高一生物增廣班 李江德老師教學資料
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細菌的簡單染色和 細菌的簡單染色和 細菌的簡單染色和
細菌的簡單染色和革蘭氏 革蘭氏 革蘭氏 革蘭氏染色 染色 染色 染色
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（一 一 一 一） ） ） ） 實驗目的 實驗目的 實驗目的： 實驗目的 ： ： ：
學習細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法。
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（二 二 二 二） ） ） ） 實驗原理 實驗原理 實驗原理： 實驗原理 ： ： ：
用於生物染色的染料主要有鹼性染料、酸性染料和中性染料三大類。
鹼性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等 電點較低，當它生長於中性、鹼性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所 以通常採用鹼性染料（如美藍、結晶紫、鹼性複紅或孔雀綠等）使其著 色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解 糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、
酸性複紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱複 合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。
簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不 能辨別細菌細胞的構造。革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家
C.Gram所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌
（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色 法。該染色法所以能將細菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細胞壁 結構和成分的不同所決定的。G—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解 的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解 了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的複合物易於 滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅複染後就成紅色。G+菌細胞壁中肽 聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理後反而使肽聚糖層 的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。
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（三 三 三 三） ） ） ）實驗器材 實驗器材 實驗器材： 實驗器材 ： ： ：
1、市售養樂多和優酪乳。
2、染色液和試劑：結晶紫、碘液、95%酒精、蕃紅、二甲苯、油鏡油。
3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。
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（四 四 四 四） ） ） ）實驗方法 實驗方法 實驗方法： 實驗方法 ： ： ：
1、簡單染色：
（1）塗片：取乾淨載玻片一塊，將細菌製成薄塗面，注意取菌不要太多。
（2）晾乾：讓塗片自然晾乾或者在酒精燈火焰上方溫火烘乾。
（3）固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙 手為宜）。
（4） 染色：將固定過的塗片加結晶紫染色1-2min。
（5）水洗：用水洗去塗片上的染色液。
（6）乾燥：將洗過的塗片放在空氣中晾乾或用吸水紙吸乾。
（7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，並找出適當的視野後，將高倍鏡 轉出，在塗片上加油鏡油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察 細菌的形態。
2、革蘭氏染色：
（1）塗片：塗片方法與簡單染色塗片相同。
（2）晾乾：與簡單染色法相同。
（3）固定，與簡單染色法相同。
（4）結晶紫色染色：將玻片加適量（以蓋滿細菌塗面）的結晶紫染色液 染色1分鐘。
（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。
（6）媒染：滴加碘液，媒染1min。
（7）水洗：用水洗去碘液。
（8） 脫色：將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無 色，立即水洗。
（9）複染：滴加蕃紅複染5min。
（10）水洗：用水洗去塗片上的蕃紅染色液。
（11）晾乾：將染好的塗片放空氣中晾乾或者用吸水紙吸乾。
（12）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最後用油鏡觀察，並判斷菌 體的革蘭氏染色反應性。
（13）實驗完畢後的處理：
◎將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭乾淨。
a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。
b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。
c.再用乾淨的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。
◎看後的染色玻片用廢紙將油鏡油擦乾淨。
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（五 五 五 五） ） ） ）注意事項 注意事項 注意事項： 注意事項 ： ： ：
1. 革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被 脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏 陽性菌。脫色時間的長短還受塗片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，
難以嚴格規定。
2. 染色過程中勿使染色液乾涸。用水沖洗後，應吸去玻片上的殘水，以免 染色液被稀釋而影響染色效果。
3. 選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h，E.coli培養24h。若菌齡太老，由 於菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。
