以親和性吸附劑為主之材料進行對酵素之吸附探討 The investigation of affinity adsor bent-based mater ial for
the adsor ption of enzyme
計畫編號：NSC 90-2214-E-006-026 執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 7 月 31 日 主持人：許梅娟教授 國立成功大學化學工程學系
中文摘要
本研究是以幾丁聚醣 (chitosan) 為吸附劑之 單體基材，將之應用於親和性吸附，並以吸附 澱粉水解酵素之結果來探討吸附劑製備過程 中可能影響吸附效果之變因與改進方法。研究 結果顯示以戊二醛為交聯劑搭配 IDA 配位 基，並螯合銅離子製備之吸附劑有最佳的吸附 效 果 ， 可 達 96 % 。 但 在 脫 附 階 段 以 咪 唑 (imidazole) 為脫附劑則是以 CNBr 活化法製備 的 chitosan-IDA-Cu2+可脫附出高達 98 %活性 之 á-amylase。
關鍵詞：幾丁聚醣、親和性吸附、CNBr 活化 法、咪唑、戊二醛、IDA、澱粉水解 酵素、chitosan-IDA-Cu2+
Abstr act
This research is aimed at the use of chitosan as the supporting material of various adsorbents.
Chitosan is mainly applied to the immobilized metal affinity adsorption in this work. Best adsorption for α-amylase can only be found for cross-linked chitosan with Cu2+-chelated IDA ligand. Imidazole is determined to be a good and effective desorbent to desorb 98 % of α-amylase from CNBr activated chitosan-IDA-Cu2+ during the desorption stage.
Keywor ds: Chitosan, affinity adsorption, CNBr activated, imidazole, glutaraldehyde, IDA, á-amylase, chitosan-IDA-Cu2+
1. 緣由與目的
幾丁聚醣具有以下之特性：
1) 幾丁聚醣的螫合作用很強，
2) 對許多生物分子具有高度的親和性，
3) 含有大量的胺基和氫氧基。
除此之外，幾丁聚醣在物化性方面都與另 一種天然高分子纖維素有許多相似處，而纖維 素已經被廣泛地應用在各種層析過程。幾丁聚 醣重要的特性之一就是螯合作用 (chelation) 和 高負載能力 (loading capacity) [1]。幾丁聚醣的 這項特性主要由下列幾個因素所造成：
1) 含有許多氫氧基顯出高親水性，
2) 有許多高活性的主要胺基可以作為吸附位置，
3) 高分子鏈有可扭曲的結構並在和金屬離子 錯合時可以彎曲成適當的構形。
基 於 其 特 性 ， 因 此 於 本 研 究 中 即 針 對 á-amylase 之親和性 吸附 進行探討，乃是以 chitosan 為基材，並結合 IDA 為 ligand，錯合 銅離子後進行此親和性吸附劑對 á-amylase 之 吸、脫附研究，以作為生產 á-amylase 製程中 分離純化之基礎。
2. 實驗方法
2.1 澱粉水解酵素之活性測定方法
方法：利用碘溶液反應過程中藍顏色之減 低程度來決定 amylase 之活性。
1) 基質：以 pH=7.0 緩衝液配製 1 % 澱粉溶液 作為基質。
2) 呈色劑：以去離子水配製 I2/KI 溶液後，取 0.05 mL 碘溶液加入 4.95 mL 去離子水製成 5 mL 呈色劑。
3) 酵素反應：取 5 mL 澱粉溶液於試管中，置 入 37 恆 溫 振 盪 水 浴 中 ， 加 入 0.5 mL á-amylase 溶液反應 10 分鐘之後加入 5 mL 反應終止劑混合，取出 0.5 mL 加入 0.05 mL 碘溶液及 4.95 mL 去離子水，充分混合後在 波長 580 nm 下測其吸光度，設為 R。
4) Ro：以 0.5 mL 磷酸緩衝溶液取代步驟 3 之 0.5 mL 酵素溶液，重複步驟 3 之反應。
5) 空白 (blank)：以 0.5 mL 去離子水加入 0.05 mL 碘溶液，再加入 4.95 mL 去離水，在波 長 580 nm 下測其吸光值以作為對照之 blank。
6) á-Amylase 之活性計算：
á-Amylase 之活性 (U/mL)：
(Ro-R)/(Ro-blank)*D*S*2*10 S：試管中澱粉之總毫克數 (S=50 mg) D：適當之稀釋倍率
2.2 不同吸附劑之製備
主 要 以 幾 丁 聚 醣 為 基 材 另 外 亦 選 用 Sepharose 6B 當作參考，在不同的交聯劑、配 位基與螯合 Cu2+與否的條件下，製備出各種不同 的吸附劑。吸附劑的代號以及組成可參見表 1。
2.3 吸附
各取吸附劑 0.25 g 置入適當濃度的酵素溶
液中，在 37 恆溫水槽中進行吸附。
2.4 脫附
將吸附完成後濾得之吸附劑置入 0.2 M imidazole 溶液中，於 37 恆溫進行脫附。
3. 結果與討論
3.1 交聯化幾丁聚醣吸附銅離子的能力
將 不 同 交 聯 比 例 製 得 之 crosslinked chitosan 於不同 pH 值條件下與硫酸銅溶液混 合，觀察其對 Cu2+的吸附能力，其吸附條件與 結果列於表 2。得到的結論有二：一是交聯比 例愈高對銅離子的吸附能力愈低，依其吸附百 分比排列分別是 0.5 % > 1.5 % > 2.5 %；另一是 pH 值愈低則交聯後之幾丁聚醣對銅離子之吸 附能力愈強。交聯程度對吸附銅離子的影響可 能是因為交聯作用會降低幾丁聚醣表面的一 級胺基，而吸附銅離子必須藉此胺基，因此造 成交聯添加比例愈高使得螯合能力愈低；銅離 子可能會受到 pH 值影響形成金屬氫氧化物，
且愈酸的環境下過多的氫離子會破壞交聯劑 與幾丁聚醣的鍵結，促使反應基轉為原本反應 性較高的胺基，所以酸性愈強且交聯程度愈低 者愈容易含有較多的胺基，因而使得螫合銅離 子之能力最強。
3.2 擔體交聯後對吸附的影響
以戊二醛 (GA) 為交聯劑將幾丁聚醣交 聯後得到的擔體對 α-amylase 的吸附結果可參 見表 3，由實驗數據可知幾丁聚醣溶於醋酸後 形成的顆粒在經過不同交聯劑濃度之交聯作 用後，其吸附能力隨著交聯劑濃度之增加而提 高，顯示在此範圍內交聯程度有助於 chitosan 擔體對 α-amylase 之吸附，不過值得注意的是最 高吸附比率僅 68.6 %，因此仍有改進之空間。
3.3 交聯過程中以不同的順序添加 IDA 配位 子的影響
在以戊二醛為交聯劑的前提下，可分成三 種不同順序結合配位子 IDA，即是將溶解、交 聯、結合 IDA 三個步驟做不同之排組，如圖 1 所示。然後將此三種不同製備順序形成之顆粒 再與 Cu2+螯合後觀察其對酵素的吸附情形，結 果顯示三種方法形成之吸附劑對 α-amylase 的 吸附百分比分別是 80.56 %、96.46 % 以及 8.24
%，亦即前兩種方法的吸附效果遠高於第三種 製備方式，因此可結論出無論幾丁聚醣先溶於 醋酸或是 IDA 中，必需先和 IDA 結合再進行 交聯，所形成的吸附劑之吸附效果會較佳，其 中又以先溶於醋酸後的方法 (method 2) 效果 最佳，可獲致高達 96.46 % 之吸附活性比。
3.4 吸附劑螯合銅離子與否之影響
吸 附 劑 結 合 銅 離 子 後 是 否 會 影 響 對 á-amylase 之吸附是分別以 crosslinked chitosan 以及 crosslinked chitosan-IDA 進行比較，實驗 結果如表 4 所示。由表中數據可結論出不論是 有螯合 IDA ligand 與否結合銅離子後之吸附劑 確實對 á-amylase 之吸附效果有顯著的改進，
尤其是螯合 IDA ligand 者之效果更是極佳，是 因銅離子可與 á-amylase 可形成較穩定的錯化 物之故。因此於本研究決定採用結合銅離子之 親和性吸附劑進行後續之探討。
3.5 不同交聯劑與配位子的影響
確 定 了 交 聯 以 及 配 位 的 方 式 後 ， 選 用 EGDE 與戊二醛分別為交聯劑進行比較，其吸 附結果示於表 5，EGDE 和戊二醛雖然都可以 對 chitosan 進行交聯作用生成交聯物，但是所 製得的吸附劑之吸附效果則以戊二醛較佳，雖 然 EGDE 在毒性上比戊二醛來得低，但因以 EGDE 為 交 聯 劑 製 備 親 和 性 吸 附 劑 對 α-amylase 之吸附效果僅為 43.32 %，遠低於以 GA 為交聯劑所得之 96.46 %，即使嘗試改變其 他配位基，對以 EGDE 作為交聯劑者之吸附結 果增益仍不大，因此交聯劑仍以戊二醛為最 佳。事實上，在此比較過程中，乙二醛亦曾是 選用之交聯劑，但因製備過程中並未顯現出交 聯作用而予以淘汰。
3.6 以 CNBr 活化和交聯後接 IDA 的比較 CNBr 活化方式是利用幾丁聚醣上氫氧基 在接上 CNBr 後帶有末端環氧基之長鏈分子 [2]，此時 IDA 再以其氮分子提供為共用電子 對與環氧基反應並固定於幾丁聚醣上，因此末 端會帶有兩個 COO 基。雖然以交聯方式或以 CNBr 活化的方式製備吸附劑是截然不同，但 最終都是以 IDA 為配位基再螯合 Cu2+以吸附 酵 素 ， 結 果 發 現 以 CNBr 活 化 後 之 chitosan-IDA-Cu2+和 以 戊 二 醛 交 聯 所 得 之 chitosan-IDA-Cu2+的吸附結果分別是 94.82 % 和 96.46 %，兩者相差不大，但以戊二醛交聯 製備者所得的吸附結果是比活化方式略佳。
3.7 與Sepharose 基材構成之親和性吸附劑之比較 由於市面常見用於金屬親和性吸附的吸 附劑大多是以 Sepharose 6B 為基材與 IDA 配位 後再與 Cu2+螯合所得，因此在此亦觀察改變擔 體基材為幾丁聚醣的方法製備所得之吸附劑 與 Sepharose 6B 基材比較之吸附效果，結果顯 示 ， Sepharose 6B-IDA-Cu2+ 和 crosslinked chitosan-IDA-Cu2+的吸附百分比分別為 94.82%
與 96.46%。兩者僅相差約 1.6 %，意味著此研 究中以幾丁聚醣為擔體應用在親和性分離方
圖 1 三種不同方式製備交聯幾丁聚醣螫合 IDA 之吸附劑之流程 Chitosan
Dissolved in acetic acid solution (method 1)
Add IDA powder Drop into NaOH solution (method 2) (method 3)
Drop into NaOH solution
Crosslinked with GA
Drop into NaOH solution Crosslinked with GA
Crosslinked with GA Add IDA powder Dissolved in IDA solution
面的潛力，且幾丁聚醣不但價錢較低、回收容 易，對生物有更大的相容性外，實驗上的使用 量也較 Sepharose 6B 經濟。
3.8 以 imidazole 進行脫附
親和性吸附後繼之的脫附步驟其實和吸 附過程一樣重要，能夠將吸附後之蛋白質完整 脫附而不影響其活性，對於以吸附法達到之純 化 之 過 程 才 有 意 義 ， 因 此 以 螯 合 競 爭 劑 imidazole 進行脫附。
脫附結果顯示經由交聯所得之吸附劑在 脫附過程中幾乎都沒有脫附效果，而以 CNBr 活化後的吸附劑則展現出高達 98 %的脫附能 力。顯示出交聯方式和活化方式對於蛋白質的 鍵結強弱與位置可能有很大之差異，造成兩種 製備方法形成之吸附劑雖然具有相同之吸附 機制，但卻無法同時被相同之脫附劑脫附，可 能的原因有許多，如以 CNBr 活化方式製備之 吸附劑本身含有長鏈分子似延伸臂之作用，能 夠大幅減低吸附劑本身之立體障礙 [3]，相較 之下以交聯方式製備之吸附劑僅將配位子直 接以交聯劑連結，並沒有延伸臂之構造，容易 造成吸附與脫附均受吸附劑構造之影響。這僅 是其中一種解釋，也可能是兩種不同製備方式 之吸附劑造成不同之立體障礙，影響 imidazole 分子靠近吸附酵素之位置，而無法取代酵素進 行脫附之步驟等種種因素，造成兩種製備方式 之吸附劑有不同之脫附結果。
4. 結論
綜合前述，吸附澱粉水解酵素效果最佳者 分別是由以 CNBr 活化 chitosan-IDA-Cu2+吸附 劑與 crosslinked (GA) chitosan-IDA-Cu2+，雖然 與商品化之 Sepharose-6B-IDA-Cu2+ 吸附劑對 α-amylase 之吸附效果相差不多，但是以幾丁 聚醣為擔體不但在成本上較佔優勢、回收容易 並且對生物有很好的相容性，而使用 GA 交聯 之步驟無論在反應時間或藥品的消耗上都遠 少於 CNBr 活化法之製備方式，兼之效果突 出，發展潛力更是不可限量。但兼具考慮脫附 效果，則以 CNBr 活化法製備的親和性吸附劑 方能兼顧吸脫附效果。
5. 參考文獻
[1] I. Katsutoshi, Y. Kazuharu and O. Keisuke,
“Adsorptive separation of some metal ions by complexing agent types of chemically modified chitosan,”
Analytica Chimica Acta
, 388(1-2), pp. 209-218, 1999.[2] T. Chandy, D. L. Mooradian and G. H. R.
Rao, “Chitosan polyethylene-glycol alginate microcapsules for oral delivery of hirudin,”
Journal of Applied Polymer Science
, 70(11), pp. 2143-2153, 1998.[3] T. H. Greg and P. K. Smith,
Immobilized
Affinity Ligand Techniques
, Academic Press, Inc., California, USA, 1992.表 1 不同吸附劑之代號與組成
吸附劑代號 基材 交聯劑 配位子 ion
Crosslinked (GA) chitosan-IDA-Cu2+ 幾丁聚醣 GA IDA Cu2+
Crosslinked (GA) chitosan-IDA 幾丁聚醣 GA IDA
Crosslinked chtiosan-Cu2+ 幾丁聚醣 GA Cu2+
Crosslinked chitosan 幾丁聚醣 GA
Crosslinked (EGDE) chitosan-IDA-Cu2+ 幾丁聚醣 EGDE IDA Cu2+
Sepharose-6B-IDA-Cu2+ Sepharose-6B EPI IDA Cu2+
Sepharose-6B-IDA Sepharose-6B EPI IDA GA: glutaraldehyde; EGDE: ethylene glycol diglycidyl ether; IDA: iminodiacetic acid; EPI: epichlorohydrin 表 2 不同交聯劑添加比例所得之幾丁聚醣於不同 pH 值下對銅離子之吸附
pH=4.5
交聯劑比例 2.5 % 1.5 % 0.5 %
硫酸銅初始濃度 (M) 0.246 0.247 0.249
吸附後之殘餘硫酸銅濃度 (M) 0.235 0.163 0.108
吸附百分比 (%) 4.640 33.83 56.61
pH=3.5
交聯劑比例 2.5 % 1.5 % 0.5 %
硫酸銅初始濃度 (M) 0.185 0.197 0.220
吸附後之殘餘硫酸銅濃度 (M) 0.137 0.088 0.016
吸附百分比 (%) 26.10 55.14 92.78
pH=2.5
交聯劑比例 2.5 % 1.5 % 0.5 %
硫酸銅初始濃度 (M) 0.269 0.269 0.269
吸附後之殘餘硫酸銅濃度 (M) 0.143 0.067 0.006
吸附百分比 (%) 46.84 74.94 97.43
表 3 以 GA 為交聯劑，在不同交聯濃度下製備之吸附劑對 α-amylase 之吸附比較 (Uo=750.2 U/mL)
吸附後之液相活性 (U/mL) 吸附劑 吸附百分比 (%)
513.5 Chitosan 35.17
749.0 0.5 % crosslinked chitosan 4.98 599.4 2.5 % crosslinked chitosan 22.30 357.9 5.0 % crosslinked chitosan 45.30 200.1 10.0 % crosslinked chitosan 68.60 表 4 螫合銅離子對酵素吸附之影響
吸附劑 吸附百分比 (%)
Crosslinked (GA) chitosan 22.30 Crosslinked (GA) chitosan-Cu2+ 18.66 Crosslinked (GA) chitosan-IDA 9.93 Crosslinked (GA) chitosan-IDA-Cu2+ 96.46
表 5 以不同交聯劑製備 crosslinked chitosan-IDA-Cu2+對酵素吸附之影響 Glutaraldehyde EGDE
交聯結果 黃色交聯物 白色交聯物
吸附劑加量 (g/mL) 2.5 2.5
á-Amylase 初始活性 (U/mL) 641.57 732.81 吸附 á-amylase 後之活性 (U/mL) 13.42 415.36
吸附百分比 (%) 96.46 43.32
6
