行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

Disialosyl Galactosylgloboside 的全合成：一種與腎細胞 癌有關的醣質體抗原(1/2)

計畫類別： 個別型計畫

計畫編號： NSC91-2119-M-038-001-

執行期間： 91 年 12 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 臺北醫學大學生藥技術學系

計畫主持人： 蔡祐輔

計畫參與人員： 許佳恆；藍文豪

報告類型： 精簡報告

處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 92 年 6 月 6 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

Disialosyl Galactosylgloboside 的全合成：一種與腎細胞癌有關的醣質體抗原(1/2)

計畫類別： 個別型計畫

計畫編號： NSC 91－2119－M－038－001

執行期間： 91 年 12 月 01 日 至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 臺北醫學大學生藥技術學系

計畫主持人： 蔡祐輔

計畫參與人： 藍文豪

報告類型： 精簡報告

處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 92 年 5 月 29 日

緒言

表現在細胞表面的醣質體，在分子間的辨識過程中扮演者非常重要的角 色。例如：細菌與病毒感染、發炎時細胞的黏附、癌細胞的轉移、免疫反應、細 胞分裂與動物授精等，都與細胞表面的醣質體有關。¹

惡性腫瘤侵害人體，依據 Dukes 分類，²可分為四個步驟。步驟一，腫瘤細 胞停留在粘膜層(mucosal layer)；步驟二，腫瘤細胞開始侵害肌肉層(muscle layer)，但還沒發生轉移；步驟三，在某些區域淋巴結(lymph nodes)出現腫瘤轉 移；步驟四，腫瘤細胞轉移至其他器官。而「轉移」，對癌症而言是最大的問題。

若沒有轉移的困擾，則大部份癌的症皆可經由手術、放射治療法(radiation)和化 學治療法(chemotherapy)治癒。

早在三十多年前，Hakomori³與 Mora⁴便分別觀察到，在癌細胞形成時，其 細胞表面的醣脂質(glycosphingolipid, GSL)有異常的改變。其後，在文獻研究報 告也陸續提出，⁵ 基本上在所有癌細胞的細胞表面皆會發生異常的醣化反應 (glycosylation)形成醣蛋白(glycoprotein)或/及醣脂質(glycolipid)；其細胞表面的醣 (carbohydrate)，無論在量、結構或種類皆與正常細胞有很明顯的差異。例如，表 現在人類黑色素瘤(melanoma)及神經母細胞瘤(neuroblastoma)的 GM3、GM2、

GD3 、GD2 醣脂質；及表現在人類小細胞肺癌(small-cell lung carcinoma)的岩藻 醣化 GM1(fucosyl GM1)醣脂質。^{6, 7}

Hakomori ⁸也指出，細胞表面的醣抗原及 GSL 分別在細胞黏附(adhesion) 過程與穿透膜信號傳遞的控制，皆扮演重要的角色。在文獻上，也有一些研究報 告來支持此論點。例如：第一，在個體形成(ontogenesis)及腫瘤形成(oncogenesis) 過程中，在定量及定性上皆可測得 GSL 有明顯的改變。⁹第二，細胞－細胞的相 互作用，可以被特別的 GSL、與此 GSL 相關的寡醣(oligosaccharide)或與此 GSL 相關的醣共軛體(glycoconjugate)抑制。¹⁰最後，與醣結合的 lectins¹¹或 selectins¹² 蛋白質，也會在細胞表面上表現出。在前述中，我們曾提及「轉移」對癌症而言 是最大的問題。而癌細胞的轉移，便是與細胞－細胞的相互作用有關。

Hakomori 也進一步提到，¹³傳達細胞黏附與四個分子系統有關。第一，細

胞的接觸，即是由侷限在相鄰細胞表面上的 GSL 嵌片(patch)先相互作用，隨後 再協同 與 integrin 或免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)等的黏附蛋白(adhesion protein)作用。第二，細胞上其它醣質體(醣脂質或醣蛋白)再與特別的 lectins 或 selectins 作用。第三，黏附蛋白(如 fibronectin) 再與他們的 integrin 受體作用。第 四，在免疫球蛋白家族裡的黏附蛋白再彼此互相作用，或與 integrin 作用。

由前幾段描述可知，醣質體在癌細胞形成及細胞－細胞相互作用的過程皆 扮演非常重要的角色。因此，這些與癌細胞有關的醣質體抗原，已被視為發展成 治療癌症的新策略。^{13, 14}

由 Saitos 的研究報告 ¹⁵指出，在腎細胞癌的細胞表面上，較長鏈的醣脂質 有明顯的增加，此顯著的表現與腎細胞癌的轉移有密切的關聯。而 Hakomori 的 研究報告更明切指出此唯一醣脂質化合物 disialosyl galactosylgloboside(DSGG)，

16其組成及結構如圖一所示。

O O OH

HO O

HO O OH O OH O

OH O

OH O

HO OH

O HO

CO

H OH

OH

O AcHN

HO

O HO

CO

H HO OH

AcHN HO

O HO OH

O HO O C

H

OH

NHCOC

H

AcHN HO

圖 一 ：Disalosyl Galatosylgloboside (DSGG)的組成及結構

利用與癌細胞表面有關的醣質體抗原，可成為治療癌症的新策略—即免疫 療法(immunotherapy)與抗黏附療法(anti-adhesion therapy)。¹⁷ 由於生物體含有醣 脂質化合物 DSGG 的量非常少，無法從天然來源獲得足夠的量，進行各項生物 測試實驗；再者，目前文獻尚無有關合成醣脂質化合物 DSGG 的研究報告發表，

因此急需開發新合成途徑，有效製備大量的醣脂質化合物 DSGG。所以本計劃擬 以化學方法來製備大量的醣脂質化合物 DSGG，進而探討免疫療法與抗黏附療法

治療腎細胞癌的功效。

化合物 DSGG 是由二分子唾液酸(N-acetylneuraminic acid)、三分子半乳醣 (galactose)、一分子半乳醣乙醯胺(N-acetylgalactosamine)、一分子葡萄醣(glucose) 及鞘脂質(sphingolipid) 組成的七醣(heptasaccharide)醣脂質(glycolipid)化合物。綜 觀其整個分子結構(圖一)，本計畫將採用收斂合成(convergent synthesis)策略來給 予製備。有關醣脂質化合物 DSGG 的逆合成(retrosynthesis)分析，如圖式一所示。

DSGG

O AcO AcO

AcO OAc

AcHN

O O

AcHN O

SePh CO₂Me O

AcO AcO

AcO OAc

AcHN CO₂Me

4 4

+ + +

7 8

O AcO

CO₂Me AcO

AcO OAc

AcHN

HO O HO

O

SePh

1 2 3

+ O

O HO

O HO

O O O

OH O

HO OH

O CO₂H HO

OH

O AcHN

HO

O HO

CO2H

HO OH

AcHNHO

O O

HO O C₁₃H₂₇

HO NHCOC₁₇H₃₅ HO

AcHN OH OH

OH OH

HO

HO HO

1

2

3

O

O BnO O

AcO

CO2Me AcO OAc

AcHN AcO

O

+

AcHN

BnO O O HO O

HO

O O BnO BnO

OAc

OBn OBn

BnO BnO

BnO O HO

O O BnO

OBn OBn

BnO BnO OH

SPh SPh

HO C₁₃H₂₇ HO

NHCOC₁₇H₃₅

sphingolipid +

SPh

O SPh HO

BnO OO Ph

6 ^OAc

O TBSO

BnO OO Ph

I 5 OAc

OO Ph

﹝圖 式一﹞：醣脂質化合物 DSGG 的逆合成分析

醣脂質化合物 DSGG 的製備，預計由四大片斷(如圖式一中箭號 1、2、3 所指)進行醣甘化反應(glycosylation)得到。此四大片斷，分別為唾液酸與半乳醣

的二醣(disaccharide)衍生物 1、唾液酸與半乳醣乙醯胺的二醣衍生物 2、半乳醣 與乳醣的三醣(trisaccharide)衍生物 3 及鞘脂質。衍生物 1 的製備，預計由醣供體 (glycosyl donor)2－碘唾液酸(2-iodio-N-acetylneuraminic acid)衍生物 4 與醣受體 (glycosyl acceptor)1－乙醯基(acetyl group)半乳醣甘(1- acetyl galactoside)衍生物 6 進行醣甘化反應製得。衍生物 2 的合成，擬由醣供體 2－苯硫基唾液酸衍生物 4 與醣受體 1－苯硒半乳醣乙醯胺(1-phenylselenyl-N-acetylgalactosamine)衍生物 7 進行醣甘化反應製得。衍生物 3 的製備，將由醣供體 1－碘半乳醣(1-iodiogalactose) 衍生物 5 與醣受體 1－苯硫基乳醣(1-thiophenyllactose)衍生物 8 進行醣甘化反應 獲得。

有關醣脂質化合物 DSGG 的全合成工作，本計畫預計以二年時間完成。第 一年，將著重於要用來合成醣脂質化合物 DSGG 之建構單元(building block)(單醣 衍生物 4、5、6、7 及二醣衍生物 8)的製備。第二年，將著重於各建構單元之醣 甘化反應的研究，並完成醣脂質化合物 DSGG 的全合成。

本計畫目前已完成建構單元化合物 4 的製備，並同時著手建構單元化合物 5、6、7 與 8 的合成。其進度與製備方法，如結果與討論所述。

結果與討論

唾液酸醣甘化供體 4 的合成

有關唾液酸 9 當做醣甘化供體(glycosyl donor)的製備方法，在文

獻上已有很多相關的報告發表。本研究擬採用以苯硫基為離去基

(leaving group)的唾液酸醣甘化供體 4，如圖式二所示。

9

MeOH

TFA, rt, 40h 100%

10

Ac₂O

Pyr, rt, 24h 96%

11

PhSH

BF_3.Et₂O, CH₂Cl₂ rt, 24h

92% 4

O HO AcHN

OH HO

HO OH

CO₂H O

HO AcHN

OH HO

HO OH

CO₂Me

O AcO AcHN

OAc AcO

AcO OAc

CO₂Me O

AcO AcHN AcO

AcO OAc

CO2Me SPh

﹝圖式二﹞唾液酸醣甘化供體 4 的合成

以三氟醋酸(trifluoroacetic acid, TFA)為催化劑，唾液酸 9 與無水甲醇在室溫 下進行酯化反應(esterification)。反應 40 小時後，製得產率為 100%的甲基酯唾液 酸化合物 10。其氫核磁共振光譜在 3.77 有一隻單一態(singlet)吸收峰，此為甲 基酯基團之甲基氫核的化學位移。酯化反應也曾以 AG50W-X8(H⁺)、Amberlite IR120(H⁺)等酸性樹脂為催化劑，製備化合物 10，但產率只有 61%至 65%。

將化合物 10 溶於無水砒啶(pyridine)溶劑裏，與乙酸酐(acetic anhydride)在室 溫下進行氧–乙醯化反應(O-acetylation)。反應 24 小時後，減壓濃縮除去砒啶溶 劑，得到黃色固體粗產物。此粗產物以快速管柱色層(flash column chromatography) 分析純化，可得到產率為 96%無色固體的甲基酯多氧－乙醯化(per-O-acetylation) 唾液酸化合物 11。其氫核磁共振光譜在 1.89、 2.04、 2.06 與 2.15 有四隻單一 態吸收峰，此為乙醯基之甲基氫核的化學位移。

在無水二氯甲烷(dichloromethane)溶劑裏，三氟化硼乙醚酯(boron trifluoride etherate, BF3‧Et2O)路易士酸為催化劑，以硫酚取代化合物 11 之變旋異構性碳原 子(anomeric carbon atom)上的乙醯氧基(acetoxy group)。此反應混合物以飽和碳酸 鈉水溶液洗滌後，減壓濃縮除去二氯甲烷溶劑，得到黃色固體粗產物。此粗產物 以快速管柱色層(flash column chromatography)分析純化，可得到產率為 92%的無 色固體苯硫基唾液酸變旋異構物(anomer)混合物 4。由兩異構物混合物氫核磁共 振光譜之 H3e(異構物 2.83ppm, 異構物 2.64ppm)吸收峰的面積比，得知異 構物與異構物的比例為 1 / 2。而其氫核磁共振光譜在  7.30 ～ 7.50 為多重態 吸收峰，此為苯環的化學位移。

由起始物唾液酸 9 經三步反應，可製得總產率為 88%的無色固體苯硫基唾 液酸變旋異構物混合物 4。

醣供體 1－碘半乳醣衍生物 5 的合成

半乳醣衍生物 5 的製備（如圖式三），以半乳醣化合物 12 為起始物。將無 水甲醇加到已含有半乳醣化合物 12 與酸型式樹脂 Dowex 50 x 8 的反應瓶內，此 反應混合物在迴流狀態下反應 12 小時後，過濾移走樹脂，減壓濃縮除去甲醇，

便可製得產率為 96%的無色固體變旋異構物甲基半乳醣甘 13。¹⁸由兩異構物混 合物氫核磁共振光譜之甲基氫核吸收峰(異構物 3.39ppm, 異構物 3.30ppm) 的面積比，得知異構物與異構物的比例為 5 / 1。

甲基半乳醣甘 13 不再純化，逕自進行下一步反應。在冰浴下，迅速將對－

甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid, PTSA)加至含有甲基半乳醣甘 13 與 PhCH(OMe)2

的 acetonitrile 溶液裡，此反應混合物持續在室溫下反應 6 小時。反應粗產物經快 速管柱層析純化，可穫得產率為 94%白色固體混合物 14。¹⁹

混合物 14 與二丁基氧化錫(dibutyltin oxide, Bu2SnO)甲醇溶液，在迴流狀態 下先反應 2 小時，再減壓狀態下除去甲醇溶劑。所生成的產物，在依序加入無水 甲苯、碘化四丁基銨(tetrabutylammonium iodide, TBAI)與溴化? 基。此反應混合 物在迴流狀態下反應 12 小時後，生成的粗產物經快速管柱層析純化，可穫得產 率為 80%白色固體混合物 15。²⁰

O HO OH

HO HO

OH

O HO OH

HO HO

OMe MeOH

Dowex 50 x 8 [H⁺] reflux,12h

96%

PhCH(OMe)₂

PTSA, CH₃CN rt, 6h

94%

HO O HO

OMe OO

Ph

1) Bu₂SnO, MeOH, reflux

2) BnBr, TBAI, Toluene, reflux, 80%

HO O BnO

OMe OO

Ph

TBSCl

Imd, CH₂Cl₂

TBSO O BnO

OMe OO

Ph

1) ZnCl₂, Ac₂O/AcOH

2) TMSI, CH2Cl2 O TBSO

BnO OO Ph

I

12 13

14 15

5 16

﹝圖式三﹞1－碘半乳醣衍生物 5 的合成

1－苯硒半乳醣乙醯胺衍生物 7 的合成

半乳醣乙醯胺衍生物 7 的製備（如圖式四），以 per-O-acetyl galactal(GAN-1) 為起始物。將買來的 per-O-acetyl galactal 化合物 GAN-1 先給予乾燥，再依序加 入 NaN3、PhSeSePh 與二氯甲烷(dichloro methane, CH2Cl2)溶劑。此二氯甲烷溶液

置於冰浴中，迅速加入 PhI(OAc)2，而後將此反應混合物回溫至室溫下反應 48 小時，生成的粗產物經快速管柱層析純化，可穫得產率為 80%白色固體混合物 18。²¹

GAN-1 O OAc AcO

AcO

PhI(OAc)₂, NaN₃

PhSeSePh, CH2Cl2 rt, 48h

70% 18

O OAc AcO

N₃ AcO

SePh

CH3ONa

CH₃OH, rt

19 O OH HO

N₃ HO

SePh

Me₂C(OMe)₂

PTSA, Acetone rt, 6hr

7 O O

N₃ SePh O OH

﹝圖式四﹞1－苯硒半乳醣乙醯胺衍生物 7 的合成

參考文獻

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