藻類對水中汞生物累積及轉換效應之研究

藻類對水中汞生物累積及轉換效應之研究

中華民國九十九年十一月十二、十三日 屏東縣國立屏東科技大學環境工程與科學系 1

藻類對水中汞生物累積及轉換效應之研究

蔡芷妤，弘光科技大學環境與安全衛生工程系專研生 黃文鑑，弘光科技大學環境與安全衛生工程系教授

摘要

本研究以本省優養化水庫篩選之藻體對汞(Hg)及甲基汞(Me-Hg)進行吸附/

吸收實驗，探討藻類吸附/吸收水中 Hg 及 Me-Hg 之生物累積能力及影響因子，

包括水質因子、藻種、吸附/吸收時間、藻類濃度等，同時針對藻細胞內是否會 因藻類生化代謝作用而將Hg 轉生成 Me-Hg 之生物性轉換作用，本文亦分別以層 析法配合耦合電漿質譜儀(ICP-MS)分析 Hg 及 Me-Hg 之分佈。另針對水中 Hg 的生物累積作用，利用實驗室培養的純藻(微囊藻, Microcystis aeruginosa)及水庫 繁殖的藻類(綠球藻, Prochlorococcus)，添加微量 Hg 及 Me-Hg 至原水中，利用 DCB 萃取技術將吸附在藻體細胞壁表面的 Hg 及 Me-Hg 脫附出來，分辨藻類對 Hg 或 Me-Hg 的表面吸附及內部吸收量。研究結果顯示，綠球藻及微囊藻對 Hg 之吸附/吸收力相當迅速，約經 1 日之接觸，水相即有高達 65 %的 Hg 被兩種藻 體所吸附/吸收，其中約 80 %是被藻體吸收至細胞內，另約 20 %則吸附在藻體細 胞壁。另針對藻體對 Me-Hg 之吸附/吸收結果顯示兩種藻類對 Me-Hg 之吸附/吸 收量隨接觸時間增加而持續上昇，且經63 天實驗期間發現約 99 %之 Me-Hg 被 吸收至藻細胞內，吸收量比例明顯高於 Hg。另外，本研究亦發現單位藻類吸收 Hg 量(ng-Hg/cell)與藻類生長週期有關，吸收量與藻體濃度成反比關係，亦即藻 類濃度愈高，單位藻體吸附/吸收之 Hg 量較低。對於水中之 Hg 經生物代謝作用 可能轉生成 Me-Hg 之現象，本研究發現微囊藻所吸收後之 Hg，部分可轉換為 Me-Hg，此現象之發生機制仍有待進一步探討。

關鍵字：優養化、藻類、汞、甲基汞、生物累積作用 一、前言

國內因工業廢水、廢棄物、水源集水區陸續不當的開發、處置，及汙染物排 放量持續增加，造成部份湖泊、水庫養分過多，以致河川及湖泊水庫優養化情況 嚴重，造成藻類大量繁殖或死亡，甚至引起藻華現象，導致水中溶氧耗盡水質惡

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化。近年來許多研究發現，藻類具有吸附水中重金屬的能力，其吸附的特性及對 重金屬的親和力，可將金屬離子從水中移至藻體表面-吸附作用(adsorption)，甚 至穿透細胞壁進入藻細胞內-吸收作用(absorption)，累積在藻體。

當河川及湖泊水庫受到重金屬污染，對生物體可能造成極大的衝擊，因為重 金 屬 具 有 對 生 物 體 放 大 作 用 (biomagnification) 或 生 物 累 積 作 用 (bioaccumulation)，其中以微量 Hg 金屬的生物累積現象特別受到關注，Hg 對於 人類和海洋生物是一種極毒的物質，在環境中經生物鏈濃縮效應成為持久性生物 累積毒性化學物質，透過微生物的作用，轉化成有機汞，其中以 Me-Hg 最具代 表，此物質可溶解於不同的化學物質並存在水域中，並經沉澱物吸附，逐漸於河 流、湖泊和海洋底部沉積。(Biester et al., 2000；Paraquetti et al., 2004；He et al., 2008)。

1.根據文獻報導(Awasthi, M. and Rai, L. C., 2004)藻體攝取重金屬可能原因如下：

(1) 部分金屬為藻體內所需營養物，尤其是陽離子及其他微量金屬離子(Struck et al., 1997)。

(2) 藻細胞對於金屬離子具有特殊的耐受能力(Csonto et al., 2001)。

(3) 取決於藻細胞生理上的條件(Rai et al., 1994)。

2.環境中汞的傳遞及宿命因素如下所述（USEPA, 1997）：

(1) 汞由空氣中的比例及變化使其沉積於地球。

(2) 汞從大氣傳遞至表面水及陸地，主要藉由濕沉降途徑。

(3) 汞能經過一些化學變化以溶解或微粒型態存在於水域中。

(4) 汞沉積於受污染的表面水底部且可能成為汞重要的蓄積地方。

(5) 汞能長時間存在土壤之中，且汞累積於土壤中要釋出至表面水或其他媒介 需要很長一段時間，甚至可能是幾百年的時間。

(6) 其他暴露途徑可能為植物、動物和人類直接接觸到汞污染的環境或間接攝 入汞污染的水和食物。

利用本省優養化水庫繁殖的藻類及實驗室培養的純藻，模擬水庫遭受汞污染 對藻類之生物累積(Bioaccumulation)效應，藻類吸收 Hg 及 Me-Hg 的能力可能與 藻體種類、水中環境等因子有關，目前在相關的研究報告中並未有較深入的討 論，同時在藻類各生長代謝階段所吸附/吸收的量也可能不相同，加上藻類代謝 的胞外產物也可能與Hg 及 Me-Hg 反應，因此本研究以藻體對 Hg 及 Me-Hg 的 吸附/吸收作用進行探討，並且探討藻類對於 Hg、Me-Hg 是吸附於藻體表面或者 吸收於藻體內部，藉此可瞭解藻體累積Hg 及 Me-Hg 的多寡，再利用 DCB 萃取 技術將吸收的Hg 及 Me-Hg 脫附出來，分辨藻類對 Hg 及 Me-Hg 的吸附及吸收 量，未來可以運用在河川、湖泊、水庫，探討最有效去除台灣水體中Hg 金屬汙 染之藻類，在文獻報告中亦常有新毒性效應增加現象的發現。

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二、研究方法

1.實驗材料、設備及藥品

(1) 感應耦合電漿質譜儀(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，

ICP-MS) (Perkin Elmer Sciex ELAN DRCⅡ) (2) 旋轉攪拌器(Kansin Instruments Co., Ltd., Taiwan)

(3) 場發射掃描電子顯微鏡(Field-emission scanning electron microscope，

FESEM)(JEOL JSM-6700F Oxford inca energy 400)

(4) 湯 瑪 氏 血 球 計 數 盤 (Thomas haemacytometer)(Neubauer Improved Bright-Line Marienfeld，Germany)

(5) 螢光顯微鏡(Nikon Eclipse E600) (6) 微波消化(MARS-5,CEM)

(7) 高 效 能 液 相 層 析 儀 (High Performance Liquid Chromatograph ， HPLC)( Perkin Elmer Series 200 pump)

(8) 汞標準品(Mercury standard solution)：Mercury (II) nitrate in nitric acid 0.5 mol/L(Merck，Germany)

(9) 甲基汞標準品(Methylmercury-chloride)：purity≧95.5%(Dr. Ehrenstorfer，

Merck，Germany)

(10) NaHCO3(Sodium Bicarbonate)：purity≧99%(GR 級，OSAKA，Japan) (11) Na3C6H5O7．2H2O(Sodium Citrate)：purity≧99%(GR 級，OSAKA，Japan) (12) Na2S2O4(Sodium Hydrosulfite)：purity≧99%(GR 級，OSAKA，Japan) (13) 低汞硝酸(GR 級，E-Merck，Germany)

(14) 戊二醛(Fluka，USA) 2.細胞培養

實驗採優養化原水鯉魚潭中藻體(主要藻相為綠球藻 Prochlorococcus)及實驗 室人工培養之純藻種微囊藻(Microcystis aeruginosa)，初始藻濃度控制在約 5×10⁵ cells/ml、初始體積約 1,500 ml，並分別置於 2 L 血清瓶，於不同時間點採樣分析，

進行光照增殖培養每天8 小時並旋轉攪拌，添加適當濃度之營養鹽培養液於藻類 中每天10 ml，於培養期間分析其生長濃度，並根據其生長速率曲線，視需要加 入空氣補充藻類所需之碳源。

3.藻體吸附/吸收 Hg 實驗

藻體於初始濃度加入微量Hg，藻細胞與重金屬可能的吸附或鍵結發生在藻 類細胞的細胞壁和藻膠質（Alginate matrices）。推測藻體吸附/吸收重金屬途徑

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可能為藻體表面（細胞壁）帶有負電荷能吸附帶正電之金屬；細胞壁外圍蛋白質 及多醣體能與金屬形成電價中和或共價鍵方式結合。

4.藻細胞表面吸附重金屬之DCB萃取實驗

將過濾後之濾紙置入含3.0 g 的 Na2S2O4及40 ml 之 0.3 M Na3C6H5O7．2H2O 的錐形瓶中，再加入5 ml 的 1.0 M NaHCO3，進行振盪萃取3 小時，最後以 0.22 μm 濾頭過濾，利用 ICP-MS 進行 Hg 及 Me-Hg 之含量分析，此方法稱之為 DCB-extracting（Taylor et al., 1983），可將藻體表面吸附之 Hg 萃取出。

5.藻體計數及鏡檢(圖 1 及圖 2) (1)掃描式電子顯微鏡（SEM）觀察

觀察藻細胞是否遭受汙染實驗中所觀察之樣品需先進行脫水、乾燥及鍍金，

隨後固定於管線抬面之不鏽鋼片(5 mm×5 mm)，詳細實驗步驟如下：

(a)試樣固定化：將反應後之樣品經由 0.45 μm 硝酸纖維濾紙過濾，浸泡於 2.5

%戊二醛溶液中，於 4 ℃下靜置固定一天。再以 0.1 M 磷酸鹽緩衝溶液浸 洗3 次，每次浸泡時間約為 10 分鐘。

(b)試樣脫水：於不同濃度之酒精溶液（濃度分別為 30 %、50 %、70 %、90 %、

95 %、100 %、100 %、100 %）進行一連續系列的脫水，每次脫水時間約 為10 分鐘。

(c)臨界乾燥：將脫水後樣品以臨界點乾燥機（Critical point dryer，LADD28000）

進行臨界點乾燥（Critical point drying，CPD）。

(d)鍍金膜：將樣品固定在樣品台（stub），進行鍍金，膜厚 20 nm，再將樣品 置入場發掃描式電子顯微鏡（FESEM）觀察藻體外型。

(2)藻體計數

利用螢光顯微鏡以湯瑪氏血球計數（Thomas haemacytometer）每毫升藻液中 含有的藻體數目（圖3）。

(a)計算方式:計算 1 ml 中溶液含有的藻體數目。

圖1. 微囊藻藻體 SEM 圖 圖2. 綠球藻(篩選自鯉魚潭)藻體 SEM 圖

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(b)（平均值/16）×（1/0.00025）×1,000＝藻體數目（cell/ml）。

6.分析方法

Hg 及 Me-Hg 檢測方法

在不同分析點取0.5 mL 藻液裝入消化瓶，在加入 10 mL 低汞硝酸，將瓶蓋、

安全膜片及外套均蓋上並鎖緊，在條件800 W、Ramp 10 min、溫度 180 ℃、Hold 5 min，經 30 分鐘後加溫完成，待冷卻後，用 DI 水定量至 100 mL。

本實驗經吸附/吸收實驗之過濾水樣、DCB-extracting萃取後之濾液及消化後 之樣品進行分析，以感應耦合電漿質譜（ICP-MS）測其總汞濃度。感應耦合電 漿質譜儀是一種能分析多微量元素和同位素技術，結合ICP的原子化和游離化注 入樣品的特性，並藉由質譜儀的高靈敏度提高分析能力，此外ICP-MS為對大多 數元素具有相當低的偵測極限。利用此特徵進行微量的分析，並經一連串的計算 算出Hg濃度的變化及驗證Hg在藻體內是否會轉化成Me-Hg。

三、結果於討論

1.藻體對Hg之吸附/吸收結果分析

本實驗經與 Hg 接觸後之藻體經固、液分離，利用 DCB 萃取劑將吸附在藻 體表面(細胞壁或胞外物)之 Hg 脫附出來，經分析脫附出 Hg 濃度定義為吸附量，

由總量減吸附量及液相中Hg 的殘留量即獲得藻體內部吸收量，圖 4 顯示水相絕 大多Hg 是被藻體吸收至細胞內，另由圖 5 可見綠球藻對 Hg 之吸附/吸收量在接 觸1 日後即有 80 %總量，其中有 60 %是吸收至藻細胞體內。圖中亦可見隨著接 觸時間增加，微囊藻對Hg 的吸收量持續增加，約至 14 天後之吸收總量可達 95 % 顯示藻體對Hg 的吸收能力相當高，且大部分 Hg 是被藻體吸收至細胞內。另值 得注意的是兩種藻類在吸收後期，細胞吸收之Hg 會再度釋出至水相，此結果是 否表示藻體在承受某種濃度Hg 後會自動釋出。

圖3. 湯瑪氏血球計數（Thomas haemacytometer）

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0 1 2 3 4 5

1 2 3 5 7 9 14 21 28 35 42 49 56 63

Concentration of Hg (μg/L) Absorption Adsorption Water residual Hg

0 1 2 3 4 5

1 2 3 5 7 9 14 21 28 35 42 49 56 63

Concentration of Hg (μg/L) Absorption Adsorption Water residual Hg

2.藻體對Me-Hg之吸附/吸收結果分析

圖6顯示在水中起始濃度含5 μg/L (C0）之Me-Hg，微囊藻在約21日後對Me-Hg 之吸附/吸收量可達98%，且大部份是以吸收為主。另由圖7之綠球藻亦有相同現 象，與前述之吸附/吸收Hg結果相比，兩種藻類對Me-Hg之吸收量略高於Hg，且 在吸收後期，亦未發現有Me-Hg再度釋出至水相情形，據此研判藻體對Me-Hg具 有相當吸附容量，以本實驗控制之藻細胞數吸收5 μg/L濃度Me-Hg，可估算微囊 藻及綠球藻對Me-Hg之吸收容量分別為0.0022、0.0018 ng-Me-Hg/cell。

0 1 2 3 4 5

1 2 3 5 7 9 14 21 28 35 42 49 56 63

Concentration of Hg (μg/L)

Absorption Adsorption Water residual MeHg

0 1 2 3 4 5

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Concentration of Hg (μg/L)

Absorption Adsorption Water residual MeHg

3.藻體生長週期與吸附/吸收Hg及Me-Hg之相關性

本實驗針對藻類在各生長週期之細胞活性及增殖數量對Hg 及 Me-Hg 吸收能 力之探討，圖8 顯示微囊藻對 Hg 的吸收能力，當藻類在遲滯期(lag phase)濃度 變低時，單位藻體內吸收的Hg 量變高，另藻類濃度在對數生長期(log phase)最 高 可 達 3×10⁶ cells/ml 。 在 遲 滯 期 之 單 位 藻 細 胞 吸 收 Hg 量 最 高 達 0.009 ng-Hg/cell，當對數生長期藻類濃度增高，單位藻體吸收 Hg 的量又逐漸降低至

圖4. 微囊藻對汞的表面吸附,內部吸 收量及殘留水中濃度（C0 = 5 μg/L, 藻 濃度 = 10⁵ cells/mL）

圖5. 綠球藻對汞的表面吸附,內部吸 收量及殘留水中濃度（C0 = 5 μg/L, 藻 濃度 = 5×10⁵ cells/mL）

圖7. 綠球藻對甲基汞的表面吸附,內 部吸收量及殘留水中濃度（C0 = 5 μg/L, 藻濃度 = 10⁵ cells/mL）

圖6. 微囊藻對甲基汞的表面吸附,內 部吸收量及殘留水中濃度（C0 = 5 μg/L, 藻濃度 = 10⁵ cells/mL）

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0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000

1 2 3 5 7 9 14 21 28 35 42 49 56 63 Incubation Time(day)

Algae(cells/mL)

0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01

Absorb Capacity(ng-Hg/cell)

Algae count Absorb Capacity

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000

1 2 3 5 7 9 14 21 28 35 42 49 56 63 Incubation Time(day)

Algae(cells/mL)

0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01

Absorb Capacity(ng-Hg/cell)

Algae count Absorb Capacity

0.002 ng-Hg/cell，顯見藻體濃度與吸收 Hg 量成反比關係。另綠球藻在各階段吸 收Hg 能力(圖 9)趨勢與微囊藻相似，藻濃度達 8×10⁶ cells/ml，單位藻細胞吸收 Hg 量最高達 0.006 ng-Hg/cell，當藻類濃度上升藻類吸收 Hg 量會增加，但單位 藻細胞吸收量降低，實際上並非藻濃度高，細胞吸收Hg 金屬量較多，而是固定 Hg 濃度條件下單位藻細胞所負荷的量不同，藻濃度會隨各生長階段不同而異，

所承受的Hg 吸收濃度也會隨著改變，微囊藻藻體單位藻細胞吸收量比綠球藻體 來的高，但微囊藻藻體對含Hg 的適應生長繁殖能力比綠球藻差。

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000

1 2 3 5 7 9 14 21 28 35 42 49 56 63 Incubation Time(day)

Algae(cells/mL)

0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01

Absorb Capacity(ng-Hg/cell)

Algae count Absorb Capacity

0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000

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Algae(cells/mL)

0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01

Absorb Capacity(ng-Hg/cell)

Algae count Absorb Capacity

再者，圖10 及圖 11 分別顯示微囊藻及綠球藻在不同生長週期對 Me-Hg 的 吸收能力，當藻類濃度變低時(遲滯期)，單位藻體內吸收 Me-Hg 量變高，在藻類 濃度最高達1.3×10⁷ cells/ml，單位藻細胞吸收 Me-Hg 量 0.005 ng-Hg/cell。當藻 類濃度變高(對數生長期)，兩種藻體吸收 Me-Hg 容量分別為綠球藻 0.0005 ng-MeHg/cell、微囊藻 0.001 ng- MeHg /cell。另微囊藻對 Hg 及 Me-Hg 單位藻細 胞吸收量均比綠球藻高。

圖8. 微囊藻吸附/吸收汞期間之藻類 濃 度 及 單 位 藻 體 內 所 含 之Hg 量

（ng-Hg/cell）（C0 = 5 μg/L, 藻濃度 = 5×10⁵ cells/mL）

圖9. 綠球藻吸附/吸收汞期間之藻類 濃 度 及 單 位 藻 體 內 所 含 之Hg 量

（ng-Hg/cell）（C0 = 5 μg/L, 藻濃度 = 5×10⁵ cells/mL）

圖10. 微囊藻吸附/吸收甲基汞期間 之 藻 類 濃 度 及 單 位 藻 體 內 所 含 之 Me-Hg量（ng-MeHg/cell）（C0 = 5 μg/L, 藻濃度 = 5×10⁵ cells/ml）

圖11. 綠球藻吸附/吸收甲基汞期間 之 藻 類 濃 度 及 單 位 藻 體 內 所 含 之 Me-Hg量（ng- MeHg /cell）（C0 = 5 μg/L, 藻濃度 = 5×10⁵ cells/ml）

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4.Hg在藻體之生物轉換

本實驗於人工原水中添加Hg⁺²，觀察藻體(微囊藻)是否會利用生化代謝作用 將Hg⁺²轉生成其他型態的Hg(例如Me-Hg)。實驗結果(圖12)顯示水中之Hg⁺²在培 養20日內，其濃度逐漸下降，反觀Me-Hg則出現在藻體內，且濃度逐漸增高，但 在培養20~42天期間，發現藻體內Me-Hg逐漸降低，Hg則增加，此現象之Hg及 Me-Hg有持續循環現象，然其轉換機制則需進一步探究。

0 20 40 60 80 100 120 140

0 20 40 60 80

Incubation Time (day)

Concentration of Hg (μg/L)

MeHg Hg

四、結論

1.本研究試驗之藻體對Hg的吸附/吸收量呈現隨培養時間增長而增加趨勢，顯示 藻類對水中Hg或Me-Hg有生物累積放大作用。

2.利用DCB萃取藻細胞壁吸附的Hg，發現大部分Hg都是被吸收至藻細胞內，但 藻體在承受相當濃度Hg量時，會再度釋放至水相中。

3.藻體對Hg/Me-Hg之吸收實驗結果發現，微囊藻對Me-Hg吸收/吸附能力高於綠 球藻，主因可能是微囊藻外部具有囊膜，能吸附部份Me-Hg。

4.比較同一藻類對Hg及Me-Hg的的吸附/吸收能力發現微囊藻對Me-Hg吸收/吸附 能力較Hg高。

5.本研究以Hg添加至微囊藻中發現有部分Hg轉生成Me-Hg，且隨培養時間增加而 遞增。

參考文獻

1. Biester, H., Schuhmacher, P., Müller, G., “Effectiveness of mossy tin filters to remove mercury from aqueous solution by Hg(II) reduction and Hg(0)

圖12. 微囊藻培養期間Hg及Me-Hg變動趨勢

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