【11】證書號數：I485253
【45】公告日： 中華民國 104 (2015) 年 05 月 21 日
【51】Int. Cl.： C12Q1/68 (2006.01) G01N33/574 (2006.01)
發明 全 10 頁 【54】名 稱：用以偵測循環性癌幹細胞的方法與套組
METHODS AND KITS FOR DETECTING CIRCULATING CANCER STEM CELLS
【21】申請案號：101141693 【22】申請日： 中華民國 101 (2012) 年 11 月 08 日 【11】公開編號：201319258 【43】公開日期： 中華民國 102 (2013) 年 05 月 16 日 【30】優 先 權： 2011/11/08 中華民國 100140770
【72】發 明 人： 何中良 (TW) HO, CHUNG LIANG
【71】申 請 人： 國立成功大學 NATIONAL CHENG KUNG UNIVERSITY 臺南市東區大學路 1 號 【74】代 理 人： 何美瑩 【56】參考文獻： TW 200708623A WO 2010/126452A1 US 5959097A 黃宣榜，利用類似腫瘤胚基因之即時定量反轉錄聚合酶反應以偵測血液中之肝癌細 胞，國立成功大學醫學檢驗生物技術學系碩士論文，2008 年
Wang YC, et al. Lin-28B expression promotes transformation and invasion in human hepatocellular carcinoma, Carcinogenesis 2010, 31:1516-1522
Oishi N. et al. Novel therapeutic strategies for targeting liver cancer stem cells. Int J Biol Sci. 2011 Apr, 7(5):517-35. 摘要、第 524 頁左欄第 4 段、右欄第 1 段
Guo Y. et al. Identification and characterization of lin-28 homolog B (LIN28B) in human hepatocellular carcinoma. Gene. 2006, 384:51-61 全 審查人員：林佳慧 [57]申請專利範圍 1. 一種利用一癌幹細胞標記基因來偵測一個體是否帶有循環性癌幹細胞的方法，其中該癌 幹細胞標記基因為 Lin-28 同源物 B(LIN28B)基因或其變異型，且其序列與序列編號：6 所示序列具有至少 80%的核酸序列相似度，包含以下步驟：(a)由該個體取得一體液樣 本，其中該體液為血液；(b)由該體液樣本分離出複數個單核細胞；(c)利用一定量即時反 轉錄聚合酶連鎖反應式(RQ-PCR)方法來決定該些單核細胞中該癌幹細胞標記基因的表 現，其中該 RQ-PCR 使用一第一引子對，該第一引子對包含：如序列編號：3 所示之正 向引子以及一如序列編號：4 所示的反向引子；(d)由步驟(c)之分析所得到之該些單核細 胞內該癌幹細胞標記基因的表現量，來計算該癌幹細胞標記基因的一循環閾值(CtCSC 值)；(e)基於步驟(d)之結果，決定該些單核細胞內是否有該癌幹細胞標記基因的表現，
(f)基於步驟(e)之結果，決定該個體是否帶有循環性癌幹細胞，其中：該癌幹細胞標記基 因的表現表示取自該個體之該體液樣本含有循環性癌幹細胞；而缺乏該癌幹細胞標記基 因的表現表示取自該個體之該體液樣 本不含有循環性癌幹細胞。 2. 如請求項 1 所述之方法，其中該個體經診斷患有肝癌，且該方法更包含評估該個體的術 後預後，其中當該體液樣本帶有該循環性癌幹細胞時，表示該個體的術後預後較差；且 當該體液樣本不帶有該循環性癌幹細胞時，表示該個體的術後預後較佳。 3. 如請求項 2 所述之方法，其中該較佳的術後預後係指一無復發存活期大於等於 12 個 月，且該較差的術後預後係指一無復發存活期小於 12 個月。 4. 如請求項 1 所述之方法，其中該體液樣本係取自或衍生自該個體的周邊血。 5. 如請求項 1 所述之方法，其中該些單核細胞係利用密度梯度分離法而分離出來。 6. 如請求項 1 所述之方法，其中該 RQ-PCR 更使用一第一螢光標記探針，其序列如序列編 號：5 所示。 7. 如請求項 1 所述之方法，其中該 RQ-PCR 更使用一第二引子對，該第二引子對包含：如 序列編號：8 所示 之正向引子以及一如序列編號：9 所示的反向引子。 8. 如請求項 7 所述之方法，其中該 RQ-PCR 更使用一第二螢光標記探針，其序列如序列編 號：10 所示。 9. 如請求項 1 所述之方法，其中該個體經診斷患有肝癌，且該方法更包含：取得該癌幹細 胞表現基因的一拷貝數(CpCSC )；分析該些單核細胞內一管家基因的表現量，以得到該 管家基因的一拷貝數(CpHK )，其中該；根據方程式(1)計算該癌幹細胞標記基因相對於該 管家基因的一相對表現分數：相對表現分數=log(CpCSC /CpHK )方程式(1)；以及將該相對 表現分數與至少一預定門檻值相比較，其中：當該相對表現分數大於等於該預定門檻值 時，表示該個體的術後預後較差；以及當該相對表現分數小於該預定門檻值時，表示該 個體的術後預後較佳。 10. 如請求項 9 所述之方法，其中該管家基因為編碼 β-肌動蛋白或 3-磷酸甘油醛脫氫酶的一 基因。 11. 如請求項 10 所述之方法，其中該管家基因為該編碼 3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因，該預定 門檻值為-3，且該術後預後為疾病特定存活期。 圖式簡單說明 為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如 下：第 1 圖的照片為根據本發明一實驗例的西方墨點分析結果；第 2 圖為長條圖，闡明根據 第 1 圖之實驗例的邊緣細胞群大小；第 3 圖的照片呈現出根據第 1 圖之實驗例的腫瘤球體， 並以長條圖闡明腫瘤球體的數目；第 4 圖為根據本發明另一實驗例的西方墨點分析結 果；第 5 圖為長條圖，闡明根據第 4 圖之實驗例的邊緣細胞群大小；第 6 圖的照片呈現出根據第 4 圖之實驗例的腫瘤球體，並以長條圖闡明腫瘤球體的數目；第 7 圖為長條圖，闡明根據本發 明又一實驗例，本方法的偵測極限；第 8 圖為根據本發明一實驗例，LIN28 基因經 RQ-PCR 反應所得之標準曲線；第 9 圖闡明屬於不同實驗群組之 156 名個體的標準化 LIN28B 表現 量；第 10 圖闡明屬於不同實驗群組之 96 名肝癌患者的標準化 LIN28B 表現量；第 11 圖至第 15 圖為卡普蘭-梅爾存活折線圖，用以闡明在不同病患子群內，無復發存活期(RFS)與循環系 統中存有可表現 LIN28B 基因之癌細胞之間的關係；以及第 16 圖為一卡普蘭-梅爾存活折線 圖，用以闡明在不同病患子群內，疾病特定存活期(DSS)與 LIN28B 基因表現量之間的關係。 (2) 2492
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