膠體高度 Native PAGE膠體製作 (7)輔仁大學生命科學系 3

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輔仁大學生命科學系

生物化學實驗

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植物澱粉酶酵素活性膠體染色 (In gel activity stain)

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目的：以緩衝液粗萃取植物根莖及葉片的澱粉酶 (amylase)，並利用酵素活性膠體染色

(In gel activity stain)的方式，觀察澱粉 酶的酵素活性。

植物澱粉酶酵素活性膠體染色

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•原理：

酵素活性分析為酵素或蛋白質純化過程中不可或缺的檢驗方式，酵素活性膠體染色為酵素活性分析中，專一性最好的一種方式。藉由原態膠體電泳，在不失活 (denature) 酵素的情況下，分離目標酵素與其他蛋白質，而後續的活性染色，則可以辨識酵素於電泳膠體中的確切位置，若配合標誌蛋白質可約略估計酵素分子量。使用酵素活性膠體染色，還可呈現生物中各種催化能力相同但結構不同的酵素活性。本實驗將比較植物塊莖或塊根、葉片與人類唾液澱粉酶的酵素活性染色電泳圖譜。

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1. 製備8% Polyacrylamide分離層膠體 (separating gel) 。

10 ml 總體積

10 μl TEMED

100 μl 10% ammonium persulfate

3.8 ml 30% acrylamide

(使用前須於室溫去除氣泡至少15分鐘)

2.7 ml 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8

3.39 ml 二次水

Native PAGE膠體製作

8% polyacrylamide

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2. 自玻璃邊緣注入8%分離膠體(separating gel) ，至與鑄膠夾上之綠色夾片

上緣等高^。 ^膠體高度

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3. 再注入些許二次水或酒精，使膠體表面平整，

大約30分鐘後膠體凝固，

將二次水或酒精去除。

酒精

Separating gel

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4. 製備4% Polyacrylamide焦集層膠體 (stacking gel) 。

10 ml 總體積

7 μl TEMED

70 μl 10% ammonium persulfate

1.3 ml 30% acrylamide

(使用前須於室溫去除氣泡至少15分鐘)

2.5 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8

6.123 ml 二次水

4% polyacrylamide

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5. 注入焦集膠體(stacking gel)至玻璃最上緣，並將尺梳傾斜10度插入。

在焦集膠體凝固時，

焦集膠體會縮短，此時可再補入適量的焦集膠體溶液。

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6. 30分鐘後焦集膠體凝固^，製膠完成。

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萃取植物根莖之澱粉酶

7. 取新鮮馬鈴薯及地瓜，

洗淨削皮取果肉後製簽稱重，馬鈴薯100克，

地瓜50克。

馬鈴薯

地瓜

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8. 加入100 ml冰冷緩衝液B，

以果汁機在4℃下均質化，

高速攪拌1分鐘，靜止冷卻 1分鐘，重複3次。此步驟是為了避免在均質化過程中溫度升高導致澱粉酶失活。

緩衝液B：

50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM β-mercaptoenthanol,

1% poly(vinylpolypyrrolidone), PVPP

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9. 均質液以紗布過濾。

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10. 取濾液1 ml以eppendorf離心機 (rotor 10183) 13000 rpm，

離心10分鐘。

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11. 收集上清液即得馬鈴薯粗萃液及地瓜粗萃液。

馬鈴薯粗萃液

地瓜粗萃液

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萃取植物葉片之澱粉酶

12. 取新鮮地瓜葉一片(約2克)，

以剪刀剪碎後放入50 ml離心管中，加入少量液態氮，以研磨棒磨碎。

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13. 加入4 ml冰冷緩衝液A，

在冰上繼續以研磨棒研磨

五分鐘，至已無地瓜葉碎片。

緩衝液A：

50 mM Tris-HCl, pH 7.4

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14. 取1ml 粗萃液以eppendorf 離心機(rotor 10183) 13000 rpm ，離心10分鐘。

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15. 收集上清液即得地瓜葉粗萃取液。

地瓜葉粗萃液

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植物澱粉酶活性膠體染色

16. 將粗萃液與5X樣品緩衝液以 4:1 (V/V)混合。

5X樣品緩衝液：

5X電泳緩衝液加入10% glycerol 及0.5%bromophenol blue

5X電泳緩衝液, pH 8.3：

Tris base 75.75 g，glycine 360 g，

加二次水至5 L

L: 地瓜葉 P: 馬鈴薯 SP: 地瓜 Sa: 口水

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17. 將樣本如右圖所示加入膠體中^。

地瓜葉粗萃液10 ul

馬鈴薯粗萃液10 ul 地瓜粗萃液10 ul

口水10 ul

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18. 進行膠體電泳分析，樣本以100 V在焦集膠體進行電泳；以200 V在分離膠體進行電泳。

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19. 電泳結束後將膠片取下置於盒中，加入2.4%澱粉緩衝液 (蓋過膠體) ^，放置於37℃恆溫培養箱中作用1小時。

2.4﹪澱粉緩衝液：

2.4 g 可溶性澱粉溶於100 ml 0.05 M Na-acetate緩衝液

0.05 M Na-acetate , pH 5.5緩衝液：

0.05 M sodium acetate加acetic acid 調整為pH 5.5

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20. 將澱粉緩衝液倒掉，

以二次水清洗3次，

每次三分鐘。

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21. 加入1% 碘液呈色。

1%碘液：

取1 g碘( I₂) 及2 g碘化鉀( KI ) ，溶解於300 ml二次水中，避光保存於室溫。

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22. 待反白色帶與背景產生明顯對比後，將碘液倒掉，以二次水清洗一次。

以掃描器將膠片掃描存檔。為保護掃瞄器，掃瞄器應先放入投影片再放入膠體。

L P SP Sa

Each lane 10 ml

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L P SP Sa

Each lane 10 ml

23. 由於澱粉酶可分解膠體中之澱粉，因此酵素所在位置，

在碘液與澱粉所形成的藍色背景中，會呈現透明色帶。

生物樣品中，含有多種澱粉酶。右圖箭頭所示為大小不同之澱粉酶。

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生物化學實驗

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膠體高度 Native PAGE膠體製作 (7)輔 仁 大 學 生 命 科 學 系 3

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