinone 兩種新的 hydroquinone，並

經過分析具有抗氧化與細胞毒性之活性⁽¹⁵⁾。

由以上結果可知麵包樹與木臘樹具有相當不錯的生物活性，值得 繼續開發研究。因此本研究乃繼續進行臺灣產麵包樹 (A. communis) 與木臘樹 (R. succedanca) 中黃酮類化合物的研究，期望能利用各種 分離技術，將成分分離純化，並利用各種光譜技術決定化合物結構。

另外配合生物活性之篩選，分析各種黃酮類化合物之生物活性，提供 未來藥物開發之利用。

第二章 臺灣產麵包樹化學成分研究

第一節 植物型態

學名：Artocarpus communis⁽¹⁾ 英名：Bread-fruit Tree

土名：麵包樹

型態：大喬木。葉長 30～60 cm，厚革質，卵形至卵狀長橢圓形，

全緣或具 3～9 裂片，側脈 9～12 對。花序單生葉腋，雄花序

長 25～40 cm，雄花長 2～5 mm，花被 2 裂，雄蕊 1 枚；雌 序廣卵形，長4～6 cm，徑 3～5 cm；雌花具雌蕊 1 枚，花柱 單一，柱頭 2 裂。聚合果球形或橢圓形，徑 10～20 cm，有

海棉狀果托，種子扁卵形，長1.4～1.7 cm。

分佈：臺灣產於東南部沿岸地區，蘭嶼亦產，喜高溫，多濕及陽光 光充裕之處，分布太平洋群島。

用途：聚合果肉部組織海綿狀，有如土司麵包，可烤食或如麥麩之為 湯料，乃有麵包樹之稱。樹型高大，供為園林樹；木材為熱帶 之主要用材。

第二節 抽取與分離

臺灣產麵包樹於 94 年 8 月採於高雄縣，共計 3 公斤，取根栓皮部 0.46 公斤以二氯甲烷在室溫下抽取，靜置一星期後，將抽出液經減壓濃縮 後分別以矽膠管柱層析法分離，共分離出兩種化合物，分離流程如下：

第四節 化學成分之結構式證明

第一項 Ac-U (1) 的結構式證明：

化合物 1，比旋光度為 [α]²⁵D -8^o (c 0.04，Acetone)，紅外光譜(圖 1-2)在 3431 cm^-1 有羥基的吸收，1635 cm^-1 為共軛羰基的吸收，1535 cm^-1 為芳香環的吸收，紫外光譜(圖 1-3)在波長 263，388 nm 有最大 吸收，在加入氯化鋁 (AlCl3) 及醋酸鈉 (NaOAc) 光譜吸收有往長波 長移動的現象，顯示化合物 1 具有 5, 7-dihydroxy flavonoid 之骨架。

氫光譜 (圖 1-4，Acetone-d6) δ 1.67 與 δ 1.89 (3H, d, J = 1.2 Hz)為 isoprenyl group 之訊號，δ 5.48 (1H, br d, J = 9.5 Hz) 為 vinylic proton 之訊號，6.15 (1H, d, J = 9.5 Hz) 為 vinylic proton 之訊號，δ 6.24 與 δ 6.52 為 A 環上 5,7-dihydroxy substitution 之 meta-coupled protons，而 δ 6.45 (1H, s) 與 δ 7.37 (1H, s)表示 B 環上為 tetrasubstituted，但其中

圖 1. Ac-U (1) 結構圖

一個基團為 δ 3.90 之 methoxy 訊號，δ 0.88 與 δ 0.95 為 secondary methyl 訊號，δ 1.67 與 δ 1.92 為 tertiary methyl 訊號，δ 4.28 (2H, m)

為 oxygenated proton 訊 號 ， 其 他 δ 1.34 與 δ 1.46 (2H, m) 為 methylane proton 的訊號。碳光譜(圖 1-5，Acetone-d6) 化學位移的排 列是根據 DEPT 光譜進行排列，共有二十七個碳訊號，五支單峰之

甲基訊號，三支亞甲基支吸收訊號，七支次甲基及十二支四級碳之吸 收訊號，並將其與文獻比對，發現與 Cyclocomunomethonol 大致相同 (表一)⁽¹¹⁾，其中差別在增加 δ 11.4、δ 14.3、δ 23.6、δ 24.6、δ 39.8、δ 68.0 等碳吸收訊號。結構式的確認是透過 HSQC (圖 1-7)、HMBC (圖 1-9)、COSY (圖 1-11)與 NOESY (圖 1-13) 等二維光譜來加以證實，

根據COSY 光譜中 δ 1.34 (2H, m, CH2) 與 δ 1.75 (1H, m, CH) 的氫 有交錯峰，並且HMBC 光譜中 δ 0.88 (Me-18)及 δ 0.95 (Me-19)兩支甲 基之訊號與δ 23.6 (C-17) 的三級碳有偶合關係，可建立 CH2-CH(CH3)2

之結構；而δ 1.34 (2H, m, H-16) 與 δ 39.8 (C-15)、δ 1.46 (2H, m, H-15) 與δ 68.0 (C-14)、δ 4.28 (2H, m, H-14) 與 δ 39.8 (C-15)皆有碳氫偶合 關係，因此建立了CH2- CH2-CH2-CH(CH3)2 之結構，最後根據 HMBC 光譜中 δ 4.28 (2H, m, H-14) 與 δ 166.1 (C-4′) 確認 CH2- CH2-CH2- CH(CH3)2之結構是與B 環所相連。NOESY 光譜中 δ 7.37 (H-6′)/ δ 3.90 (H-7′) 、δ 4.28 (H-14)/ δ 1.46 (H-15)、δ 6.15 (H-9)/ δ 1.92 (H-13) 有交

錯峰，可輔助確認C-14 與 C-15 之鍵結。根據 ESI+ MS 質譜(圖 1-1) 可分辨出分子離子峰 m/z 466，推算出其分子式為 C27H30O7，其餘重

要離子峰為

m/z 452 [M-Me]

圖 1-2. Ac-U (1) 的紅外光譜 圖 1-1. Ac-U (1) 的 ESI-MS 光譜

圖 1-4. Ac-U (1) 的氫光譜 圖 1-3. Ac-U (1) 的紫外光譜

圖 1-5. Ac-U (1) 的碳光譜

圖 1-6. Ac-U (1) 的 DEPT 光譜

圖 1-7. Ac-U (1) 的 HSQC 光譜

圖 1-8. Ac-U (1) 的 HSQC 放大光譜

圖 1-9. Ac-U (1) 的 HMBC 光譜

圖 1-10. Ac-U (1) 的 HMBC 放大光譜

圖 1-11. Ac-U (1) 的 COSY 光譜

圖 1-12. Ac-U (1) 的 COSY 放大光譜

圖 1-13. Ac-U (1) 的 NOESY 光譜

圖 1-14. Ac-U (1) 的 NOESY 放大光譜

表 一 、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of AC-U and Cyclocomuno- methonol^a

Carbon AC-U^b Cyclocomunomethonol^b

2 156.2 158.7

3 110.0 110.7

4 179.0 179.7

4a 107.2 107.9

5 158.1 158.7

6 99.8 100.4

7 164.7 165.3

8 94.9 95.6

8a 163.3 164.0

9 69.9 70.6

10 122.0 122.7

11 138.7 139.4

12 25.9 19.3

13 18.6 26.5

14 68.0

15 39.8

16 24.6

17 23.6

18 14.3

19 11.4

1' 110.0 110.7

2' 153.7 153.8

3' 105.5 106.1

4' 166.1 154.4

5' 144.2 139.4

6' 107.0 107.7

7' 57.0 57.6

a The number of protons directly attached to each carbon was verified by DEPT and HMQC experiments.

b Measured in acetone-d6.

第二項 Ac-N (2) 的結構式證明：

化合物 2，比旋光度為 [α]²⁵D -18^o (c 0.05，Acetone)，紅外光譜 (圖 2-2)在 3424 cm^-1 有羥基的吸收，1631 cm^-1 有共軛羰基的吸收，

1723 cm^-1有酮基的吸收，1557 cm^-1 為芳香環的吸收，紫外光譜(圖 2- 3)在波長 268 與 385 nm 有最大吸收，在加入氯化鋁 (AlCl3) 光譜吸

收有往長波長移動的現象，顯示C-5 位上有游離羥基 (hydroxyl group)。

氫光譜 (圖 2-4，Acetone-d6) 可看出 A 環上有一個 hydroxyl group 訊號為 δ 13.20 (1H, s, OH-5)，而 δ 5.76 (1H, d, J = 10 Hz, H-17) 與δ 6.72 (1H, d, J = 10, H-16)為 2,2-dimethylpyran ring，並且 pyran 環 上有兩個甲基訊號為δ 1.46 (3H, s, H-19) 與 δ 1.47 (3H, s, H-20)，其 餘氫訊號分別為δ 0.86 (3H, s)、δ 1.20 (3H, s)、δ 2.20 (3H, s)、δ 2.45 (2H, m)、δ 2.72 (1H, m)、δ 2.77 (1H, d, J = 10 Hz)、δ 2.85 (1H, s)、δ

圖 2. Ac-N (2) 結構圖

2.86 (2H, m)、δ 3.15 (1H, m)、δ 3.40 (1H, m)、δ 3.79 (1H, m)、δ 5.33 (1H, d, J = 10 Hz)。碳光譜(圖 2-5，Acetone-d6) 化學位移的排列是根 據 DEPT 光譜(圖 2-6) 進行排列，共有二十六個碳訊號，五支單峰之

甲基訊號，兩支亞甲基支吸收訊號，七支次甲基及十二支四級碳之吸 收訊號。Ac-N (2) 之 C-4 至 C-8 與 C-14 至 C-18 的 carbon signals 與 文獻 artocommunol CE 相對應之 carbon signals 幾乎一致 (表二)⁽⁸⁾。 結構式的確認是透過 HSQC (圖 2-7)、HMBC (圖 2-9)、COSY (圖 2- 11)與 NOESY (圖 2-13) 等二維光譜來加以證實，根據 COSY 光譜中 δ 2.72 (H-10)/ δ 3.79 (H-14)、δ 2.85 (H-13)/ δ 3.79 (H-14) 有交錯峰，

以及HMBC 光譜中 δ 2.77 (H-12)/ δ 45.6 (C-10) 有三鍵的碳氫偶合關 係 (³JCH)、δ 2.77 (H-12)/ δ 39.0 (C-11) 有兩鍵的碳氫偶合關係 (²

J

δ 2.77 (H-12)/ δ 34.5 (C-13) 有兩鍵的碳氫偶合關係 (²

J

至 C-14 為一個五元環結構，並且由 HMBC 光譜中 δ 1.20 (H-21)/ δ 39.0 (C-11) 有兩鍵的碳氫偶合關係 (²

J

J

J

J

有含 ketone 之 prenyl group。證明此五元環之鍵結位置部分是藉由 HMBC 光譜中，δ 3.79 (H-14)/ δ 160.8 (C-2) 有三鍵的碳氫偶合關係 (³JCH)、δ 2.72 (H-10)/ δ 23.8 (C-19) 有兩鍵的碳氫偶合關係 (³JCH)、δ 2.86 (H-9′)/ δ 182.5 (C-4) 有三鍵的碳氫偶合關係 (³JCH)，因此可確認 cyclohexanone 環與 cyclopentane 互相鍵結。

立體構型部分根據 H-10 周圍三個鍵結為平行，因此 H-10 其立

體構型為α-構型，並且根據 NOESY 光譜可看出 H-10/ H-14、H-10 / H-9、H-9 / H-21、H-14/ H-23、H-13 / H-14、H-22 / H-12 有 NOE 之關

係，藉此判斷H-9、H-10、H-12、H-13、H-14 立體構型為 α-構型。

根據 EI-MS 質譜(圖 2-1)可分辨出分子離子峰 m/z 452，推算出 其分子式為 C26H28O7，其餘重要離子峰為

m/z 419 [M-CH

以上證據得知化合物結構並將此成分代號稱為 Ac-N，並查閱文獻得

知此化合物為天然界首次分離得到之新骨架化合物。

圖 2-1. Ac-N (2) 的 EI-MS 光譜

圖 2-2. Ac-N (2) 的紅外光譜

圖 2-3. Ac-N (2) 的紫外光譜

圖 2-4. Ac-N (2) 的氫光譜

圖 2-5. Ac-N (2) 的碳光譜

圖 2-6. Ac-N (2) 的 DEPT 光譜

圖 2-7. Ac-N (2) 的 HSQC 光譜

圖 2-8. Ac-N (2) 的 HSQC 放大光譜

圖 2-9. AC-N (2) 的 HMBC 光譜

圖 2-10. Ac-N (2) 的 HMBC 放大光譜

圖 2-11. AC-N (2) 的 COSY 光譜

圖 2-12. Ac-N (2) 的 COSY 放大光譜

圖 2-13. Ac-N (2) 的 NOESY 光譜

圖 2-14. Ac-N (2) 的 NOESY 放大光譜

表二、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of AC-N and artocommunol CE^a

Carbon AC-N^b artocommunol CE^b

2 160.8 157.2

3 117.3 110.6

4 182.5 179.9

4a 106.0 106.7

5 163.3 160.6

6 100.9 101.1

7 160.5 160.6

8 102.5 103.0

8a 153.5 152.7

9 23.8 71.0

10 45.6 122.7

11 39.0 139.6

12 76.1 26.5

13 34.5 19.3

14 49.0

15 200.5

16 115.9 122.7

17 129.0 129.4

18 79.7 79.5

19 20 21 22 23 24 25

28.9 29.0 25.9 32.6 51.8 209.0

31.7

29.0 29.0

1' 109.0

2' 159.8

3' 105.5

4' 164.9

5' 111.6

6' 130.5

a The number of protons directly attached to each carbon was verified by DEPT and HMQC experiments.

b Measured in acetone-d6.

第三章 臺灣產木臘樹化學成分研究

第一節 植物型態

學名：Rhus succedanea⁽²⁾ 英名：Wax Tree

土名：山漆、野漆、山賊仔

型態：落葉喬木。奇數羽狀複葉，互生，常集生枝端，小葉9～15

片，對生或近對生，紙質或薄革質，卵狀披針形，平滑，長 5～16 cm，殆無柄，全緣，先端漸尖，基部圓形。花單性，

略偏斜，雌雄異株，圓錐花序腋生，平滑；核果扁歪球形，徑

約8 mm，中果皮厚，臘質，果核堅硬，扁壓狀。

第二節 抽取與分離

臺灣產木臘樹於 102 年 7 月採於高雄縣，共計 2 公斤，取核果 以甲醇在室溫下抽取，靜置一星期後，將抽出液經減壓濃縮後分別 以矽膠管柱層析法分離，共分離出三種化合物，分離流程如下：

第四節 化學成分之結構式證明

第一項 8,8′′-bis-naringenin (3) 的結構式證明：

化合物 3，紅外光譜(圖 3-2)在 3363 cm^-1 有羥基的吸收，1630 cm^-

1 為共軛羰基的吸收。氫光譜 (圖 3-3，Acetone-d6) 中 δ 2.85 (2H, dd,

J = 17 and 3 Hz, H-3

O O

OH OH

HO

HO

OH

O

O

OH

6' 5'

4' 2' 3'

1' 2 4 3

9 5 10 6 7

8

8'' 4'''

2'' 1'''

3''' 2'''

6''' 5'''

4'' 3'' 10'' 7'' 9''

5'' 6''

圖 3. 8,8′′-bis-naringenin (3) 結構

flavonoid 的 B 環上之羥基訊號。碳光譜 (圖 3-4，Acetone-d6) 化學位 移的排列是根據 DEPT 光譜(圖 3-5)進行排列，共有三十個碳訊號，

兩支亞甲基支吸收訊號，十二支次甲基及十六支四級碳之吸收訊號，

根據文獻查詢，判斷其單體為 naringenin (表三)，並根據 8 與 8′′′ 號 位上碳的訊號往低場 +1.1 ppm 與 +1.2 ppm^(16-17)，以及 EI-MS 質譜 ( 圖 3-1) 中 可 分 辨 出 分 子 離 子 峰 m/z 542 ， 推 算 出 其 分 子 式 為 C30H22O10，根據以上光譜可確定化合物3 為 8,8’’-bis-naringenin。

圖 3-1. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的質譜

圖 3-2. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的紅外光譜

圖 3-3. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的氫光譜

圖 3-4. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的碳光譜

圖 3-5. 8,8′′-bis-naringenin (3) 的 DEPT 光譜

表 三 、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of 8,8′′-bis-naringenin and naringenin^a

Carbon 8,8′′-bis-naringenin ^b naringenin^b

2 80.0 78.4

3 43.8 42.0

4 197.8 196.2

5 163.7 163.6

6 97.3 95.9

7 166.6 166.7

8 96.1 95.9

9 100.8 162.9

10 160.0 101.8

1′ 129.1 128.9

2′ 129.6 128.2

3′ 116.7 115.2

4′ 158.7 157.8

5′ 116.7 115.2

6′ 129.6 128.2

2′′ 80.4

3′′ 43.8

4′′ 197.8

5′′ 163.0

6′′

7′′

8′′

9′′

10′′

1′′′

2′′′

96.1 166.6

97.2 102.0 160.0 129.1 129.6

3′′′ 116.7

4′′′ 158.8

5′′′ 116.7

6′′′ 129.6

a The number of protons directly attached to each carbon was verified by DEPT experiments.

b Measured in acetone-d6.

第二項 hinokiflavone (4) 的結構式證明：

化合物 4，紅外光譜(圖 4-2)在 3340 cm^-1 有羥基的吸收， 1660 cm^-1 為共軛羰基的吸收。氫光譜(圖 4-3，Acetone-d6)中 δ 6.20 (1H, br s, H-6) 、δ 6.49 (1H, br s, H-8) 與 δ 6.73 (1H, br s, H-8′′)為 flvoniod A 環上之氫訊號，δ 6.84 (2H, d, J = 1.2 Hz, H-3, 3′′) 為 pyran 環上 3 位上 的氫訊號，δ 6.93 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3′′′, 5′′′)、δ 7.04 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3′, 5′ )、δ 7.95 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2′′′, 6′′′)、δ 8.00 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2′, 6′)為 flvoniod B 環上之氫訊號，δ 12.87 (2H, s, OH-5, 7)

為flvoniod A 環上之羥基訊號，δ 13.19 (1H, s, OH-4′′′)為 B 環上之羥 基訊號。

碳光譜(圖 4-4，Acetone-d6) 化學位移的排列是根據 DEPT 光譜

O

O

O

OH

O

O OH

HO HO

OH

1' 2'

3' 4' 5' 6'

1''' 2'''

3''' 4'''

5''' 6''' 7

6 5

8 9 10

4 3

2

6'' 7'' 8''

9''

5'' 10''

2''

3'' 4''

圖 4. hinokiflavone (4) 結構圖

之吸收訊號，並可看出有兩組黃酮類化合物之訊號，根據 δ 128.6 與 δ 115.5 兩組訊號可判斷出其黃酮類化合物 B 環上只有接上一個羥基，

並根據文獻查詢，判斷為 biflavonoid 並且其單體為 apigenin (表四)。

而其中6′′位上碳訊號往低磁場位移 + 25.3 ppm，並且 5′′ 與 7′′ 位上 碳訊號分別往高磁場位移 - 8.3 ppm 與 – 6.4 ppm，故推論其為 O- linked 之 biflavonoid。並由文獻中之碳譜比對，以及質譜(圖 4-1)中分 子離子峰 m/z 538，推算出分子式為 C30H18O10，確認化合物 4 為 hinokiflavone^(17-18)。

圖 4-1. hinokiflavone (4) 的質譜

圖 4-2. hinokiflavone (4) 的氫光譜

圖 4-3. hinokiflavone (4) 的碳光譜

圖4-4. hinokiflavone (4) 的 DEPT 光譜

表四、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of hinokiflavone and apigenin^a

Carbon hinokiflavone ^b apigenin^b

2 164.4 164.1

3 104.1 102.8

4 182.0 181.8

5 160.8 161.5

6 99.1 98.8

7 163.4 163.7

8 94.8 94.0

9 157.5 157.3

10 104.3 103.7

1′ 124.8 121.3

2′ 128.8 128.4

3′ 115.5 116.0

4′ 161.5 161.1

5′ 115.5 116.0

6′ 128.8 128.4

2′′ 164.4

3′′ 102.7

4′′ 182.3

5′′ 153.2

6′′

7′′

8′′

9′′

10′′

1′′′

2′′′

124.4 157.3 94.2 154.0 104.0 121.3 128.6

3′′′ 116.2

4′′′ 161.6

5′′′ 116.2

6′′′ 128.6

a The number of protons directly attached to each carbon was verified by DEPT experiments.

b Measured in acetone-d6.

第三項 amentoflavone (5) 的結構式證明：

化合物 5，紅外光譜(圖 5-2)在 3300 cm^-1 有羥基的吸收，1600 cm^-1 為共軛羰基的吸收。氫光譜(圖 5-3，Acetone-d6) 中可看出 6.23 (2H, d, J = 2.0 Hz, CH-6, 6'')與 6.45 (1H, s, CH-8) 為 flavonoid A 環中 之氫訊號，6.51 (2H, d, J = 2.4, CH-3, 3'')  為 pyran 環上 3 位上的氫訊 號，6.66 (1H, s, CH-3''')、6.72 (1H, s, CH-5''') 與 7.24 (2H, d, J = 8.4, CH-2''', 6''') 為 flavonoid B 環上之氫訊號，7.65 (1H, s, CH-3') 與 8.12 (2H, d, J = 2.4, CH-2', 6')為另一組 flavonoid B 環上之氫訊號，9.50 (2H, m, COH-4', 4''') 為 B 環上之羥基訊號，13.00 (2H, s, COH-7, 7'') 與 13.17 (2H, s, COH-5, 5'') 為 A 環上之羥基訊號。碳光譜 (圖 5-4，

圖 5. amentoflavone (5) 結構圖

共有三十個碳訊號，十二支次甲基及十八支四級碳之吸收訊號，並與

過去文獻中提到之 biflavonoid 之碳訊號進行比對其中藉由碳訊號中

C-3′ 與 C-8′′訊號分別往低磁場位移 + 7.5 ppm 與 + 11.3 ppm，確認

其為 3′,8′′ C-linked di-apigenin (表五)。質譜(圖 5-1)中分子離子峰為

m/z 540，推算出分子式為 C

圖 5-1. amentoflavone (5) 的質譜

圖 5-2. amentoflavone (5) 的紅外光譜

圖 5-3. amentoflavone (5) 的氫光譜

圖 5-4. amentoflavone (5) 的碳光譜

圖 5-5. amentoflavone (5) 的 DEPT 光譜

表五、 13C NMR spectroscopic chemical shifts of amentoflavone and apigenin^a

Carbon amentoflavone ^b apigenin^b

2 164.0 164.1

3 104.3 102.8

4 183.7 181.8

5 165.7 161.5

6 100.5 98.8

7 156.7 163.7

8 95.4 94.0

9 156.6 157.3

10 105.3 103.7

1′ 123.7 121.3

2′ 133.2 128.4

3′ 118.2 116.0

4′ 159.5 161.1

5′ 121.8 116.0

6′ 129.4 128.4

2′′ 165.8

3′′ 104.8

4′′ 184.1

5′′ 163.3

6′′

7′′

8′′

9′′

10′′

1′′′

2′′′

100.5 163.9 106.0 156.7 105.3 123.8 129.8

3′′′ 117.4

4′′′ 162.6

5′′′ 117.4

6′′′ 129.8

a The number of protons directly attached to each carbon was verified by DEPT experiments.

b Measured in acetone-d6

第四章 生物活性試驗結果

將臺灣產麵包樹與木臘樹所分離得到的成分，Ac-U (1) 、 Ac-N (2) 、 8,8′′-bis-naringenin (3) 、 hinokiflavone (4) 與 Amentoflavone (5) 分別進行細胞毒殺試驗。細胞毒殺活性試驗則是與中國醫藥大學 翁靖如教授合作進行試驗。

第一節 細胞毒殺試驗篩選結果

將臺灣產麵包樹與木臘樹所得之成分進行細胞毒殺試驗，結果 顯示 4 對人類攝護腺癌細胞(PC3)具有很強的抑制活性，其 IC50值 分別為(表六)。

2012 年 Zhang 等人對於數種化合物進行細胞毒性分析， 其中 hinokiflavone 對於人類腦瘤細胞株 U251、人類子宮頸癌細胞株 Hela、

MCF-7 三種細胞株進行分析，發現其 IC50值分別為29.81 ± 2.89 、 19.27 ± 0.84 與 39.32 ± 4.38 μg/mL⁽¹⁹⁾，與本次試驗結果皆顯示 出具有一定程度之毒殺活性，因此 hinokiflavone 或許可作為潛在的 腫瘤治療藥物，在未來對癌症治療方面進行應用。

表六、 Cytotoxity of 1, 2, 3, 4 and 5 (IC50 values in μM)

compound

Cell line PC3

1 NS

2 NS

3 56.3 ± 4.27

4 7.94 ± 1.48

5 34.8 ± 5.44

etoposide 6.60 ± 1.31

NS, no significant activity of the pure compounds.

第五章 結論

並與正控制組 etoposide 相比，具有類似的效果，故 hinokiflavone 可作為潛在的腫瘤治療藥物，在未來對癌症治療方面進行應用。

第六章 實驗部分

第一節 儀器與材料

一、 儀器

1. 核磁共振光譜儀 ( Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer ， NMR ) 以 Burker-100，400 MHz FT-NMR Spectrometer ， Virian Gemini-200 MHz FT-NMR Spectrometer，Unity-400 MHz FT-NMR Spectrometer 測定。化學位移 (Chemical Shift)：以 δ 值 (Part per million；ppm) 表示。吸收信號縮寫如下： S (singlet)，d (doublet)，t (triplet)， m (multiplet)， br d (broad doublet)， br t (broad triplet)， dd (double boublet)。

2. 紅外線光譜 (Infrared Spectrophotometer，IR) 以 Perkin Elmer Syetem 2000 FT-IR Spectrophotometer 測得樣本紅外吸收光譜。

3. 旋光度計 (Polarimeter)

以 Jasco DIP-370 Digital Polarimeter 測得樣本之旋光度[α]^tD。 4. 質譜儀 (Mass Spectra，MS)

Electron Impact Mass (EI-MS) ， 以 JEOL TMSD-100 Mass Spectro-meter 進行測定。

5. 減壓濃縮機與水浴鍋

EYELA Rotary evaporator N-1000 EYELA Digital water bath SB-1000

6. 管柱層析 (Column Chromatography，CC) 玻璃層析管住購自勤興化學藥品儀器行。

7. 薄層層析 (Thin Layer Chromatography，TLC) 檢定方法：

a. 以 UV lamp Manasln-light，254 nm 與 365 nm 照射判讀 b. 10% 硫酸溶液 (H2SO4) 作為呈色劑，加熱後呈色。

二、 材料

(一) 溶媒與化學試藥分別購自下列廠商：

1. 景明化工有限公司：

二氯甲烷 (Dichloromethane)

2. 美國 honeywell-burdick and Jackson

正 己 烷 (n-Hexane) 、 乙 酸 乙 酯 (Ethyl acetate) 、 丙 酮 (Acetone)、甲醇 (Methanol)。

3. 島久藥品株式會社 硫酸 (sulfuric acid)

(二) 核磁共振測定用氘溶媒購自下列廠商：

1. Cambridge Isotope Laboratories, Inc.

氘丙酮 (acetone-D6)、氘甲醇(Methanol-D4)、氘嘧啶 (Pyridine-D5)

2. 德國 E. Merck

氯仿 (Chloroform-D1) (三) 層析材料：

1. 矽膠板片 (TLC plates)：

DC Kieselgel 60 DC Kieselgel 60 F254

DC Kieselgel 60 RP-18 F254s

(德國 E. Merck)。

2. 填充管柱之固定相 (Statinary phase)：

MN-Kieselgel 60，0.063~0.2 mm / 70~230 #ASTM；

MN-Kieselgel 60，0.04~0.063 mm / 230~400 #ASTM (德國 E. Merck)。

第二節 實驗方法

一、 植物採集、抽取與分離

1. 臺灣產麵包樹根栓皮之成分分離

臺灣產麵包樹於 94 年 8 月採於高雄縣，共計 3 公斤，

取根栓皮部 0.46 kg 以二氯甲烷在室溫下抽取，靜置 一星期後，將抽出液經減壓濃縮後分別以矽膠管柱層 析法分離，分離流程以管柱層析法分成正己烷-乙酸乙 酯、二氯甲烷-乙酸乙酯、乙酸乙酯三層，再將乙酸乙

酯層細分後，以 RP-18 管柱進行分離，分離流程如第 二章所示。

2. 臺灣產木臘樹核果之成分分離

臺灣產木臘樹於 102 年 7 月採於高雄縣，共計 2 公 斤，取核果以甲醇在室溫下抽取，靜置一星期後，將 抽出液經減壓濃縮後分別以矽膠管柱層析法分離，以 正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮及甲醇五種溶劑 進行沖提，所得到之乙酸乙酯初分萃取物，再以正己 烷-乙酸乙酯之溶媒系統進行管柱層析，分離過程如第 三章所示。

第三節 生物活性試驗篩選方法

一、 細胞毒殺試驗 1. 實驗材料

a. 木臘樹分離之純化合物。

b. Tumor cell：PC3 cell c. 培養液：

Dublecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco, Grand Island, N.Y.)，10 % Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco)，100 IU/mL Penicillin and 100

μg/mL streptomycin，L-glutamin，Antibiotics d. 培養皿：

Nunc (Denmark) 96-well flat-bottom，Microplates 2. 實驗方法⁽⁴⁾

取 3 ൈ 10³ cells/100 μL 加入 96-well microplates，放置 於恆溫培養箱中培養六小時，再加入各種不同濃度之 藥物，並將其培養三天。取出後，加入 10 μL tetrazolium salt 溶液，並於 37 ^oC 下靜置四小時，以 100 μL DMSO 沖洗 tetrazolium 還原的沉澱物。最後於盤式

分析儀中以波長為550 nm 下測定其光學活性 (Optical density)，其 IC50 值表示藥物能抑制 50% 癌細胞生長 之毒殺劑量。

第四節 化合物之物理化學性質

化合物 (1) Ac-U

C27H30O7

Yellow powder

IR ν ^neat max cm^-1 : 3431 (hydroxyl group),

1635 (conjugated carbonyl group), 1535 (aromatic ring)

UVλ ^MeOH max nm (log ε) : 263 (0.4345), 388(0.2989)

1H-NMR (Acetone-d6): δ

0.88 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3-18) 0.95 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3-19) 1.34 (2H, m, CH2-16)

1.46 (3H, m, CH2-15)

1.67 (3H, d, J = 1.2 Hz, CH3-12) 1.75 (1H, m, CH3-17)

1.92 (3H, d, J = 1.2 Hz, CH3-13) 3.90 (3H, s, CH3-7′)

4.28 (2H, m, CH2-14)

5.48 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-10) 6.15 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-9) 6.24 (H, d, J = 2.0 Hz, H-6) 6.45 (1H, s, H-3')

6.52 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8) 7.37 (1H, s, H-6')

12.90 (1H, s, COH-5)

ESI-MS (direct inlet) 70eV, m/z (rel. int.):

490, 467, 463, 457, 441, 419, 413, 405, 383, 360, 314, 301

HREIMS : found : 382.1047; calcd.: 382.1053

化合物 (2) Ac-N

C26H28O7

Yellow powder

IR ν ^neat max cm^-1 : 3424 (hydroxyl group), 1723 (ketone group)

1631 (conjugated carbonyl group), 1557 (aromatic ring)

UVλ ^MeOH max nm (log ε) : 268 (0.838)

1H-NMR (Acetone-d6): δ 0.86 (3H, s, CH3-21) 1.20 (3H, s, CH3-22) 1.46 (3H, s, CH3-19) 1.47 (3H, s, CH3-20) 2.20 (1H, s, CH3-25) 2.45 (1H, m, CH2-9) 2.72 (1H, m, CH2-10)

2.77 (1H, d, J = 7.2, CH-12) 2.85 (1H, s, CH-13)

2.86 (1H, m, CH-9) 3.15 (1H, m, CH2-23) 3.40 (1H, m, CH2-23) 3.79 (1H, m, CH3-14)

5.33 (1H, d, J = 1.0Hz , COH-12) 5.76 (1H, d, J = 1.0 Hz, CH-17) 6.17 (1H, s, CH-6)

6.72 (1H, d, J = 1.0, CH-16) 13.20 (1H, s, COH-5)

EI-MS (direct inlet) 70eV, m/z (rel. int.):

419 [M+H]⁺, 391, 321, 295, 279, 203, 115, 83, 69, 55 HREIMS : found : 419.1129

化合物 (3) 8,8’’-binaringenin

C27H30O7

Yellow powder

IR ν ^neat max cm^-1 : 3363 (hydroxyl group),

1630 (conjugated carbonyl group) UVλ ^MeOH max nm (log ε) : 263 (0.4345), 388(0.2989)

1H-NMR (Acetone-d6): δ

2.85 (2H, dd, J = 17 and 3 Hz, H-3eq and H-3′′eq) 3.10 (2H, dd, J = 17 and 13 Hz, H-3az and H-3′′az) 5.42 (2H, dd, J = 13 and 3 Hz, H-2, H-2′′)

5.96 (2H, s, H-6, H-6′′)

6.85 (4H,d, H-3′, H-3′′′, H-5′, H-5′′′)

7.40 (4H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, H-2′′′, H-6′, H-6′′′) 9.00 (2H, s, H-4′, H-4′′′)

12.30 (2H, s, H-7, H-7′′) 12.53 (2H, s, H-5, H-5′′)

EI-MS (direct inlet) 70eV, m/z (rel. int.):

542 [M+H]⁺, 422, 404, 302, 285, 218, 192, 120, 91

化合物 (4) hinokiflavone

C30H17O10

Yellow powder

IR ν ^neat max cm^-1 : 3340 (hydroxyl group),

1660 (conjugated carbonyl group)

1H-NMR (Acetone-d6): δ 6.20 (1H, s, CH-6) 6.49 (1H, s, CH-8) 6.73 (1H, s, CH-2''')

6.84 (2H, d, J = 1.2, CH-3, 3'') 6.93 (2H, d, J = 8.8, CH-3''', 5''') 7.02 (2H, d, J = 8.8, CH-3', 5') 7.95 (2H, d, J = 8.8, CH-2''', 6''') 8.00 (2H, d, CH-2', 6')

13.18 (1H, s, CH-4''')

EI-MS (direct inlet) 70eV, m/z (rel. int.):

539 [M+H]⁺, 562 [M+Na]⁺。

化合物 (5) amentoflavone

C30H20O10

Yellow powder

IR ν ^neat max cm^-1 : 3300 (hydroxyl group),

1600 (conjugated carbonyl group)

1H-NMR (Acetone-d6): δ

6.23 (2H, d, J = 2, CH-6, 6'') 6.45 (2H, s, CH-8)

6.51 (2H, d, J = 2.4, CH-3, 3'') 6.66 (1H, s, CH-3''')

6.72 (1H, s, CH-5''')

7.24 (2H, d, J = 8.4, CH-2''', 6''') 7.65 (1H, s, CH-3')

8.12 (2H, d, J = 2.4, CH-2', 6') 9.50 (2H, m, COH-4', 4''') 13.00 (2H, s, COH-7, 7'') 13.17 (2H, s, COH-5, 5'')

LREIMS (direct inlet) 70eV, m/z (rel. int.):

540 [M+H]⁺, 562 [M+Na]⁺

參考文獻

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64 頁)，台北市，行政院農業委員會。

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