巨噬细胞引导造血干祖细胞 向血管微环境归巢

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􀅰研究进展􀅰

VCAMＧ１ ^＋ 巨噬细胞引导造血干祖细胞 向血管微环境归巢

李丹彤

　　薛文志

　　李　美

　　李　林

　　潘巍峻

(１．中国科学院上海营养与健康研究所,上海 ２０００３１;２．上海交通大学医学院,上海 ２０００２５)

　　 收稿日期:２０１８Ｇ１２Ｇ１７;修回日期:２０１９Ｇ０１Ｇ０７ 　　∗ 通信作者,Email:weijunpan＠sibs．ac．cn

[摘　要]　造血干祖细胞可以通过增殖分化产生红细胞、白细胞、血小板等人体内所有类型的血液 细胞,维持脊椎动物的终生造血.在发育过程中,造血干祖细胞诞生于动脉—性腺—中肾(AGM) 区域后,后通过归巢锚定在特定的微环境中进行自我更新或向下游各血系分化.复杂的血管结构 以及其他基质成份,如基质细胞等,构成了独特的造血微环境,调控造血过程的进行.然而,由于造 血过程时空跨度非常大,观察手段十分有限,目前对造血微环境的精细结构以及调控造血干祖细胞 归巢的分子细胞机制仍然知之甚少.为攻克这一难题,本团队在优化活体成像技术的基础上,进一 步整合活体免疫荧光标记、遗传调控和图像重构计算等方法,对斑马鱼尾部造血组织(相当于哺乳 动物胎肝)中的造血干祖细胞的归巢过程进行了解析,揭示了独特的微血管结构对造血干祖细胞停 留的调控作用.在研究中,本团队还意外地发现了一种全新的微环境细胞,并将其命名为“先导细 胞”.这类细胞是先前未被定义过的巨噬细胞新亚型,存在于归巢“热点区域”中,表现出“巡逻行 为”,可以识别进入造血组织的造血干细胞并将其引入特定的血管结构中,从而实现造血干细胞的 归巢.此项研究为造血干细胞移植相关的转化研究开辟了新的方向.

[关键词]　斑马鱼;活体成像;造血干祖细胞归巢;静脉微血管;VCAMＧ１^＋巨噬细胞

１　研究背景

正常成人体内每升血液中有１０^１２数量级的红细 胞为人体运输营养物质和氧气,１０^９白细胞发挥免疫 功能,１０^９血小 板 参 与 止 血 凝 血.同时,人体内血液 的新陈代谢相当 旺 盛,正常成熟的红细胞平均寿命 为１２０天、白 细 胞 约 ７—１４ 天、血 小 板 约 ７—９ 天.

通过单细胞骨髓移植实验证实数量如此庞大的血细 胞 均 来 源 于 造 血 干 祖 细 胞(HaematopoieticStem andProgenitorCell,HSPC)^[１].哺 乳 动 物 发 育 过 程中,HSPC产生于动脉—性腺—中肾区域(AortaＧ GonadＧMesonephros,AGM)的动脉血管,先后定植 于胎肝(进 行 快 速 增 殖)和 骨 髓 (维 持 成 体 终 生 造 血)^[２].造血干祖细胞通过血液循环最终定植于造 血微环境并发挥正常功能的过程被称为归巢.生命 的维持高度依 赖 来 源 于HSPC 的血细胞,而 HSPC

正常 发 挥 功 能 是 以 其 成 功 归 巢 为 前 提 的,因 此, HSPC归巢的意义和重要性就不言而喻了.

造血干祖细胞 存 在 于 造 血 组 织 中,具有自我更 新和向下游各 系 血 细 胞 分 化 的 潜 能^[３].早在 ２０世 纪５０年代,科学家就开展了同种异体的造血干祖细 胞移植.随着移植技术日趋成熟,造血干祖细胞现 已被广泛地应用于血液、免疫、肿瘤等重大疾病的治 疗^[４].１９７１年,TrentinJ．J．研究并证明了造血干细 胞所处的微环境对其细胞行为和命运决定具有重要 影响^[５],只有归巢至适宜的造血微环境,造血干祖细 胞才能进一步的增殖、分化,进而重建造血和免疫功 能.简而言之,造血干祖细胞的归巢能力直接影响 决定了移植效率^[６].

由于造血 干 祖 细 胞 归 巢 过 程 的 时 空 跨 度 非 常 大,观察手段十分有限,尽管科研人员在过去几十年 的研究中,对归巢过程的细胞和分子基础进行了一

第１期 李丹彤等:VCAMＧ１^＋巨噬细胞引导造血干祖细胞向血管微环境归巢 　　　 　４１

定的解析^[７１０],但对于在体内生理情况下归巢究竟

如何发生、归巢的微环境究竟是何种结构、微环境细 胞又是如何帮助造血干细胞归巢等一系列关键科学 原理依然知之甚 少,这种情况严重制约了临床造血 干细胞移植等相 关 技 术 的 发 展,使得造血干祖细胞 归巢机制的活体解析迫在眉睫.

２　研究进展及成果

为了活体解析 造 血 干 祖 细 胞 的 归 巢 机 制,本研 究团队首先建立了长时程特异性标记造血干祖细胞 的活体成像系统(图１).目前科学界普遍认为斑马 鱼中造血干祖细 胞 诞 生 于AGM 区动脉腹侧壁^[１１], 于是我们对转基因鱼系 Tg(kdrl:Dendra２)胚胎的 AGM 区进行光转换,使该区域新生的造 血 干 祖 细 胞被标记为红色.当红色的造血干祖细胞迁移到尾 部造血组织中时,我们就可以轻松地在绿色荧光标 记的血管丛中,实时追踪红色荧光标记的造血干祖 细胞的迁移行为和停留时间.

与此同时,我们通过大规模前向遗传学筛选获 得了存在归巢缺陷的itga４遗传突变体(图２a).通 过比较野生型与itga４突变体,我们定义造血干祖细 胞成功归巢需要 在 尾 部 造 血 组 织 停 留 超 过３０分钟 (图２b).通过分析造血干祖细胞停留的空间分布, 我们注意到斑马鱼胚胎中存在造血干祖细胞归巢停 留的“热点”区域,该区域位于背侧、节间血管与尾部 静脉丛交汇处附近(图２c).我们进一步对“热点”区 域进行精细的活 体 成 像,并对造血干祖细胞停留处 的血管结构进行 三 维 重 构,发现尾部静脉丛背侧与 节间血管交汇处,分支出一条独立的、较细的血管, 紧紧包绕着造血干祖细胞,我们将其命名为“静脉微 血管”(venouscapillary).静脉微血管内腔较小并 与较粗主血管之 间 呈 一 定 角 度,在普通的显微成像 中非常容易被忽 略,技术上的突破使我们得以首次

发现并报道造血干祖细胞停留在特殊的静脉微血管 结构中(图２d).

ITGA４的配体 VCAMＧ１在哺乳动物的造血干 祖细胞停 留 过 程 中 至 关 重 要^[１２].我们发现 斑 马 鱼 胚胎 中 的vcamＧ１ 特 异 性 表 达 在 尾 部 造 血 组 织,同 时,vcamＧ１突变体胚胎具有与itga４突变体相似的 造血 缺 陷 表 型,这说明ITGA４ＧVCAMＧ１ 信号通路 在斑马 鱼 中 功 能 保 守. 我 们 通 过 抗 体 染 色 发 现 VCAMＧ１ 蛋白弱表达在尾部造血 组 织 部 分 静 脉 内 皮细胞上,这与以往报道一致.出乎意料的是,内源 的VCAMＧ１ 被发现强表达于某些紧邻着造血干祖 细胞的细胞上(图３a)而这些 VCAMＧ１^＋非内皮细胞 正是巨噬细 胞 的 一 个 新 亚 群(图 ３b).通过复杂的 遗 传 操 作,我 们 还 构 建 了 只 有 内 皮 细 胞 表 达 VCAMＧ１ 或只有巨噬细胞表达 VCAMＧ１ 的两种情 形(图３c—f).进一步的研究发现内皮细胞和巨噬 细胞上的VCAMＧ１ 具有各自不同的功能:内皮细胞 上表达的VCAMＧ１分子帮助造血干祖细胞在尾部 静脉丛背侧的血 管 内 皮 床 滚 动,有效减慢细胞流动 速度,但不足以使造血干祖细胞停留(图３c,d);而 巨噬细胞上表 达 的 VCAMＧ１ 能帮助造血干祖细胞 发生停留,且必不可少(图３e,f).两者相互配合, 协同促进造血干祖细胞的停留过程.

为在活体上直接观察VCAMＧ１^＋巨噬细胞帮助 造血干祖细胞归 巢 的 全 过 程,我们借助抗体和活体 实时 高 分 辨 率 成 像 技 术,对 VCAMＧ１^＋巨 噬 细 胞 进 行追踪并观察到VCAMＧ１^＋巨噬细胞会在尾部静脉 丛背侧血管内侧 小 范 围 内 缓 慢 地 移 动,我们称之为

“巡逻”(patrol)(图４).当造血干祖细胞从节间血 管或尾部静脉丛 进 入 尾 部 造 血 组 织 时,总是会经过 节间血管与尾部 静 脉 丛 背 侧 血 管 交 汇 处,在这里有 机会遇到“巡逻”的 VCAMＧ１^＋细胞并与其发生相互 作用.

图 １　特异性标记造血干祖细胞的活体成像系统 (比例尺: ５０微米)

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图 ２　造血干祖细胞归巢停留的时空规律

a．野生型中造血干祖细胞能够成功定植在尾部造血组织(白色箭头所示),而itga４ 突变体中造血干祖细胞则是快速流 动 ,成像呈红线(黄色箭头所示).b．将野生型和两种itga４ 突变体胚胎,３个一组,将造血干细胞逗留时间分成４类,统计每 类逗留时间对应的造血干祖细胞数量相对总数所占百分比 .c．野生型转基因鱼系 Tg(kdrl:Dendra２)胚胎进行光转换后, 对整个尾部造血组织进行成像 ,计算造血干祖细胞在每个点出现的频率,出现造血干祖细胞停留的热点区域.d．对停留热 点区域进行高分辨率成像并进行三维重构 ,观察围绕在造血干祖细胞周围的血管与造血干祖细胞之间的位置关系.(比例 尺显: ５０微米)

图 ３　巨噬细胞和内皮细胞表达的 VCAMＧ１ 在造血干祖细胞停留过程中发挥不同的作用

a．绝大多数(８６％)VCAMＧ１

细胞与造血干祖细胞之间相隔小于 ７μm(造血干祖细胞平均直径大约 ６．９μm).b．尾部

造血组织的 VCAMＧ１

细胞 (品红色,白色箭头所指)也是 mpeg１:eGFP 阳性细胞(绿色,白色箭头指示双阳性细胞),即巨噬

细 胞 .c．d．只有内皮细胞表达 VCAMＧ１时,造血干祖细胞在血管内皮床滚动,停留时间延长,但停留超过３０分钟所占比例

仍明显下降 .e．f．只有巨噬细胞表达 VCAMＧ１时,造血干祖细胞在尾部造血组织可以发生停留.比例尺显示５０μm(b),

２０μm(c,e)和１０μm(a)

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图 ４　VCAMＧ１

巨噬细胞在尾部造血组织进行小范围巡逻 十字所在处为起始时间点 VCAMＧ１

巨噬细胞所在位置.(比例尺: ２０μm)

图 ５　活体成像分析 VCAMＧ１＋先导细胞引导造血干祖细胞停留的过程

细胞与造血干祖 细 胞 相 互 作 用 及 其 后 续 事 件,发现 他们平均相互作用时间在３０分钟左右.其中,大约 ６０％造血 干 祖 细 胞 没 有 发 生 停 留 (逗 留 ６—３０ 分 钟),而通过静脉丛离开尾部造血组织,其余约 ４０％

造血干祖细胞发 生 停 留,即在尾部造血组织停留超 过３０min.在发生停留的造血干祖细胞中(图 ５), 大约７５％ 的细胞会与 VCAMＧ１^＋巨 噬 细 胞 在 静 脉 微血管的开口处相遇.在 VCAMＧ１^＋巨噬 细 胞 的 指 引下,其中２０％ 的造血干祖细胞最终能够进入静脉 微血管并且停留超过１２０min,这被称为“I型停留”

(TypeI);其余约 ２５％发生停留的造血干祖细胞与 VCAMＧ１^＋巨 噬 细 胞 在 尾 部 静 脉 丛 中 相 遇,其 中 ６􀆰２５％ 的细胞会被内皮细胞形成的口袋结构包裹,

发生“II型停留”(TypeII);其他停留方式统称为“０ 型停留”(Type０):即与 VCAMＧ１^＋巨噬细胞相互作 用,逗留时间超过了 ３０min,但是细胞间相互作用没 有成功将造血干祖细胞引入到血管微环境中.一般 来说,“０型停留”不会持续超过１２０min.由于itga４

突变体中缺少ITGA４ＧVCAM１相互识别与作用,因 此造血干祖细胞呈现快速流动,一穿而过的表型.

本研究生动地展示了体内造血干细胞归巢停留 的动态过程,极大地丰富了对造血干细胞归巢机制 的科学 认 识.研 究 中 发 现 的 微 环 境 结 构 及 细 胞 亚 群,对干细胞领域相关的基础研究和临床应用都具 有重要的理论指导意义.

３　结论与展望

本研究展示了初生造血干细胞在体归巢的动态 过程,不仅回答了“体内生理环境下的造血干细胞归 巢如何发生”这一造血领域的重大科学问题,而且发 现了对于造血 干 细 胞 归 巢 起 关 键 引 导 作 用 的“先导 细胞”.值得注意的是,该研究改变了以往对ITGAＧ VCAMＧ１作用机制的认识,发现 VCAMＧ１^＋巨 噬 细 胞亚群对HSPC归巢停留至关重要.

«自然»高级编辑 NatalieLeBot认为,该研究在 世界上首次解析了造血干细胞归巢的时空动态全过 程,并初步解析了干细胞巢的分子细胞基础.华山

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医院血液科陈彤教授表示期待该成果能尽快应用于 临床,“先导细胞可以为造血干细胞归巢打开方便之 门,这预示今后可能在临床上大大提高造血干细胞 移植的成功率.”

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VCAMＧ１

macrophagesguidethehomingofHSPCstoavascularniche

(１．ShanghaiInstituteofNutritionand Health,ChineseAcademyofSciences,Shanghai２０００３１;

２．ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolof Medicine^,Shanghai２０００２５)

Abstract　Haematopoieticstemandprogenitorcells(HSPCs)giverisetoallbloodlineagesthatsupport theentirelifespanofvertebrates．AfterHSPCsemergefromendothelialcellswithinthedevelopingdorsal aorta,homingallowsthenascentcellstoanchorintheirnichesforfurtherexpansionanddifferentiation．

Uniquenichemicroenvironments,composedofvariousbloodvesselsasunitsofmicrocirculationandother nichecomponentssuchasstromalcells,regulatethisprocess．However,thedetailedarchitectureofthe microenvironmentandthe mechanismfortheregulationof HSPChomingremainunclear．Here,using advancedliveimagingandcellＧlabelingsystem,weperformhighＧresolutionanalysesoftheHSPChomingin caudalhaematopoietictissueofzebrafish(equivalenttothefetalliverinmammals),andrevealtheroleof thevasculararchitectureintheregulationofHSPCretention．WeidentifyaVCAMＧ１^＋ macrophageＧlike nichecellpopulationthatpatrolstheinnersurfaceofthevenousplexus,interacts with HSPCsinan ITGA４Ｇdependentmanner,anddirects HSPCretention．Thesecells,named＇ushercells＇,togetherwith caudalvenouscapillariesandplexus,defineretentionhotspotswithinthehomingmicroenvironment．Thus, thestudyprovidesinsightsintothemechanismofHSPChomingandrevealstheessentialroleofaVCAMＧ １^＋ macrophagepopulationwithpatrollingbehaviorinHSPCretention．

Keywords　Zebrafish;liveＧimaging;homingofhematopoieticstem/progenitorcells;venouscapillary;

VCAMＧ１^＋ macrophages