應用微流體平台於共生細胞交互作用及神經細胞生長之研究

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

期中報告

應用微流體平台於共生細胞交互作用及神經細胞生長之研究

（計畫名稱）

計畫類別：

個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：97-2221-E-006-222-MY3

執行期間： 95 年 8 月 1 日至 98 年 7 月 31 日

計畫主持人：林裕城

共同主持人：

計畫參與人員：葉家顯、賴憲欽、徐慶崴

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：

精簡報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計 畫、列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

9涉及專利或其他智慧財產權，□一年

兩年後可公開查詢

一、 中文摘要

本實驗室利用微機電製程技術應用在微流道操控技術於製作微乳化球和細胞共同 培養的研究上已獲得不錯的成果，並已發表於國際上知名的研討會和期刊上。而在往 後的相關研究方面，本研究計劃第一部份要利用此成熟的微流操控技術，製備出細長 微纖維，並在此微纖維上培養細胞，用於組織工程中修補神經組織和培養細胞的支架 用途上，其實驗之設計不僅是微流體領域中的新式突破，不僅解決製備技術上的瓶頸，

也是製備生醫材料上的另一種模式。另外在研究計畫第二部份將利用微機電製程技術 提供一種嶄新的細胞共同培養方法，可於同一晶片上同時將兩種細胞分離且共同培 養，並觀察細胞在模擬血管流之應力下，因生長因子之變動，所造成分化及遷移之變 化。在本研究中將利用毛細作用微鑄模法，精確的將細胞分離培養於特定的反應區內，

且在不同細胞分泌之生長因子相互影響，而造成分化及遷移之表現，進而探討在有無 施予流體剪應力的不同環境下，兩種細胞間的分化及遷移情況，並藉由光學顯微鏡與 染劑呈色法進行細胞樣本分析。

關鍵字：微流道，微纖維絲，細胞共同培養，毛細作用微鑄模法

二、 英文摘要

The researches carried in our lab utilizing the microfluidic control technology on fabricating micro emulsions and cell co-culturing have achieved excellent results, and papers have been published on famous international conferences and journals. Regarding the related researches, the first section of this proposal is to utilize this well developed microfluidic control technology to fabricate long microfibers on which cells will grow, aiming to repair nerve tissue and form the cell scaffolds. The second section of this proposal is to provide a novel cell co-culture method using MEMS technique, In this new way, two kinds of cells can be separated and cultivated, and later observed their differentiation and migration caused by the change of growth factor under the pressure in the simulated blood vessel fluid. Utilizing micromolding in capillarie (MIMIC), this proposal can accurately separate and co-culture the cells in the specific reaction region. The influences between each growth factor and the result of differentiation and migration in different environment with and without shear stress were discussed, and the cell samples will be analyzed via microscope.

三、 報告內容 3.1 前言

生物技術、微機電與奈米科技是近十餘年來重要指標性科學發展，從這些技術的 發展打破了許多單一學門獨自研究的領域，進而啟發跨不同領域合作發展的契機。對 工程方面來說，如何更有效的掌控分子生物的分析與提升靈敏度，將是未來十分重要 課題，目前奈米的尺寸對基本生命體的細胞而言，有如一把適合的工具，因此許多不 同材質、型狀與型態都相繼被發展與研製成功。其中，整合微機電技術與生物操控分 析概念發展出來的生物晶片是最具代表性的突破，在微機電製程技術不斷演進之下，

將微小化與整合化的概念應用在生醫檢測運用上，進而開發出各式用途的晶片。如微 陣列晶片(Biochip)與實驗室晶片(Lab-on-a-chip)，而透過微流體的操控研究下所發展出 的微流體晶片，又可稱為微流體晶片(Microfluidic chip)或微整合分析晶片(Micro-total analytical systems, μ-TAS)等，主要是於微小晶片上來完成傳統實驗室所進行的分析流 程，利用微流道及驅動源將檢體、試劑或其他混合物，達到傳送、混合、反應、分離 等目的。在生物操控方面，常用方式是利用微機電技術製作出微型母模，再灌入高分 子材料，待固化後脫模得到所想要的圖案形狀印章，之後再將欲沾印於基材上之自組 裝分子層，轉印於基材上，最後進行生物操控。本計畫將分別以實驗室最近幾年發展 成熟的微流體操控技術和細胞共同培養技術，著手研發應用於生醫層面，冀望能為工 程與生醫領域結合上開創另一個研究方向。

一般來說，用於修補組織或培養細胞的支架(Scaffold)可利用鹽析法、冷凍乾燥法、

熔積成形法、纖維聯結法、薄膜積層法、氣體發泡法、相轉移法等等，而製備出薄膜 狀、幾何形狀，或具特定形狀的支架，以符合所需之條件。然而作為神經組織修復之 用的素材卻鮮少人投入其研究，由於塑造細長支架技術上的困難，加上又需適合神經 細胞的生長才行，因此在這一塊領域上確實有其研究的價值。生物技術、微機電與奈 米科技是近十餘年來重要指標性科學發展，從這些技術的發展打破了許多單一學門獨 自研究的領域，進而啟發跨不同領域合作發展的契機。西元兩千年左右，人類基因定 序工程的完成使得許多疾病與遺傳的秘密可望於近期會有解決的方案。對工程方面來 說，如何更有效的掌控分子生物的分析與提升靈敏度，將是未來十分重要課題。目前 奈米的尺寸，十分適合對基本生命體的細胞或細菌進行研究，因此許多不同材質、形 狀與型態(與生物結合的奈米膠體)都相繼發展與研製成功。也許有許多生物學所面臨 的難題將有可能從奈米科技中找到解決的方法，所以重要的期刊如科學期刊(Science) 與自然期刊(Nature)探討奈米與生物關係的研究報告，已經佔有將近四分之一比例的篇

設計及製作，在不同環境下對微纖維絲生成影響與尋求最佳化參數，第二部分主要針 對細胞共同培養裝置(毛細作用微鑄模)設計與製作，並進行細胞的收集計數、繼代培 養與選用，尋求最佳細胞濃度下進行細胞共同培養後，探討並加以分析細胞的遷移機 制。第二年(98年度)第一部分為嚐試其他材料(PDMS)製作微流道晶片方法，培養細胞 於不同生醫材料上，以及探討研究神經細胞特性和其細胞的染色方法，第二部分為再 縮小細胞間的間隔距離並加以分析研究細胞共同培養後的細胞遷移距離。第三年(99年 度)第一部分主要探討最佳化的材料試劑調配，纖維絲的表面修飾處理並加入培養細胞 之探討和細胞影像分析與細胞活性研究，第二部分主要探討流場數值模擬，循環式流 體裝置平台設計製作和引入流體剪應力下共同培養後細胞遷移距離之探討。

3.3 文獻探討

微流道晶片最早是由晶片實驗室(Lab-on-a-chip)應用微機電製程技術製作出微小 生物晶片，在1994年，由美國Oak Ridge National Laboratory提出的想法。藉由微機電 製程技術將實驗室等相關功能製作在微小晶片上後，可便於研究人員進行實驗操作，

或是可以讓醫師在數分鐘內快速地診斷出病人的疾病，在平行化且大量分析的微流道 晶片，使研究人員可以快速、大量合成及篩選新藥，以達到加速新藥的研發，並且微 流道晶片可以依照不同的需求進行設計，進行不同的化學實驗。

對於生醫材料與細胞組織間的相互影響而言，在生醫材料相關研究發展，已經由 生物惰性材料和與細胞組織間的相互作用的生醫材料階段，到現在發展由臨床需求而 設計、合成與製造的生醫材料。在分子生物領域的進展更促進了組織工程的發展，讓 生醫材料的相關應用進到一個嶄新的階段，即利用生醫材料於相關生物技術，藉由生 物學原理去設計和製造與生物結構相似功能的生醫材料。新型生醫材料是由活體細 胞、細胞組成和細胞生物，以及類似細胞生物功能所組成，且能充分發揮人體自身修 復和改善的功能，讓材料科學與生命科學能進行整合應用於組織工程上，讓生醫材料 科學提供細胞組織修復的框架，生物技術提供組織修復及改善的功能。

有鑑於人工結構組織的位置與圖形對於基材表面上調控細胞成長之重要性，為了 使細胞能夠有選擇性的黏附於基材表面，一直有學者提出解決的方法。早期在於引導 細 胞 遷 移 、 貼 附 、 或 是 延 伸 之 研 究 ，1998 年 Branch 等 人 [1] 以 二 甲 基 矽 氧 烷 (Polydimethylsilcoxane, PDMS)形成的壓印頭，以微接觸印刷法將有機分子Poly-lysine 轉印於玻璃基材上，也因Poly-lysine會吸引神經細胞貼附於有轉印於Poly-lysine的位置 之玻璃基材上，故可達到定位效果；1997與1998年Delamarche等人[2-3]則是利用翻模 方式得到PDMS微管道，再以毛細原理將有機分子在基材表面上形成微結構層，以進

時Poiseuille等人發表了關於毛細血管中血液流動的論文，之後相繼有許多這方面的研 究發表[6-8]；在1981至1985年間Dewey、Nerem與Wechezak等學者利用穩態流體機所 產生高於7 dyne/cm² 的流體剪應力使內皮細胞骨架拉長，並使細胞順著流體方向排列 成長[9-11]；而剪應力會造成內皮細胞本身的metabolic 與gene調控反應更為明顯，此 現象也在1995到2001年間被Resnick、Barakat與Garcia-Cardena等學者所發表[13-15]。

3.4 研究方法 (97年度，計畫執行第一年，本計畫共三年) 第一部份

1. PMMA微流體晶片

1.1 PMMA晶片製程結果

1.2 PMMA晶片層流生成之現象

1.3 PMMA晶片中流量與層流厚度生成之關係 2. 幾丁聚醣纖維絲之生成與纖維母細胞培養結果

2.1 PMMA晶片製備幾丁聚醣纖維絲結果 2.2 幾丁聚醣纖維絲與纖維母細胞培養結果 第二部份

1. 細胞共同培養裝置-毛細作用微鑄模設計與製作 2. 細胞收集計數、培養與選用

3. 兩種細胞(SMCs & ECs)分離培養的間距與最佳濃度之探討 4. 以單一種細胞(SMCs / ECs)進行培養後細胞遷移之探討 5. 以兩種細胞(SMCs & ECs)進行共同培養後細胞遷移之探討

3.5 結果與討論 第一部份

(1) PMMA晶片製程結果

藉由PMMA 材質的熔點為 240~250℃的特性，利用雷射加工來製備微流體晶片，

具有立即刻劃出微流道的優點，可大幅縮減製程的時間。但由於壓克力材質的熱塑性 高，在雷射光束的切割下，流道交匯處部分會有所缺損，如熱熔變型或是材質因流道 形狀造成受力不均而擠壓縮減流道等缺陷，使得與理想流道設計有所出入，如圖 1 所 示，所製備的 30°與 60°角流道皆無法維持應有的流道結構。而 45°角流道則較能維持 理想中的結構，因此 PMMA 微流體晶片實驗採以 45°角流道(圖 2)進行研究，以探討 PMMA 流道晶片在製備幾丁聚醣纖維絲的情形。

30° 60°

30° 60°

(a)

(b)

30° 60°

30° 60°

(a)

(b)

圖1 經雷射加工製成的30°與60°角PMMA微流道：(a) 30°角流道晶片，(b) 60°角流道晶 片，在雷射加工機的製備下，其流道結構有所變型 (比例尺為200 μm)

(a) (b)

45°

(a) (b)

45°

圖2 經雷射加工製成的45°角PMMA微流道：(a) 45°角流道結構上較完整 (比例尺為200 μm)，(b) 完成組裝後之45°角流道晶片，長度為84.9 mm，寬度為79.3 mm，厚度為4.5 mm

(2) PMMA 晶片層流生成之現象

以 45°角流道晶片進行探討實驗的結果，以 0.5%的幾丁聚醣溶液為中央流體，黏 度為36.5 cp，以 10% 三聚磷酸鈉(pH 5.22)溶液為邊鞘流體。在實驗後發現，由於中 央流體具有的黏稠度，加上側邊流道以非垂直角度注入，一方面可使由側邊流道進入 的流體擠壓中央流體形成層流外，交聯反應在流體表面開始進行，使得層流能持續的 生成。如圖3 所示，中央流體流量固定為 0.5 mL/min，而邊鞘流體流量固定在 3.0 mL/min 時，發現在200 μm 的流道交匯處，中央流體會受到擠壓而形成層流，並在流體連續向 前推進下可固定層流厚度。在直線流道中，層流受到上下方等量流體的擠壓能穩定層 流的厚度，同時也發現藉由操控中央流體與邊鞘流體的注入量可改變層流的厚度，此 現象在操控幾丁聚醣纖維絲的生成上具有關鍵的重要性。

圖3 流道裡層流生成現象，在操控液體流量下可輕易形成細長的層流，藉此可應用在 幾丁聚醣纖維絲的製備上 (比例尺為200 μm)

(3) PMMA 晶片中流量與層流厚度生成之關係

從實驗結果中發現，在固定中央流體流量下，層流厚度隨提高邊鞘流體的流量而 減少，即在固定三聚磷酸鈉溶液流量的條件下，幾丁聚醣溶液流量的提升將具有促使 層流厚度增加的趨勢，如圖 4 所示。而在固定邊鞘流體的流量，逐漸降低中央流體流 量的情況下，層流厚度則有減小的趨勢。

(a) (b) (c)

(a) (b) (c)

圖4 操控邊鞘流體對中央流體的影響情形，當固定中央流體流量為 0.5 mL/min 時，遞 增邊鞘流體的流量將具有減少層流厚度的趨勢：(a)~(c)分別為邊鞘流體流量在 2.0 mL/min、3.0 mL/min 與 4.0 mL/min 時的情形 (比例尺為 200 μm)

透過所設計的PMMA 微流體晶片可以穩定的生成層流，並藉著操控兩流體的流量 可形成不同的厚度，為進一步得知液體流量與層流厚度的生成關係，實驗中分別調整 邊鞘流體與中央流體的流量，以各別觀察對層流形成的影響情形，其實驗結果數據整 理如表1。

表1 45°角 PMMA 晶片中層流生成結果數據表 Hydrodynamic focusing Laminar flow

Flow direction Flow direction

STPP flow rate(mL/min) 0.7 0.5 0.3 0.1 2 53.46 48.69 41.90 35.71 3 46.79 44.53 39.48 32.42 4 43.93 38.13 35.36 27.62

Chitosan flow rate(mL/min)

Diameter of laminar flow(µm)

(4) PMMA 晶片製備幾丁聚醣纖維絲結果

當幾丁聚醣溶液形成層流的同時，幾丁聚醣液體層流持續向前推進下，交聯後的 幾丁聚醣纖維絲也形成於流道中，並由出口端排出到裝有三聚磷酸鈉溶液的承接載台 裡，進一步促使交聯反應更完全並保存。透過所設計的圓弧流道觀察區可以觀察到幾 丁聚醣交聯後的情況，在水力聚焦造成層流的同時經交聯反應而定型出纖維狀，如圖 5 所示。

利用所設計的流道形狀，能在顯微鏡頭的移動軌域內觀察到層流的形成以及幾丁 聚醣纖維絲的生成，並在出口端觀察到纖維絲的管徑大小，如圖6 (a)所示。由圖 6 (b)，

可發現於承接載台裡的幾丁聚醣纖維呈現相同管徑的纖維絲形態，由此可證明了透過 微流體晶片操控可製備出均一管徑的幾丁聚醣纖維絲，並在不同流量的操控下，可製 備出不同管徑的幾丁聚醣纖維絲。

(a) (b)

(a) (b)

圖5 圓弧流道區的幾丁聚醣纖維絲，在大尺寸的圓弧流道區能觀察到幾丁聚醣纖維絲 的長條圓柱型態 (比例尺為500 μm)

(a) (b)

(a) (b)

圖6 出口端與承接載台裡的幾丁聚醣纖維絲：(a) 於出口端處，幾丁聚醣纖維絲皆已 定形，(b) 承接載台裡的幾丁聚醣纖維絲(比例尺為500 μm)

進一步觀察承接載台裡的纖維絲，不同流量所生成的不同管徑幾丁聚醣纖維絲，

外觀形態上大部份能保持直線狀，部分呈現彎曲則是因為在流道中或在出口端處纖維 絲相互碰撞所造成的，所收集的幾丁聚醣纖維絲如圖 7 所示，進一步可以發現幾丁聚 醣纖維絲在固定流量條件的操控下能呈現均一管徑。

幾丁聚醣纖維絲呈半透明狀且略帶淡褐色，其顏色隨管徑的增大而加深，藉由纖 維絲的彎曲面可觀察到纖維絲的管徑大小，發現介於50~200 µm 之間，經由染色後能 更清楚的觀察到管徑的尺寸。進一步透過SEM 觀察，如圖 8 所示，發現幾丁聚醣纖維 絲表面略為粗糙狀，此一特點對於應用在細胞培養上，將能增加細胞貼附幾丁聚醣纖 維絲的效果。

圖7 承接載台裡所收集的纖維絲：(a)~(b) 管徑小於100 μm (比例尺為50 μm)，(c)~(d) 管徑小於200 μm (比例尺為100 μm與200 μm)

(a) (b)

(c) (d)

(a) (b)

(c) (d)

(a) (b)

(a) (b)

圖8 幾丁聚醣纖維絲之SEM圖：(a) 放大500倍視野下 (比例尺為200 μm)，(b) 放大1500 倍視野下 (比例尺為50 μm)，PMMA晶片所製備之幾丁聚醣纖維絲，外型上較為筆直，

藉由觀察冷凍乾燥造成之冰晶分佈，顯示出纖維絲表面略為粗糙 (放大1500倍，比例 尺為50 μm)

(5) 幾丁聚醣纖維絲與纖維母細胞培養結果

將纖維母細胞與幾丁聚醣纖維絲共同培養24 小時後，發現細胞能成功附著於纖維 絲上，如圖 9(a)所示，細胞貼附於纖維絲的表面與側面，並有活化生長的跡象，而以 約 100 µm 管徑的纖維絲進行培養後，能更明顯觀察到細胞的生長分佈情形，貼附的 細胞數目也較多，如圖 9 (b)所示，細胞開始有增生的形象。細胞培養 48 小時後，細 胞數目明顯增加，並佈滿纖維絲表面，顯示幾丁聚醣纖維絲能適合細胞的貼附與增生，

如圖10(a)所示，與纖維絲周圍區域相比較，細胞僅於纖維絲上能大量的生長，且伸展 方向與纖維絲的中軸方向一致，顯示對於細胞引導生長方向是具有作用的，如圖10(b) 所示。在培養72 小時之後，發現細胞數目持續增加，並能將幾丁聚醣纖維絲完整的包 覆起來，由此發現幾丁聚醣纖維絲對於細胞而言是無毒性且細胞相容性高，適合細胞 的貼附生長。如圖11 所示，細胞在纖維絲上能活化生長，並藉由細胞分裂將纖維絲包 覆起來，相較周圍區域，細胞局部生長的情形，表示幾丁聚醣纖維絲營造的環境有助 於細胞的生長；再從細胞的伸展方向觀察發現，幾丁聚醣纖維絲具有引導細胞生長方 向的可能性。

(a) (b)

(a) (b)

圖9 培養 24 小時後：(a) 細胞能成功附著於幾丁聚醣纖維絲上，並在表面與側面貼附 生長，(b) 以約 100 μm 管徑的纖維絲進行細胞培養，能觀察到較多的細胞貼附在表面 上 (比例尺為 100 μm)

圖10 培養48小時後：(a) 細胞於幾丁聚醣纖維絲上能具有增生現象，進行細胞分裂後 逐漸佈滿纖維絲表面，(b) 能清楚觀察到細胞在纖維絲上呈現排列一致的形態 (比例尺 為100 μm)

圖11 培養72小時後：細胞表現出大量增殖現象，在細胞分裂後能沿幾丁聚醣纖維絲表 面而將其完整的包覆起來，且出現相互堆疊的現象，表示細胞數目增生甚多，證明了 幾丁聚醣纖維絲具有應用在組織工程的可行性 (比例尺為100 μm)

第二部份

(1) 細胞共同培養裝置-毛細作用微鑄模設計與製作

本研究所設計之光罩是針對毛細作用微鑄模所設計，如圖12 所示。其中設計一的

(a) (b)

(a) (b)

圖12 毛細作用微鑄模之光罩

圖13 厚膜光阻SU-8母模製做流程圖最後應過清洗與吹乾後，即完成了SU-8 母模製 作如圖14所示。

(2) 細胞收集計數、培養與選用

本研究對於平面生長細胞的收集方法是採用蛋白酶分解法(Proteolytic enzymes)。

原理是將細胞和管壁之間的附著蛋白分解，使細胞脫離培養皿表面；而所使用的酵素 是胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)，其富含的 serine protease 可裂解 arginine and lysine 的 carboxyl group，故使用時除了令細胞脫離培養皿表面外，也會對細胞表面的其他蛋 白產生攻擊，使得細胞受損或崩解，所以處理時間不能過久。

在細胞計數方面，本實驗採用Neubauer 血球計算盤計數方式，以計算細胞濃度。

血球計算盤上刻有多條正交的刻畫痕，如圖15，共有九個 1 mm²的大方格，位於四個 角落的大方格內，刻畫了 4×4 共 16 個小方格；而位於中間的大方格內刻畫了 16×16 共256 個小方格，計數方式即是利用這五大方格來計算細胞濃度。在 Neubauer 血球計 算盤的構造上，其位於刻畫痕平台外邊有兩個高起的突樑，當蓋上蓋玻片後，玻片與 突樑的空隙為0.1 mm，而上述的大方格邊長為 1 mm，所以每一大方格容積為 0.1 mm³ 或0.1 μL。

圖15 Neubauer血球計數盤

實驗採用的細胞種類有老鼠心肌細胞、人類子宮頸癌細胞、老鼠動脈內皮細胞、

老鼠平滑肌細胞，而細胞的培養環境必須放置於37°C恆溫無菌培養箱中維持生長，並 且通以5%的CO2 氣體維持培養基的酸鹼值於7.2~7.4範圍，以Dulbecco`s modified Eagle`s medium 培養基提供維持細胞的生長與活性所需的養分，培養基添加了10%胎 牛血清(Heat-inactivated fetal bovine serum，FBS)、10 unit/mL盤尼西林(Penicillin)及1.5 g/L碳酸氫鈉(Sodium Bicarbonate)。

胞間距測試實驗中，發現以500　μm 與 500　μm 以上的間距進行實驗之成功機率（無 兩種細胞混養的機率）最高，約為 70%，而在兩種細胞分離的間距小於 500 μm 時，

其成功的機率已經小於 10%，故 500 μm 的分離細胞間距，為本實驗所建立的細胞共 同培養裝置之最小距離極限。

(a)

(b) (c)

圖16 內皮細胞與平滑肌細胞以不同的間距分離且共同培養於同一晶片上的結果，(a) 細胞濃度為3000 cells/

μ

μ

μ

μ

μ

μ

μ

ECs SMCs

ECs SMCs

ECs SMCs

胞與平滑肌細胞在共同培養後，是否存在誘導作用，故本實驗設計了一組在單邊 channel上只培養單一種細胞的實驗，以此作為對照驗證的裝置。

(a) (b)

圖17 內皮細胞於裝置中的單邊進行培養12小時後，再移除PDMS模，在沒有受到流 體剪應力的環境下，使其細胞在無阻隔物環境下進行共同培養之不同時間的結果圖：

(a)0小時、(b)12小時，比例尺為200

μ

(a) (b)

圖18 平滑肌細胞於裝置中的單邊進行培養12小時後，再移除PDMS模，在沒有受到 流體剪應力的環境下，使其細胞在無阻隔物環境下進行共同培養之不同時間的結果 圖：(a)0小時、(b)12小時，比例尺為200　

μ

ECs ECs

SMCs SMCs

(a) (b)

圖19 內皮細胞與平滑肌細胞以500　

μ

μ

3.6 結論

本研究於第一部分成功地將微流體晶片應用於幾丁聚醣纖維絲的製備上，並進一 步透過細胞培養實驗證實具有應用在組織工程上的可行性。在微流體晶片的設計與製 備上，非垂直角之流道設計能有效的穩定生成層流，在PMMA 晶片上成功製備出幾丁 聚醣纖維絲，發展出微流體晶片的新式應用方向。將所製得之幾丁聚醣纖維絲進行細 胞共同培養實驗，經實驗後證明幾丁聚醣纖維絲適合細胞的貼附與增生，具有應用在 組織工程上的可行性。將研究結論歸納三點如下：

1. 在晶片製程比較上，應用雷射雕刻法於製備微流道晶片，能有效縮短晶片製作的 流程，但在精密度上略顯不足，灌注成形法則能提供更微小的流道結構與精密度。

2. 在以 45°角流道的 PMMA 晶片進行實驗上，發現邊鞘流體流量的遞增與中央流體 流量的遞降同樣具有降低層流厚度的趨勢，經統計發現流量的變化與層流厚度生 成上具有線性關係，在流量操控下所得之層流厚度為30~50 μm，所製備之幾丁聚 醣纖維絲的管徑則介於50~200 μm 之間。

3. PMMA 晶片所製備的纖維絲管徑較粗以及外形較筆直，且細胞能成功培養於表面 上；而小鼠纖維母細胞更能貼附於纖維絲上進行增生並佈滿表面，由此初步證明 出利用微流體晶片所製備之幾丁聚醣纖維絲具有應用在組織工程上的可行性。

而第二部份也已經成功建立新型的平面式細胞共同培養機制，並應用於內皮細胞

ECs SMCs ECs SMCs

3.7 建議

將本研究所得結論，提出實驗方法上的改良建議與未來研究方向如下：

1. 在應用雷射雕刻法製備微流體晶片時，可評估選用其他基材，以降低製作過程中 因基材性質造成的流道缺損，並增加晶片的抗性，如抗酸、抗有機等，使晶片的 應用性更廣。

2. 在晶片製程過程中，可進一步研製更低成本的製備法，以提升拋棄式實驗室晶片 的研究價值，並改良晶片的封裝技術，修正密合晶片組件的方式，以及降低使用 氧電漿接合時需精確對應注入孔的難度。

3. 利用層流的生成現象於纖維絲的製備是本研究的重點，其構想可用為開發其他材 料製備成纖維絲的應用上。

4. 本研究成果提供了層流變化上的變化趨勢，未來可進一步改良流道設計以提升層 流生成操控上技術。

5. 在幾丁聚醣的應用層面上，可進一步探討不同的應用方向，期望本研究所發展之 技術不僅能在細胞研究與組織工程上有所助益，更能拓展出不同的應用領域。

6. SMCs & ECs進行共同培養細胞遷移之探討實驗中，因為500 m　 間距過大以致於 兩種細胞沒有誘導的效應，建議縮小細胞間距以觀察SMCs、ECs間的誘導效應。

四、 參考文獻

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[4] S. W. Rhee, A. M. Taylor, C. H. Tu, D. H. Cribbs, C. W. Cotman and N. L. Jeon,

“Pattern cell culture inside microfluidic devices,” Lab on a Chip, 5, 102, 2005.

[5] K. S. Rhode, T. Lambrou, D. J. Hawkes and A. M. Seifalian, “Novel approaches to the measurement of arterial blood flow from dynamic digital X-ray images,” IEEE Transactions on Medical Imaging, 24, 500, 2005.

[8] M. M. Mazanet and C. C. W. Hughes, “B7-H1 is expressed by human endothelial cells and suppresses T cell cytokine synthesis,” Journal of Immunology, 169, 3581, 2002.

[9] C. F. Dewey Jr., S. R. Bussolari, M. A. Gimbrone Jr. and P. F. Davies, “The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress,” Journal of Biomechanical Engineering, 103, 177, 1981.

[10] R. M. Nerem, M. J. Levesque and J. F. Cornhill, “Vascular endothelial morphology as an indicator of blood flow,” Journal of Biomechanical Engineering, 103, 172, 1981.

[11] N. Resnick and M. A. Gimbrone, “Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene-expression,” FASEB Journal, 9, 874-882, 1995.

[12] E. V. Barakat, P. A. Leaver, Pappone and P. F. Davies, “A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells,” Circulation Research, 85, 820, 1999.

[13] G. Garcia-Cardena, J. Comander, K. R. Anderson, B. R. Blackman and M. A.

Gimbrone, “Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype,” Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 98, 4478, 2001.

五、計畫結果自評

本實驗室應用微流體平台於共生細胞交互作用及神經細胞生長之研究已獲得初步 之成果。並完成以下進度並符合查核表:

第一部份

1. PMMA微流體晶片

1.1 PMMA晶片製程結果(已完成)

1.2 PMMA晶片層流生成之現象(已完成)

1.3 PMMA晶片中流量與層流厚度生成之關係(已完成) 2. 幾丁聚醣纖維絲之生成與纖維母細胞培養結果

2.1 PMMA晶片製備幾丁聚醣纖維絲結果(已完成) 2.2 幾丁聚醣纖維絲與纖維母細胞培養結果(已完成) 第二部份

1. 細胞共同培養裝置-毛細作用微鑄模設計與製作(已完成) 2. 細胞收集計數、培養與選用(已完成)

3. 兩種細胞(SMCs & ECs)分離培養的間距與最佳濃度之探討(已完成)

查核表:

預定完成時間 預計完成進度敘述

98/01 1. PMMA微流晶片製作方法

2. 探討流體生成現象與找出最佳化條件

3. 細胞共同培養裝置-毛細作用微鑄模設計與製作 4. 細胞選用、收集計數與繼代培養

98/07 1. 幾丁聚醣纖維絲之生成與培養纖維母細胞

2. 兩種細胞(SMCs & ECs)分離培養的間距與最佳細胞濃度之 探討

3. 單一種細胞(SMCs / ECs)進行培養後細胞遷移之探討 4. 兩種細胞(SMCs & ECs)進行共同培養後細胞遷移之探討

已發表相關研究成果(SCI論文共6篇，研討會論文共6篇) SCI論文

1. K.-S. Huang, T.-H. Lai and Y.-C. Lin*, “Manipulating the Generation of Ca-alginate Microspheres using Microfluidic Channels-as a Carrier of Gold Nanoparticles,” Lab on a Chip, 6, 954, 2006. (SCI I.F. 5.265)

2. K.-S. Huang, T.-H. Lai, Y.-C. Lin*, “Using a Microfluidic Chip and Internal Gelation Reaction For Monodisperse Calcium Alginate Microparticles Generation,” Frontiers in Bioscience, 12, 3061, 2007. (SCI I.F. 2.771)

3. C.-H. Yang, K.-S. Huang, P.-W. Lin, Y.-C. Lin*, “Using a Cross-Flow Microfluidic Chip and External Crosslinking Reaction for Monodisperse Tpp-Chitosan Microparticles,” Sensors and Actuators B: Chemical, 124, 510, 2007. (SCI. I.F. 2.331) 4. K.-.S. Huang, M.-K. Liu, C.-H. Wu, Y.-T. Yen, Y.-C. Lin*, “Calcium Alginate

Microcapsules Generation on a Microfluidic System Fabricated Using the Optical Disc Process,” Journal of Micromechanics and Microengineering, 17, 1428, 2007. (SCI. I.F.

2.321)

5. C.-H. Yeh, Y.-C. Lin*, “Using a Cross-Flow Microfluidic Chip for Monodisperse UV-Photopolymerized Microparticles,” Microfluidics and Nanofluidics, 6(2), pp.

277-283, 2009.

6. C.-H. Yeh, Q. Z., S.-J. Lee, Y.-C. Lin*, 2009, “Using a T-junction Microfluidic Chip for Monodisperse Calcium Alginate Microparticles and Encapsulation of Nanoparticles”, Sensors & Actuators: A. Physical, in press.

2. Yi-Chi Huang, Yi-Hsien Huang, Keng-Shiang Huang, Li-Wha Wu, Yu-Cheng Lin*, “A new method for cell co-culture using micro-molding in capillaries technology: study of cell transmigration,” The 11th International Symposium on Micro Total Analysis System, October 7-11, 2007, Paris, France.

3. C. H. Yeh, Q. L. Zhao and Y.C. Lin, “Using a Novel Method for Generating the UV-Crosslinking Microparticles by Sheath Focusing T-Junction Microfluidic Chip,” The Asia-Pacific Conference of Transducers and Micro-Nano Technology (APCOT 2008), June, 22-25, 2008, Taiwan.

4. P. W. Lin and Y. C. Lin, “Application of Microfluidic System to Construct Cross-linked Chitosan Microfibers In pmma Chip,” The Asia-Pacific Conference of Transducers and Micro-Nano Technology (APCOT 2008), June, 22-25, 2008, Taiwan.

5. S. H. Tsai, Y. H. Huang, C. F. Lin, L. W. Wu and Y. C. Lin, “Using Co-Culture System for Cell Transmigration by Micro-Molding in Capillaries Technology,” The Asia-Pacific Conference of Transducers and Micro-Nano Technology (APCOT 2008), June, 22-25, 2008, Taiwan.

6. C. H. Chen, C. H. Yeh, P. W. Lin, S. J. Lee and Y. C. Lin, “Manipulating T-Junction Microfluidic Chip for External and Internal Gelation Reaction to Generate the Uniform Calcium Alginate Microspheres,” The Asia-Pacific Conference of Transducers and Micro-Nano Technology (APCOT 2008), June, 22-25, 2008, Taiwan.

六、可供推廣之研發成果資料表

■ 可申請專利 ■ 可技術移轉 日期：98 年 5 月 31 日

國科會補助計畫

計畫名稱：應用微流體平台於共生細胞交互作用及神經細胞生長 之研究計畫

主持人：林裕城

計畫編號：97-2221-E-006-222-MY3 學門領域：生醫材料

技術/創作名稱 應用微流體平台於共生細胞交互作用及神經細胞生長之研究計畫 發明人/創作人 林裕城

中文：

本研究計畫分別探討製備微纖維和細胞共同培養的方法，利 用微機電製程技術來解決生物組織工程上的瓶頸。

技術說明

英文：

This proposal discusses not only the fabrication of fiber but also the cell co-culture, utilizing the MEMS technique to solve the bottleneck in the tissue engineering.

可利用之產業及可開 發之產品

z 應用於組織工程的支架

z 建立完整的細胞遷移機制

技術特點

z 降低成本及縮短製程時間

z 微纖維絲材料性質佳與良好的生物相容性

z 突破傳統技術於同一觀測面積下探討兩細胞間的相互作用

推廣及運用的價值

z 培養神經細胞在微纖維絲上應用於組織工程接合修復斷裂神 經

z 模擬體內血管中兩細胞間相互誘導與分化作用並加以分析