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行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
□成果報告 ■期中進度報告幾丁聚醣經射頻電漿表面改質之體外以及體內試驗
計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫
計畫編號：NSC 98－2314－B－006－011－MY2
執行期間：98 年 08 月 01 日至 100 年 07 月 31 日
計畫主持人：楊俊佑
共同主持人：
計畫參與人員：吳侑峻
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
■赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計
畫、列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢
□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查
詢
執行單位：成大醫學院骨科
中 華 民 國 98 年 05 月 31 日
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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告 幾丁聚醣經射頻電漿表面改質之體外以及體內試驗
The in vitro and in vivo study of surface modified chitosan via RF plasma
計畫編號：NSC 98-2314-B-006-011-MY2 執行期限：98 年 8 月 1 日至 100 年 7 月 31 日 主持人：楊俊佑 計畫參與人員：吳侑峻
1. 前言
由於幾丁聚醣的生物相容性、生 物降解性、低毒性、帶正電能夠與帶 負電的表面結合，例如黏膜(mucous membrane)，其有助於藥物在上皮表面 的運輸，或者當作基因傳輸載體等特 性，使的幾丁聚醣成為極佳的生物材 料應用於醫學領域上。而在我們的最 近研究指出[1]，利用 PLGA 當支架， 使用幾丁聚醣進行表面修飾時，不管 是在薄膜形式或者支架結構下，骨母 細胞的黏著（attachment）效率皆不佳， 但確有幫助骨母細胞分泌鹼性磷酸脢 的效果。另外在實驗室本身對其他細 胞進行黏著測試上，亦發現纖維母細 胞（3T3 cell）以及脂肪細胞對於幾丁 聚醣的黏著效果亦是不佳。因此，幾 丁聚醣似乎在組織工程上的初步應用 上對於細胞黏著仍有許多改善空間。 一般而言，提高材料表面位能也就是 提高表面親水性常可提升細胞的黏附 效果。因此，若將材料表面經過些微 處理，便可改變其表面特性，提升生 物相容性與其他的附加機能。因此， 近幾年有許多文獻利用低溫電漿處理 高分子表面，並評估其生物相容性表 現，Wan 等人利用氧氣電漿進行 PLGA 薄膜表面修飾，發現的確有幫 助細胞黏著的提升[2]， 2006 年則是 使用氨氣電漿處理 PLA 支架，發現可 幫助纖維細胞更深入支架內部生長 [3]。Zhu 團隊則是利用氬氣電漿處理 幾丁聚醣薄膜，則是發現可增進人類 皮膚細胞的黏著及增生[4]。Alve 團隊 則是利用澱粉為基材製備的薄膜進行 電漿處理，並探討蛋白質吸附的影 響，結果發現電漿處理的確會影響到 蛋白質的吸附，並影響到細胞的黏附。 在骨組織工程中，骨移植的取代 物需要考量的除了生物相容性、可降 解性、降解後是否產生有毒物質以 外，還要考量到機械性質的問題，因 此在本篇研究中將延續先前所提過的 珊瑚支架來做為表面處理的基材，除 了以上優點以外，他的成分為鈣磷化 合物，與骨頭的成分相近，相當適合 用來做為骨組織工程中支架的選擇。目的
因此本計畫第一年為探討 2D 平 面下，利用電漿處理後的幾丁聚醣薄 膜對於骨母細胞的行為影響。我們將 進行骨母細胞的培養，測試其在於電 漿處理後的幾丁聚醣薄膜其黏著、生 長、分化的狀況。另一方面我們亦進 行且 3D 結構支架製備，其方法為之前 我們研究的主題珊瑚與幾丁聚醣支架 製備，並評估電漿表面修飾在 3D 支架 上其生物反應。第二年為動物體內試3 驗，用以評估電漿表面處理對於骨組 織工程上的臨床應用性。
2. 方法
幾丁聚醣溶液製備 將 2 克的幾丁聚醣粉末溶於 100ml 的(1%)冰醋酸(g/cc)，在室溫下以電磁 攪拌器攪拌一整夜至均勻，得 2％ chitosan 醋酸溶液 100 ml。最後，將 chitosan 溶液置於一瓶內，以 121℃、 1.2kg/cm2 高溫高壓滅菌(約 15~20min) 後，封好並妥善保存，以供實驗需要 時用。 幾丁聚醣/珊瑚支架之製備 (見圖一) 珊瑚支架切割後經由 121o C 溼式滅菌 法後，放至 50o C 烘箱乾燥。接著將滅 過菌的珊瑚浸泡到幾丁聚醣溶液中利 用二次離心的方式將幾丁聚醣均勻的 分布在珊瑚支架的表面，離心的轉速 為 1000rpm，時間是五分鐘。藉由在表 面塗佈幾丁聚醣的珊瑚在 50o C 中烘乾 一天，接著浸泡 1N 的 NaOH 來中和幾 丁聚醣的酸性性質。以上的製程過程 皆是無菌操作，而且浸泡 NaOH 也是 滅菌的方式之一，確保試片的無菌度。 幾丁聚醣珊瑚支架表面評估測試 利用螢光染色(wheat germ agglutin, 10 ug/ml)來標定幾丁聚醣，進而評估幾丁 聚醣是否均勻的分布在珊瑚支架上 面。 電漿表面修飾處理幾丁聚醣/珊瑚支架 將支架移入 chamber 後蓋緊，進行抽 真空處理，直到真空度達 50mtorr，通 入氬氣，使真空度提高 300mtorr。通 氬氣的速率為 20 sccm(standard cubiccentimeters per minute)，打開高壓按 鍵，調整功率為 40W，此時可看見紅 色可見光，代表正進行電漿處理。處 理時間分別為:2-3 分鐘。 細胞培養 經過電漿處理後放置一小時，幾丁聚 醣/珊瑚支架，進行 human fetal osteoblast (hFOB)並進行培養，經過 1, 3, 5, 10 天的培養後進行電子顯微鏡的 觀察、細胞增生測試(Alamarblue test) 以及細胞分化測試(Alkaline phosphatase test)。
3. 結果與討論
由圖二可以明顯看出利用二次離 心的方式將幾丁聚醣均勻的分布在珊 瑚的表層及內部。為了確認幾丁聚醣 是否均勻分布，利用螢光染色的方式 從實驗組及對照組發現沒有幾丁聚醣 的珊瑚表面並沒有螢光的表現。另外 為了確認是否有將幾丁聚醣均勻分布 於珊瑚的內部，利用對切的方式將珊 瑚對半切開發現內部仍然有螢光的反 應，此結果顯示幾丁聚醣的確均勻的 分布在珊瑚的內外部。 將有無幾丁聚醣的珊瑚支架經由 SEM 的觀察(見圖三)可以發現原本珊 瑚的表面具有柱狀的凸起結構，表面 披附上幾丁聚醣薄層後，表面變的平 滑，幾丁聚醣的厚度大約是 2mm。 再藉由電漿處理過後的幾丁聚醣 會變得更加的平滑及親水，有利於細 胞的貼附，但是和未經電漿處理的幾 丁聚醣表面比起來，細胞在電漿處理 的形態比較圓，未經電漿處理的表面 呈現拉長，有觸手的細胞，形態也比 較偏向分化的外形(見圖四)。另外藉由4 定量的方式來計算細胞貼附的量也發 現經由電漿處理的表面細胞貼附的量 會比其他兩組來的高(見圖五)。文獻[5] 指出幾丁聚醣的確會降低細胞的貼 附，可能的原因是幾丁聚醣表面的化 學結構，較相似於透明質酸，可能會 阻礙不同的細胞型態與膠原蛋白的接 觸[6]。 在臨床移植物或是組織工程應用 上，細胞一開始貼附在基材表面是非 常重要的一個關鍵。因為吸引越多的 細胞貼附在生醫材料或是支架上面可 以有更多有功能性的細胞在受損的部 位開始產生修復的作用，而不用再體 外培養先種上大量的細胞。而改善材 料表面的特性，電漿處理的確是一個 有效的方法來改善細胞貼附的數量。 在細胞增殖的部分，從圖六可以 發現 hFOB 在珊瑚支架這個組別有明 顯的增生，在經由幾丁聚醣處理的表 面細胞在十天內並未有大量的增生， 再對照細胞分化的測試(見圖七)，可以 推論細胞未有大量的增生是因為在該 組別透過幾丁聚醣的影響使得細胞走 向分化的路徑。文獻指出幾丁聚醣會 影響細胞的貼附，而且細胞的形態會 影響到細胞的生長及分化，在幾丁聚 醣表面的細胞經由一些刺激會表現出 許多的細胞外基質。學者 Yamada 指出 幾丁聚醣會刺激細胞表現鹼性磷酸酶 是透過細胞早期的 IFN-gamma receptor 的路徑影響，而且也會表現 BMP2 蛋白質。雖然珊瑚支架的組別顯 是細胞增殖的量最多，但是文獻也指 出如果細胞走向增殖的路徑相對的會 關閉分化路徑。
4. 結論
在三個組別中，珊瑚支架的組別 顯示適合細胞貼附並增生；經由幾丁 聚醣處理表面的支架可以促使細胞走 向分化的路徑；而經由電漿處理的幾 丁聚醣/珊瑚支架，改善表面的細胞親 和性，可以增加表面的細胞貼附量， 接下來將利用所製備的理想參數的支 架在動物實驗中去評估運用於組織工 程的應用性。5. 自我評估
本篇為利用電漿來進行幾丁聚醣 的表面改質，並用來增進骨母的初期 貼附生物相容性，本次成果已發現電 漿處理所造成的表面修飾變化，並且 這樣的表面變化的確能有效增進骨細 細胞黏著貼附，這未來可應用於骨組 織工程支架的改質用途上。6. 參考文獻
1. Wu YC, Shaw SY, Lin HR, Lee TM, Yang CY. Bone tissue engineering evaluation based on rat calvaria stromal cells cultured on modified PLGA scaffolds. Biomaterials 2006 Feb;27(6):896-904.
2. Wan, Y., et al., Characterization of
surface property of poly(lactide-co-glycolide) after oxygen plasma treatment. Biomaterials, 2004. 25(19): p. 4777-83.
3. Wan, Y., et al., Influences of ammonia plasma treatment on modifying depth and degradation of
poly(L-lactide) scaffolds. Biomaterials, 2006. 27(13): p.
5 2699-704.
4. Zhu, X., et al., Effect of argon-plasma treatment on proliferation of human-skin-derived fibroblast on chitosan membrane in vitro. J Biomed Mater Res A, 2005. 73(3): p. 264-74.
5. Knox P, Wells P. Cell adhesion and proteoglycans. I. The effect of exogenous proteoglycans on the attachment of chick embryo fibroblasts to tissue culture plastic andcollagen. J Cell Sci.40:77-88. 1979.
6. Hutmacher DW. Scaffold design and fabrication technologies for engineering tissues--state of the art and future perspectives. Journal of biomaterials science.12:107-24.2001. 附錄 圖一、實驗支架製備流程 圖二、利用螢光顯微鏡觀察幾丁聚醣在珊瑚支 架上的分布 圖三、利用電子顯微鏡觀察幾丁聚醣在珊 瑚表面的形態 圖四、細胞在幾丁聚醣支架及電漿處理後 表面的形態
6 圖五、細胞貼附在不同基材上的貼附量
圖六、不同支架上細胞的增殖量
圖七、不同支架上細胞分化的鹼性磷酸 酶 表現量
