自大腸桿菌之細胞間質回收重組肌酸酵素
計畫編號：NSC94-2214-E-006-019- 執行單位：國立成功大學化學工程學系 計畫主持人：陳特良摘要
（關鍵詞：滲透壓衝擊、間質釋放、大 腸桿菌、肌酸酵素） 本 計 畫 提 出 一 個 改 良 式 的 滲 透 壓 衝 擊，用以自大腸桿菌的細胞間質釋放出重組 肌酸酵素。操作步驟如下：以二價金屬離子 處理細胞，離心後將細胞懸浮在含有高濃度 蔗糖和 EDTA 的衝擊溶液中，再次離心後， 將細胞懸浮於去離子水中，以達到間質蛋白 釋放之目的。細胞間質蛋白之釋放機制為： 二價金屬離子(如 Ca2+ )和細胞外膜中的酯多 醣結合，高濃度蔗糖溶液讓細胞收縮，EDTA 使酯多醣剝離以增加細胞外膜的通透性，去 離子水讓細胞快速膨脹而釋放出位於細胞 間質的重組蛋白。以超音波破菌的數據為 準，標準的滲透壓衝擊可得 60%的酵素回收 率和 3.9 倍的純化；本改良式的滲透壓衝擊 則可得 75%的酵素回收率和 4.5 倍的純化。計畫緣由與目的
肌酸(Creatine)是一種非蛋白質的含氮化 合物，它是肌肉、腦以及血液的重要成分； 肌 酸 的 磷 酸 衍 化 物 — 磷 酸 化 肌 酸 (Phosphocreatine)— 為 高 能 量 磷 酸 基 的 來 源。肌酸酐(Creatinine)是肌酸行縮水後的產 物，在正常人血液中之濃度極低，只有 35−140 µM；但是，當腎臟功能不全時，其濃度則可 能會高過 1000 µM。因此，血液中肌酸酐濃 度之高低，是腎臟是否正常的重要指標。肌 酸酐濃度可以用化學方法測之，但是此法易 受血液中的其他成分干擾，而導致準確度不 大。因此，發展具特異性的酵素分析法，便 成為此項臨床檢驗的趨勢，而肌酸酵素的生 產更是其中的關鍵點。 可以生產肌酸酵素之微生物菌屬包括： Alcaligenes 、 Arthrobacter 、 Bacillus 、 Flavobacterium、Micrococcus、Pseudomonas。 在這些野生菌株的醱酵中，常常需要添加高 達 1%的肌酸或肌酸酐作為誘導劑，以誘導肌酸 酵素的合成。然而，肌酸或肌酸酐的價格昂 貴，因此，其大量添加是量產肌酸酵素的一大 限制。為了克服此缺點，可以將野生菌株的 肌酸酵素基因轉殖至大腸桿菌，再以此重組 大腸桿菌醱酵生產肌酸酵素，就可以不需添 加誘導劑。 大腸桿菌是常被用以生產重組蛋白的宿 主細胞。一般而言，大腸桿菌不會將重組蛋 白釋放到胞外；因此，在許多重組基因表現 系統的操控中，所產生的重組蛋白是分泌到 細胞間質—介於內膜和外膜的間隙。目前已 有許多研究致力於發展從細胞間質回收重組 蛋白的技術，包括滲透壓衝擊(Osmotic Shock) (Neu and Heppel, 1965; Nossal and Heppel, 1966)、溶菌素/EDTA (French et al., 1996; Pierce et al., 1997)、重複冷凍-解凍(Johnson and Hecht, 1994) 、熱處 理 (Tsuchido et al.,1985) ， 以 及 使 用 胍 鹽 酸
(guanidine−HCl)/Triton X-100 (Hettwer and Wang, 1989; Naglak and Wang, 1990)、胍鹽酸 /EDTA (Kheirolomoom et al., 2001; Novella et al., 1994)、氯仿(Ames et al., 1984)、甘胺酸 (Ariga et al., 1989)等之化學通透法(Chemical Permeabilization)。在這些技術中，滲透壓衝 擊看起來是最有可能在大規模操作中被使用 者，因為它的效率高、適用性廣，而且無需 有害或昂貴的添加物。
在滲透壓衝擊的操作中(Neu and Heppel, 1965)，首先將細胞懸浮在含有 EDTA 的高濃 度的蔗糖溶液中，細胞會因溶液的高滲透壓 而收縮，同時 EDTA 可以移除外膜中的酯多 醣(Lipopolysaccharide, LPS)，因而增加外膜 的通透性。離心收集細胞後，再將細胞懸浮 在冷水中，此時細胞會快速膨脹，間質蛋白 就可被釋放出來。在此操作中，如何增加外 膜的通透性，是改善間質釋放效率的關鍵點。 格蘭氏陰性菌的細胞外殼包含有三個結 構：內膜、胜多醣體(peptidoglycan)、外膜。
除了極性酯質和蛋白質外，外膜還含有 15 至 40% (wt)的 LPS (Bayer and Leive, 1977)。LPS 是由二價陽離子所穩定，而且外膜的通透性 障礙和 LPS 的存在有關。以 EDTA 處理細胞 可提高其通透性，是因為 EDTA 和此二價陽 離 子 螯 合 ， 而 導 致 LPS 的 脫 落 (Hamilton-Miller, 1966)。再者，假如細胞在 以 EDTA 處理之前，先和高濃度(50 mM)的 Ca2+或 Mg2+接觸，則釋放出 LPS 的量會增加 (Leive, 1974; van Alphen et al., 1978)。以這些 報導為理論基礎，本計畫提出一個以二價金 屬離子前處理的改良式滲透壓衝擊，用以自 基因重組大腸桿菌的細胞間質回收肌酸酵 素。
實驗材料與方法
本 研 究 所 使 用 之 菌 株 為 E. coli JM109/pSCR05，由成功大學生化研究所張敏 政 教 授 所 提 供 。 質 體 pSCR05 帶 有 Pseudomonas putida 的肌酸酵素基因，由 lac 啟動子(Promoter)所控制。此重組肌酸酵素具 有從 Aeromonas hydrophila 而來的幾丁質酵 素 (Chitinase) 的 訊 號 序 列 ， 在 以 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)誘 導後，肌酸酵素會分泌到細胞間質。菌株保 存在–20°C 下的 50% (體積比)甘油中。 肌酸酵素之生產以 2.5-L 醱酵槽為之， 工作體積 1.5 L。醱酵條件如下：5%接種量、 溫度 37°C、pH 7.0、攪拌軸轉速 400 rpm、通 氣量 1 vvm。pH 值控制以 2N HCl 和 2N NaOH 為之。醱酵液組成為(每升含)：10 g 蛋白胴 (Tryptone)、5 g 酵母萃出液(Yeast Extract)、 10 g NaCl 和 50 mg 安比西林(Ampicillin)。在 接種後 2 h 添加 IPTG，最終濃度 0.5 mM，以 誘導肌酸酵素之合成。醱酵完成後，將醱酵 液在 8000 × g 和 4°C 下離心 10 min 以收集細 胞。收集到的細胞再以 RO 水清洗 2 次，即 可進行間質蛋白釋放之實驗。在以下操作 中，各取固定細胞濃度的樣品 5 mL 進行實 驗。 標準滲透壓衝擊之操作步驟如下(Nossal and Heppel, 1966)：(1) 將細胞懸浮在 5 mL 的衝擊溶液(Shock Medium)中，其組成為 20%蔗糖、33 mM Tris-HCl (pH 8.0)和 0.5 mM EDTA；(2) 在室溫下震盪 10 min；(3) 在 8000 × g 和 4°C 下，離心 10 min 收集菌體；(4) 將 細胞再次懸浮於 4°C 的 RO 水中，並於 4°C 下震盪 10 min；(5) 在 8000 × g 和 4°C 下離 心 10 min，收集上清液分析。本計畫所提改 良式滲透壓衝擊是在標準滲透壓衝擊之操作 前，先以二價金屬離子處理細胞，期能達到 促進間質蛋白釋放之效果。 細胞濃度以分光光度計測之—測樣品在 600 nm 下之吸光值，再以細胞乾重校正之。 蛋白質濃度的測量以 Bradford 方法為之，以 牛的血清蛋白(Bovine Serum Albumin)為標 準 。 肌 酸 酵 素 分 析 所 根 據 的 反 應 如 下 (Koyama et al., 1990)： Creatine + H2O⎯
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creatinase sarcosine + urea 肌 酸 酵 素 可 將 肌 酸 分 解 成 甲 基 甘 膠 酸 (Sarcosine)和尿素。一個單位的肌酸酵素定義 為在 37°C 和 pH 7.7 下，每分鐘釋放出 1 µmol 的尿素所需的酵素量。 肌酸酵素分析的步驟如下：(1)取 0.1 mL 酵素液、0.1 mL 的 0.3 M 磷酸緩衝溶液(pH 7.7)，以及 0.8 mL 的 0.1 M 肌酸溶液作為實 驗組。對照組為 0.1 mL 的 RO 水、0.1 mL 的 0.3 M 磷酸緩衝溶液(pH 7.7)，以及 0.8 mL 的 0.1 M 肌酸溶液。(2)於 37°C 水浴中進行酵素 反應 10 min。(3)加入 1 mL 呈色劑，進行呈 色反應 20 min。呈色劑之組成為：1 g 的 4-(N,N-dimethylamino)-benzaldehyde、20 mL 的 95%乙醇和 2 mL 的硫酸。(4)以分光光度 計測 440 nm 下之吸光值，將實驗組減去對照 組的吸光值，代入檢量線即可得尿素的含量。結果與討論
實驗發現，以超音波打破細胞可得肌酸 酵素產率 2150 U/g cell，和 4.1 U/mg protein 的比活性。採用標準滲透壓衝擊，可得肌酸 酵素產率 1300 U/g cell，和 16.1 U/mg protein 的比活性。以超音波破菌的結果為基準，標 準滲透壓衝擊可得 60%的酵素回收率，和 3.9 倍的純化。 在以陽離子前處理的操作中所要考慮的 因素為離子濃度和作用時間，除此之外，後 續滲透壓衝擊的操作條件也可能需要改變。 我們發現，5 分鐘的作用時間即已足夠。至 於滲透壓衝擊的條件，則只有 EDTA 的濃度 可能需要調整。陽離子和 EDTA 的最佳濃度可以經由分 析肌酸酵素的回收率和純度而決定之。圖 1 所示為前處理中，Ca2+濃度在不同 EDTA 濃 度下對肌酸酵素產率之效應。在標準滲透壓 衝擊的操作中(0 mM Ca2+ )，肌酸酵素產率在 0.5 mM EDTA 下 達 到 最 大 值 (1300 U/g cell)。若無 EDTA 的作用，間質釋放就不明 顯。在 EDTA 的存在下，酵素的回收隨著 Ca2+ 濃度的增加而增加；而且不管 EDTA 的濃度 為何，在 5 mM Ca2+時都可達到最大值。酵 素回收隨著 EDTA 濃度的增加而增加，在 5 mM EDTA 時，可得最大產率 1610 U/g cell。 如前所述，EDTA 處理是要藉著與 Ca2+螯合 而使 LPS 剝離。因此，EDTA 的需求量從 0.5 mM (標準滲透壓衝擊)增加到 5 mM (本改良 式操作)，是因為與 LPS 結合的 Ca2+增加了。 圖 1、前處理中，Ca2+濃度對肌酸酵素產率之影響。 所使用 EDTA 之濃度：({) 0, (z) 0.5 mM, (T) 1 mM, (¡) 5 mM, () 10 mM. 值得強調的是，肌酸酵素回收的程度是 對應於 LPS 的釋放量，而 LPS 的釋放是由於 EDTA 對 LPS-Ca 錯合物的作用。圖 1 因此說 明了 LPS 的釋放隨著 Ca2+和 EDTA 濃度的增 加而增加，而且在 5 mM Ca2+和 5 mM EDTA 時達到最大值。 表 1 所示為 Ca2+和 EDTA 濃度對肌酸酵 素回收的純度之影響。肌酸酵素比活性隨著 Ca2+和 EDTA 濃度之增加而增加；當使用 5 mM Ca2+和 5 mM EDTA 時，可得最大值為 18.3 U/mg protein。過量的 EDTA 會導致不利 的結果，此現象可歸因於細胞膜蛋白質之剝 離。利用簡單的 Ca-前處理(5 mM，5 min)， 可以同時提高間質肌酸酵素的回收率(60 到 75%)，和純化倍數(3.9 到 4.5 倍)。 表 1、Ca2+和 EDTA 濃度對回收肌酸酵素純度之效應 除了 Ca2+之外，Mg2+也可以和 LPS 結 合，因而穩定了細胞外膜。因此，以 Mg2+對 細胞作前處理，也預期具有類似之效果。實 驗發現，以 3 mM Mg2+作前處理，滲透壓衝 擊使用 7 mM EDTA，可得 69%的肌酸酵素回 收率(1490 U/g cell)，和 4.2 倍的純化倍數。 Mg-前處理所需 EDTA 之量高於 Ca-前處理者 (5 mM EDTA，當使用 5 mM Ca2+時)，可能與 陽離子對 EDTA 的親合性有關(Mg2+為 8.7， Ca2+為 10.7) (Boggis et al., 1979)。 將滲透壓衝擊應用於放大規模的操作 中，主要的考量是較高的細胞濃度。我們的 考量是使用相同的高張溶液(20%蔗糖和 33 mM Tris-HCl)，細胞濃度可以高到多少？讓 Ca2+和 EDTA 的濃度隨細胞濃度成比例的增 加，圖 2 顯示，肌酸酵素的回收率可以維持 至 12 g/L 的細胞濃度。 圖 2、高細胞濃度下，標準和改良式滲透壓衝擊之應 用性。符號：({)標準滲透壓衝擊，(z)改良式滲透壓 衝擊。
結論
滲透壓衝擊是從大腸桿菌的細胞間質， 回收重組蛋白常用的方法。這方法的基本原 理是增加細胞外膜的通透性，而此通透性之 增加可藉由 EDTA 處理以放出 LPS 而達成。 本計畫改良了滲透壓衝擊之操作，其方法是 先以 5 mM 鈣離子處理細胞 5 min，再配合以 增加的 EDTA 濃度(從 0.5 到 5 mM)。以重組 肌酸酵素的間質釋放為例，酵素回收率和純 化倍數可以同時具有明顯的改善。參考文獻
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相關著作
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