中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/41354
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(2) 目錄 摘要 ...................................................................................................................................... i Abstract ................................................................................................................................ii 第一章. 前言 ..................................................................................................................... 1. 第二章. 文獻回顧 ............................................................................................................. 3. 第一節 NAFLD相關流行病學調查 ............................................................................ 3 第二節 非酒精性脂肪肝炎之文獻回顧 ..................................................................... 4 (一) 非酒精性脂肪肝炎之簡介 ............................................................................. 4 (二) 臨床上肝臟脂肪肝暨非酒精性脂肪肝的判定方法 ..................................... 4 (三) 非酒精性脂肪肝炎與飲食相關性 ................................................................. 5 (四) 非酒精性脂肪肝炎之代謝表徵與致病機轉假說 (two hits) ........................ 6 (五) 非酒精性脂肪肝炎與酒精性脂肪肝的病理及體內代謝差異比較 ........... 10 (六) NASH 動物模式介紹 .................................................................................. 12 第三節 菇類的功效性研究 ....................................................................................... 14 (一) 菇類對肝臟之研究 ....................................................................................... 14 第四節 毛木耳之文獻回顧 ....................................................................................... 16 (一) 菇類簡介 ....................................................................................................... 16 (二) 毛木耳之介紹 ............................................................................................... 16 (三) 毛木耳的營養價值 ....................................................................................... 19 (四) 毛木耳之成分分析及已知功能介紹 ........................................................... 21 1. 對於體內氧化壓力的影響 ........................................................................... 21 2. 降低膽固醇作用 ........................................................................................... 22 3. 抗發炎作用 ................................................................................................... 22 4. 調節宿主免疫反應作用 ............................................................................... 23 5. 血糖調節之研究 ........................................................................................... 23 6. 抗血栓研究 ................................................................................................... 24 7. 抗腫瘤研究 ................................................................................................... 24 8. 黑木耳與減重的關係 ................................................................................... 25 第三章. 研究動機及目的 ............................................................................................... 26. 第四章. 研究架構 ........................................................................................................... 28. 第五章. 材料與方法 ....................................................................................................... 29. 第一節 實驗設計 ....................................................................................................... 29 第二節 實驗材料 ....................................................................................................... 32 第三節 實驗方法 ....................................................................................................... 36 第四節 統計分析 ....................................................................................................... 54 第六章 結果 ..................................................................................................................... 55 第七章 討論 ..................................................................................................................... 64 I.
(3) 第八章 結論 ..................................................................................................................... 88 參考文獻 ......................................................................................................................... 119. II.
(4) 表目錄 表一 ALD 與 NASH的差異 .......................................................................................... 11 表二 NASH動物模式 ...................................................................................................... 13 表三 毛木耳與黑木耳差別 ............................................................................................. 18 表四 新鮮木耳成分分析 （100 克） ............................................................................ 19 表五 Laboratory Rodent Diet 5001 主要營養組成 ......................................................... 33 表六 高脂飲食配製方法及三大營養素比例 ................................................................. 34 表七 高脂飲食之三大營養素比例 ................................................................................. 35 表八 餵食實驗飼料飲食 8 週後對大鼠肝指標的影響 ................................................. 89 表九 餵食實驗飼料飲食 8 週後對大鼠血脂質的影響 ................................................. 90 表十 餵食實驗飼料飲食 8 週後對大鼠空腹葡萄糖、游離脂肪酸及脂質過氧化作用的 影響 ................................................................................................................................... 91 表十一 毛木耳萃取物一般成分分析 ............................................................................. 92 表十二 毛木耳萃取物中主成分 ..................................................................................... 93 表十三 毛木耳萃取物之抗氧化活性 ............................................................................. 94 表十四 毛木耳萃取物之可溶性纖維及不可溶性纖維含量 ..................................... 95 表十五 餵食實驗飼料飲食 12 週後對大鼠攝食量、體重、肝重、之影響 ............... 96 表十六 餵食實驗飼料 12 週後對大鼠肝功能指標之影響 ........................................... 97 表十七 餵食實驗飼料飲食 12 週後對大鼠血脂肪指標之影響 ................................... 98 表十八 餵食實驗飼料飲食 12 週後對大鼠血中餐前血糖、胰島素及HOMA-IR 指標 之影響 ............................................................................................................................... 99 表十九 餵食實驗飼料十二週後血漿中脂肪酸組成 ................................................... 100 表二十 餵食實驗飼料十二週後肝臟磷脂質中脂肪酸組成 ....................................... 101. III.
(5) 圖目錄 圖一 NASH病理進程 ........................................................................................................ 9 圖二 實驗設計流程 ......................................................................................................... 29 圖三 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟三酸甘油酯及肝臟膽固醇濃度 ......................... 102 圖四 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟丙二醛濃度 ......................................................... 103 圖五 餵食實驗飼料 12 週後之血漿游離脂肪酸濃度 ................................................. 104 圖六 餵食實驗飼料 12 週後之血漿丙二醛濃度 ......................................................... 105 圖七 餵食實驗飼料 12 週後之血漿維生素E濃度 ....................................................... 106 圖八 餵食實驗飼料 12 週後之血漿維生素C濃度....................................................... 107 圖九 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟GR濃度 ................................................................ 108 圖十 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟GPx濃度 .............................................................. 109 圖十一 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟超氧岐化酶濃度 ............................................. 110 圖十二 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟catalase濃度 ..................................................... 111 圖十三. 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟維生素E濃度 ................................................. 112. 圖十四 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟腫瘤壞死因子α濃度 ....................................... 113 圖十五 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟IL-6 濃度 ......................................................... 114 圖十六 餵食實驗飼料 12 週後之肝臟CYP4A 表現量 ............................................... 115 圖十七 預實驗肝臟H&E染色病理切片圖 ................................................................... 116 圖十八 肝臟H&E染色病理切片圖 ............................................................................... 117 圖十九 肝臟Masson’s trichrome染色病理切片圖........................................................ 118. IV.
(6) 摘要 非酒精性脂肪肝炎NASH (nonalcoholic steatohepatitis)屬於慢性脂肪 肝疾病的一種。形成NASH的病理因素以two-hit”假說最廣為接受，first hit為脂肪堆積在肝臟，形成脂肪肝，second hit則為氧化壓力及發炎反應 造成肝臟脂肪肝炎。毛木耳(學名:Auricularia polytricha)，與黑木耳同屬 木耳科木耳屬，已有研究指出具有降血糖、降血漿中膽固醇、抗氧化及 抗發炎的作用，因此本實驗探討毛木耳萃取物是否可以藉由改善 NASH ”two-hit”假說而達到減輕NASH的肝損傷程度。本研究以四十隻 六週齡之雄性Sprauge Dawley大白鼠為實驗動物，經適應後環境隨機分 成五組，除對照實驗組之Control組及高脂飲食組(HFD)外，實驗組分為 三組，HC組：餵食高脂飲食 8 週後給予Chow diet 4 週，LO組及HO組: 餵 食高脂飲食 8 週後，分別給予低劑量毛木耳萃取物 0.75％及高劑量毛木 耳萃取物 1.5％。實驗期間每週測量體重，實驗為期 12 週後犧牲採集血 液及肝臟進行分析。結果顯示，餵食毛木耳萃取物可以顯著降低肝損傷 指標(AST、ALT)，在first hit方面，降低血漿中葡萄糖含量改善胰島素阻 抗，改善血脂代謝及游離脂肪酸含量（p＜0.05），在肝臟方面高劑量毛 木耳萃取物可以降低肝臟中膽固醇及三酸肝油酯含量（p＜0.05），在 Second hit方面降低了血漿及肝臟中的脂質過氧化作用及肝臟中的發炎 反應（p＜0.05），以肝臟病理組織切片觀察結果可知，毛木耳萃取物降 低肝臟脂肪滴泡及發炎細胞含量，顯示具有改善肝損傷的效果。綜合以 上結果顯示，毛木耳萃取物可以改善NASH動物模式中的”two-hit”假說 而達到改善NASH的肝損傷程度。 關鍵詞：毛木耳萃取物、非酒精性脂肪肝、二次打擊假說、發炎反應 i.
(7) Abstract The pathology leading to non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is often characterized by the “two-hit” theory. The “first-hit” is triggered with obesity and insulin resistance, which causes excess hepatic lipid accumulation and hepatic steatosis. The steatotic liver is vulnerable to “second-hits,” which was mediated by inflammation and oxidative stress, resulting in lipid peroxidation then NASH. Auricularia polytricha is found to have. therapeutic. effects,. including. anti-inflammatory,. antitumor,. hypercholesterolemia, etc. The purpose of the study was to examine whether Auricularia polytricha extract （APE） improved liver damage in the animal model of NASH. 40 Male Sprague Dawley rats were randomly divided into five groups. Except the normal and high fat control group (control, HFD group), the experimental groups were fed with high fat diet for 8 weeks then divided into three groups by different amount of APE supplementation (0, 0.5, 1.5%) for 4 weeks. After 12 weeks of treatment, animals were sacrificed; blood samples and liver tissues were collected immediately for biological analysis. The results show that 1.5% APE significantly lowered plasma AST and ALT level and ameliorated hepatic steatosis and necroinflammation; In the first hit, APE improved the dyslipidemia, liver lipid metabolism and plasma free fatty acid level, as well as increased insulin sensitivity; In the aspect of second hit, 1.5% APE decreased the plasma and hepatic MDA content, liver inflammatory response then improved the antioxidant status. In conclusion, APE presents an effective improvement on liver damage of nonalcoholic steatohepatitis model. Key word：Auricularia polytricha extract, nonalcoholic steatohepatitis, two-hit, inflammation ii.
(8) 第一章 前言 根據行政院衛生署的統計顯示，慢性肝病及肝硬化一直位於國人十 大死因之ㄧ，台灣肝臟學術文教基金會過去的調查顯示，國內成年人口 脂肪肝的盛行率高達 26-34%，遠高於 B 型肝炎及 C 型肝炎之盛行率， 這些調查顯示肝臟疾病對國人健康造成很大的威脅性，國內最盛行之肝 病。 NAFLD(nonalcoholic fatty liver disease)非酒精性肝臟疾病和肥胖及 胰島素阻抗以至於代謝症候群均具有很大的相關性，也有相同的特徵， 如血漿三酸甘油酯偏高及高密度脂蛋白濃較低等等…。從單純的脂肪肝 到肝纖維化都稱之為 NAFLD，患者最主要特徵為無明顯的飲酒史， NASH (Nonalcoholic steatohepatitis)為 NAFLD 的其中一種，脂肪肝經發 炎反應會使肝細胞發炎而形成脂肪肝炎最後會轉變成肝纖維化、硬化。 造成 NASH 的主要機制為二次打擊假說為主，”First hit”肝臟的脂質代謝 續亂，造成脂質堆積在肝臟後經過”Second hit”發炎反應及氧化壓力來刺 激肝臟細胞引發肝發炎。因為患者幾乎不可能會針對少數脂質異常的症 狀進行肝臟切片分析，因此，目前對於 NASH 及相關 NAFLD 盛行率所 知有限。若是探討與 NASH 高度相關的代謝症候群盛行率，根據 2005-2008 國民營養變遷調查統計顯示，19 歲以上代謝症候群盛行率不 論性別均有二成以上，隨著年齡有增加的趨勢，此一族群同為 NASH 的 高危險群，不可忽視。 「衣食同源，藥食同根」 ，所謂許多的食用性植物除了食用價值之外， 也兼具藥理功能。現今社會，人們因為豐衣足食，引起大眾對飲食與健. 1.
(9) 康的高度關心。由於近來已有針對樟芝、靈芝等食品機能性的研究及開 發，對於菇類的機能性成分的生理活性也有更深入的了解。 在中國，無論是藥用還是食用菇類的應用已有兩千年多年的歷史， 而在台灣木耳種類的黑木耳（Auricularia auricula-judae）與毛木耳（A. polytricha）。為最普遍的實用菌之一，毛木耳外形與黑木耳相近，但毛 較長，質地也較硬脆。近年來學者研究發現真菌多醣體可有效作為醫療 用途，毛木耳其有效成份為毛木耳多醣體，已有文獻指出毛/黑木耳子 實體功效具有降血糖、降血中膽固醇、抗氧化、抑制血小板凝血能力、 抑制腫瘤及提高宿主免疫能力等作用。其中因毛木耳的降膽固醇、降血 糖及抗氧化能力這些都與 NASH 相關的代謝性症候群有關，因此本實驗 室結合了農試所萃取技術，將毛木耳水萃取物應用於 NASH 方面的研究， 達到改善的效果，未來希望可作為菇類保健食品開發新原料。. 2.
(10) 第二章 文獻回顧 第一節 NAFLD 相關流行病學調查 肝臟為人體最大的器官，具有許多的複雜機能，其中包含代謝、轉 化、解毒、合成蛋白質等作用，肝臟若受損，營養素的代謝、吸收都會 受到阻礙甚而影響到人體的免疫系統。肝臟從血液中攝取的游離脂肪酸 最後會在肝中合成三酸甘油酯並儲存，再以VLDL-C形式將三酸甘油酯 轉運出肝外進入血液中循環。若肝臟受損會導致之質代謝異常而囤積在 肝臟內形成脂肪肝。長久以來，根據行政院衛生署的統計顯示慢性肝病 及肝硬化一直位於國人十大死因之ㄧ，而台灣肝臟學術文教基金會過去 的調查顯示，國內成年人口脂肪肝的盛行率高達26-34 %，遠高於 B 型 肝炎的 15-20% 及 C 型肝炎之 2-4%，可稱為國內最盛行之肝病。 NAFLD在美國及全世界被認為具有形成慢性疾病的趨勢[1]，在西方國 家 及 一 些 中 國 地 區 NASH 及 NAFLD 的 盛 行 率 分 別 是 1%-5% 及 15%-39%[2]，而NAFLD同時有肥胖及糖尿病的盛行率正在增加[3]， NAFLD和胰島素阻抗、高三酸甘油酯血症、代謝症候群有很大的相關性 [4]，而脂肪肝是主要造成心血管疾病及大多和肥胖的發病率及死亡率相 關[5]。NAFLD盛行率為10~24%而在肥胖及第二型糖尿病中盛行率增加 到25~75%[6]，在台灣地區高血糖、高血脂及高血壓等三種慢性疾病為 高盛行率之慢性疾病，而依據行政院衛生署健康局調查顯示，臨床上國 人98%以上的糖尿病患都屬於第2型糖尿病，第1型佔1-1.5％，15歲以上 高血壓盛行率為21.38%，高血糖為7.47%，高膽固醇盛行率為10.9%，高 三酸甘油酯盛行率為15.6%。. 3.
(11) 第二節 非酒精性脂肪肝炎之文獻回顧 (一)非酒精性脂肪肝炎之簡介 非酒精性脂肪肝炎 NASH (non-alcoholic steatohepatitis)屬於非酒精 性脂肪肝疾病(NAFLD)的其中一種症狀，非酒精性脂肪肝疾病 NAFLD (nonalcoholic fatty liver disease)所涵蓋的肝臟疾病範圍很廣，從單純脂肪 肝、脂肪肝炎、纖維化，到肝硬化都稱之 NAFLD[6]。而非酒精性脂肪 肝炎”之病理診斷名詞首度由 Ludwig 等人所提出”，指出 20 位無飲酒的 女性糖尿病患者，在肝臟病理卻發現有大的脂肪滴泡(macrovesicular lipid droplet)、肝細胞壞死、發炎、類竇旁纖維化(perisinusoidal fibrosis)、 ballooning degeneration 及 Mallory hyaline 等類似酒精性脂肪肝的現象 [7]。在 NAFLD 病人身上發現，ALT 的變化量會比 AST 來的顯著，但 若逆轉此趨勢(AST 表現量較顯著)表示肝臟開始纖維化[8]。. (二)臨床上肝臟脂肪肝暨非酒精性脂肪肝的判定方法 脂肪肝為相當常見的慢性疾病，最佳診斷方式為侵入性病理組織染 色切片分析，臨床上所稱的「脂肪肝」是指肝臟內所含的脂肪(主要是三 酸甘油酯)的重量超過全肝臟重量的百分之五，或是依據 Brunt 判定方法， 在肝組織 H&E 染色切片中超過百分之十以上的肝細胞呈現脂肪空泡變 性的現象；而輕度脂肪肝是含脂肪變性的肝細胞少於 33%，中度為介於 33-66%之間，而重度則佔 66%以上[9, 10]。. 4.
(12) 非酒精性脂肪肝炎(NASH)之診斷標準[11] 目前臨床上針對 NASH 診斷方式多以消去法進行判定 下列 1-5 點或 1-3 點同時有第六點就可稱為 NASH (1)沒有飲酒史或每週飲酒量男性小於 140g 及女性小於 70g (2)特殊疾病造成脂肪肝但是濾過性病毒肝炎、藥物誘導成肝臟疾病 、全靜脈營養及 Wilson’s disease 亦要被排除。 (3)除臨床表徵其他非特異性症狀例如疲勞、消化不良、肝脾腫大 (4)有代謝性症候群或不知道什麼原因增加血漿中 ALT 多於四週 (5)肝臟影像研究達到瀰漫性脂肪肝的影像診斷準則 (6) 組織學診斷達到脂肪肝炎標準. (三)非酒精性脂肪肝炎與飲食相關性 飲食習慣可能直接促進脂肪肝炎經由調節肝臟三酸甘油酯的積聚 及抗氧化酵素也可直接影響胰島素的敏感性及飯後三酸甘油酯的代謝 [12]。 肥胖伴隨著脂肪肝的出現首度被Westwater及fainer提出[13]，而飲食 因子也可能會影響肝臟脂肪肝炎，研究指出飲食中富含飽和脂肪酸會增 加肝臟脂質及血漿胰島素濃度而引起胰島素阻抗[14]，而在NAFLD病人 身上發現，大量攝取飽和脂肪及膽固醇並降低多元不飽和脂肪酸的攝取， 這種飲食習慣會透過影響餐後三酸甘油酯的代謝及胰島素的敏感性而 造成脂肪肝炎及肝臟的氧化傷害[12]，或者大量攝取脂質(增加n-6/n-3脂 肪酸的比例)與果糖，會增加游離脂肪酸的合成而造成脂質積聚在肝臟促. 5.
(13) 進肝臟發炎有關[15]。 文獻指出給予 SD 大鼠長時間的高脂飲食可以誘導成 NASH，而給 予低脂飲食、標準飲食可能可以避免從 NAFLD 變成 NASH，但脂肪滴 泡卻沒有減少的現象[16]。給予 n-3 脂肪酸(EPA、DHA)可以改善冠狀心 臟疾病的危險性經由影響代謝的變化量例如血中三酸甘油酯，而 n-6 脂 肪酸(linoleic acid)是主要調節低密度脂蛋白(LDL-C)代謝的飲食脂肪酸， 於體內會增加 LDL-C 的清除率及減少 LDL-C 的產生，對改善 NAFLD 較有幫助[17]。低碳水化合物和高纖維的新鮮蔬菜、水果、豆莢類及穀 類可同時對降低胰島素阻抗及脂質標記有益，而降低碳水化合物的攝取 可以降低肝臟 Acetyl-CoA 因此可降低脂質合成[18]。Huang 等人給予 NASH 病患熱量限制飲食 1400kcal/diet，結果顯示可以改善肝臟脂肪肝 炎的狀況[19]。. (四)非酒精性脂肪肝炎之代謝表徵與致病機轉假說 (two hits) 胰島素阻抗、氧化壓力及發炎在NAFLD的發展進程中佔了很重要的 角色[20]，NAFLD的成因是多樣性的，其中以Day與James所提出的二次 打擊假說(Two-hit hypothesis)為主要被學者廣為接受[21]，第一個衝擊 (first hit)為脂肪堆積在肝臟成為脂肪肝(fatty liver)，第二個衝擊(second hit)則為出現脂肪肝炎 (fatty hepatitis)。第一個衝擊肇因於肝內脂肪的過 度堆積，其原因有肥胖症、高血脂症、糖尿病、及胰島素抗性等原因， 而第二個衝擊則起因於氧化壓力(oxidative stress)，會造成肝細胞膜上脂 質過氧化 (peroxidation)，並藉由釋放前發炎細胞激素和活化星狀細胞進 一步造成纖維化。而這些造成肝損傷機制直接對肝細胞進行兩次攻擊， 6.
(14) 並導致肝臟發生瀰漫性脂肪浸潤、炎症反應、壞死、凋亡、再生損害以 及肝星狀細胞活化等一系列病理連鎖性免疫攻擊反應。 從β-氧化作用而來的氧化壓力會活化NF-kB路徑的表現而產生促發 炎激素(TNF-α、TGF-α、IL-6、IL-8)及脂肪細胞激素的表現兩者共同作 用而形成了第二衝擊點並造成肝損傷發炎甚而纖維化[22]。在NASH肥胖 病人身上發現，發炎細胞激素會造成胰島素訊號缺陷、細胞損傷、中性 白血球的趨藥性、肝臟星狀細胞的活化、細胞凋亡、並會增加肝臟及脂 肪組織TNF-α及其接收器的表現，這些都和纖維化有關[23]，而TNF-α已 知為促發炎因子，在肝細胞發炎及細胞凋亡上扮演重要的角色[8]。 胰島素阻抗會導致高胰島素血症而血漿中過多的胰島素會刺激內 臟脂肪釋放出游離脂肪酸，在肝臟胰島素會抑制β-氧化作用，進而促進 脂肪酸合成，最後胰島素阻抗會誘導過多的飽和脂肪酸堆積在肝臟[24]， 而過多的脂肪酸不只有毒也會活化細胞內胞器例如粒線體、微粒體、過 氧化小體，尤其是微粒體，CYP2E1被誘導代謝過多的脂肪酸而活化產 生ROS，這些氧化壓力被認為造成粒線體損傷及肝細胞損傷[25]。 CYP2E1與CYP4A可誘導肝臟微粒體進行脂肪酸的hydroxylation，可 形成脂質過氧化作用，和NASH的臨床特徵有關的每個因子：肥胖、糖 尿病、高血脂，尤其是胰島素阻抗會增加CYP2E1表現量 [26]，CYP4A 受PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor-α)所調控，PPARα為轉 錄因子，可調控基因例如脂肪酸的調節與運輸。而微粒體的脂肪酸氧化 作用占比較小的部分，但在禁食、糖尿病及過度營養伴隨著肝臟脂質代 謝絮亂，CYP4A蛋白可能為主要的適應性反應的中間物[27]。. 7.
(15) 許多文獻已探討氧化壓力和形成NASH有很大的關係，Sanyal等人 指出在NAFLD、NASH病人身上肝臟活體組織染色：脂質過氧化蛋白 (3-nitrotyrosine)會大量表現[26]，在NAFLD病人身上，增加ROS、促發 炎激素、肝臟細胞壞死而導致粒線體功能缺陷扮演著重要角色。氧化壓 力是NASH的主要特徵及ROS(reactive oxidative species)的來源，在肥胖 病人身上會造成肝臟內肝臟實質細胞、慢性發炎細胞及脂肪組織浸潤而 活化巨噬細胞[28]。Pessayre等人提出ROS及脂質過氧化可以解釋所有典 型NASH組織特徵[29]，而脂質過氧化終產物4-HNE、MDA可和肝臟蛋 白形成共價而形成的產物可能潛在的危害免疫反應也可刺激細胞外基 質蛋白的合成。和脂肪肝不同的是，NASH會有粒線體缺損的現象[26]。 活化肝臟CYP2E1、肝臟粒線體缺損、脂肪組織及鐵過多都是ROS的來 源，在肥胖者中CYP2E1表現量皆會增加，在動物實驗指出會增加 CYP2E1的蛋白表現量[30]， CYP2E1表現量在NASH病人比在沒有 NASH病人上表現更為顯著，且肥胖者造成有肝臟疾病CYP2E1扮演著重 要角色，其機制可能為和CYP2E1酵素所結合的受質會造成未耦合電子 的氧化及連鎖反應產生氧自由基及過氧化氫而產生細胞內膜的損傷[31, 32]。 CYP450酵素CYP4A、CYP2E1共同催化氧化還原系統時產生自由基， 並在內質網代謝脂肪酸過程中產生ROS[33]，CYP4A和CYP2E1在共同代 謝不同的內生性脂質受質上扮演著重要角色，例如脂肪酸及花生四烯酸 [34]，這些可指出CYP4A酵素可以催化活化氧的產物及脂質過氧化物 [35]，在過氧化體增值劑(PP, peroxisome proliferator)中CYP4A蛋白為主 要在脂質代謝的適應性反應過程中扮演主要媒介，肝臟 CYP4A酵素在脂 肪酸及前列腺素的ω−氧化作用可被高脂血症試劑神經纖維酸(fibric acid) 8.
(16) 及其他過氧化體增值劑高度誘導，透過 PP誘導CYP4A酵素是經由調節細 胞核中PPARα，而脂肪酸被定義為PPARα的配位體而PPARα的接受器指 出可以調節脂質恆定[36]。 文獻指出給予高指飲食會增加CYP4A(內質網進行ω-氧化作用的)的 表現量[37]，肥胖、胰島素阻抗及NASH危險因子式因為增加脂肪組織釋 放出游離脂肪酸，NASH病人胰島素阻抗會增加脂肪組織內的脂解作用 增加游離脂肪酸[38]，而游離脂肪酸轉入到肝臟會刺激PPAR-α造成增加 脂肪酸的ω-及β-的氧化作用。[39]. [8] 圖一 NASH 病理進程 圖一顯示代謝性症候群及胰島素指抗會增加游離脂肪酸含量，造成 肝臟脂質代謝異常、續亂，形成肝臟脂肪炎，代謝過程中產生氧化壓力 及發炎反應使發炎反應增加，TNF-α表現量增加、降低adiponectin表現 量，抗氧化物質含量降低，對肝臟進行第二次攻擊形成NASH，肝細胞 再生能力，降低修復能力降低活化星狀細胞TGF-表現量增加造成纖維. 9.
(17) 化。 (五). 非酒精性脂肪肝炎與酒精性脂肪肝的病理及體內代謝差異比較 脂肪肝是一種病理現象，而其原因卻是複雜多樣的。一般而言，病. 因粗分為酒精性與非酒精性。非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 的病因也有許多，包括某些藥物及毒物、先天性代謝 疾病、及後天代謝性疾病，其中最常見病因的就是肥胖症、糖尿病、及 高血脂症，肝臟活體組織檢察被認為是診斷的黃金準則也是唯一方法辨 別NASH脂肪肝炎有沒有發炎現象[40]，NASH在組織學上和酒精性脂肪 肝(Alcoholic liver disease, ALD)非常相似但卻沒有過多酒精的攝取現象， NASH和ALD(Alcoholic liver disease)的病理機轉在許多地方都非常相似 包 括 氧 化 壓 力 、 鐵 離 子 沉 積 、 過 度 表 現 CYP2E1 及 參 與 內 毒 素 及 TNF-α[41]，由於NASH和ALD有這麼多的相似之處，且無法得到適合的 診斷工具來區別，所以在診斷是否為NASH上有沒有喝酒為不可或缺的。 例如5年過去內有飲酒量女性多於20g/day及男性多於30g/day為排除為 NAFLD的重要因子[42]，一些ALD患者例如”kitchen-drinker”， 可能會 忽視喝酒的事實，因為在肝在組織的相似度及缺少了飲酒的證據下而導 致誤診為NASH。一般的肥胖被廣為接受的分為兩種形式：一種為內臟 脂肪肥胖的形式，另一種為皮下脂肪肥胖型式，而內臟脂肪肥胖和代謝 性症候群有很密切的關係，包括第二型糖尿病[43]。研究指出NASH和 ALD患者最大的不同點在於營養狀態上，雖然相較於NASH患者，ALD 患者AST/ALT比率及r-GT(γ- Glutamyl transferase)提高較為顯著[44]，而 NASH患者和生活形態所導致的疾病(lifestyle-related diseases)尤其是糖 尿病較為相關，在NASH病人身上發現內臟脂肪的積聚和肝臟發炎及胰 島素阻抗有很大的關聯，而內臟脂肪的區域和ALT及HOMA-IR成正相關 10.
(18) [44]，而造成胰島素阻抗的主要原因為內臟脂肪所釋放的游離脂肪酸及 TNF-α(tumor-necrosis factor-α)。在ALD患者身上氧化壓力也是造成肝損 傷的主因[45]。在NASH及ALD病人身上CYP2E1都會被誘導活化而產生 ROS，但在ALD病人身上，過多的酒精是CYP2E1的主要受質，因無法 完全被酒精去氫酶 (alcohol dehydrogenase)給代謝完全[46]，因此造成 NASH及ALD氧化壓力的受質並不相同[44]。. 表一 ALD 與 NASH 的差異 ALD. NASH. 判定方法. 飲酒造成脂肪肝. 酒精攝取女生：＜20g/day 男生：＜30g/day[47]. 肝指標. 同：AST 與 ALT 皆表現量增加. 異：AST/ALT、r-GT 表現較顯著 ALT 表現量較高[11] [44] 脂肪肝形成原因 酒精攝取[48] 第二型糖尿病、代謝性症候 群、肥胖等[21] 肝損傷原因. 氧化壓力 酒精代謝產生 ROS[48]. 氧化壓力、發炎反應 CYP2E1 被誘導代謝過多的脂 肪酸而活化產生 ROS[25]. CYP2E1 表現量. 上升 酒精代謝成乙醛，會造成肝臟代 謝性及功能性擾亂，CYP2E1 為 酒精受質，當大量飲酒時表現量 會被誘導上升[48]. 上升 脂質代謝會誘導 CYP2E1 上 升，NASH 病人 CYP4A 表現 量也會被誘導上升[37]. 11.
(19) (六). NASH 動物模式介紹 NASH 動物模式可經由多種不同的因子來造成肝臟脂肪的沉積，這. 些因子包括過度營養、methionine-choline缺乏飲食、胰島素阻抗、肝毒 素及缺乏瘦體素或受體素的接受器[49]。NASH動物模式有很多種，但卻 很少符合NASH病人真正形成病理狀態的因素，最常用的為餵食大鼠 methionine-choline缺乏飲食產生出營養缺乏的現象[50]，文獻指出阻塞 性睡眠窒息症(obstructive sleep apnea, OSA)病人在睡眠時反覆的通氣道 阻塞會有潛在性嚴重的低氧血症，在肥胖病人上會有發展成脂肪肝的危 險性[51]，也有證據顯示OSA可能成為肝臟損傷-缺血性肝炎的危險因子 [52]，持續性的或間斷性的低血氧症在NASH的發展上扮演著重要角色 -NASH肝臟脂肪肝伴隨有低血氧症的現象[53]。 Nitrite已被認為是含氧量低的緩衝液，可以有助於調節含氧量低的 血管擴張及含氧量低的粒腺體呼吸作用[54]，因此Fusako Takayama等人 給予methionine-choline缺乏飲食四週後腹腔注射sodium nitrite (NaNO2) 40 mg/kg四週來誘導成NASH動物模式[50]，雖然MCD飲食誘導典型改 變成NASH模式及SD大鼠自由攝取三週的液態高脂飲食(liquid high-fat dier, LHFD)也可造成NAH典型的病狀，包括脂肪炎、肝臟發炎、纖維化 [55]。這些動物模式並不能反映NASH病人的飲食特徵，例如MCD飲食 在人體上並不常見，而MCD飲食可造成嚴重的體重流失等惡病質，而這 些並非NAH病人的特徵[56]。LHFD動物模式和NASH患者飲食高飽和脂 肪酸及低多元不飽和脂肪酸的型態完全不同。雖然經由缺乏瘦體素及其 接 受 器 來 誘 導 的 NASH 動 物 模 式 很 成 功 但 並 不 能 反 映 出 自 然 形 成 NAFLD與NASH病人的病因且有可能阻抗發展成纖維化。上述誘導模式. 12.
(20) 均無法反映由多種因素構成的NASH病人特徵，並不符合NASH生理病 徵。 Zheng-Jie Xu作者等人新建立一個NASH動物模式餵食自製的高脂 飲食(每100g含有88g chow diet、10g豬油及2g膽固醇)，顯示出代謝症候 群的一些特徵例如增加內臟肥胖、高脂血症、血液游離脂肪酸濃度增加 及TNF-α[49]。 表二 NASH 動物模式 動物模式 methionine-choline 缺乏飲食. 不適用原因 產生體重流失等惡病質，在 NASH 病人身上並無觀 察到此現象[56]. methionine-choline 缺乏飲食 +腹腔注射 sodium nitrite. 本研究預實驗肝切片結果經病理科醫師判讀為肝細 胞因腹腔注射 sodium nitrite 而直接壞死，和 NASH 病人肝組織切片並不相同[50]. 液態高脂飲食(71% from Fat). 與 NASH 患者飲食高飽和脂肪酸及低多元不飽和脂 肪酸形態不同，NASH 病人血漿中 ALT 含量會顯著 增加，但在此實驗上和 Control 組無顯著差異[55]. 高熱量飲食 (37% corn oil , 185% caloric) db/db or ob/ob mice. CYP2E1 及 PPAR-α 表現量下降和 NASH 病人不同 [57] 經由缺乏瘦體素及其接受器來誘導的 NASH 動物模 式很成功，但並不能反應出自然形成 NAFLD 與 NASH 病人的病因且有可能阻抗發展成纖維化[49]. 13.
(21) 第三節 菇類的功效性研究 食用菇類為一高經濟價值之產品，可食菇類已知不但富含營養素低 熱量且含有豐富蛋白質及維生素，最近已被高度注意在保健食療上治療 上的價值。菇類已被研究出具有抗腫瘤、抗菌效果、免疫調節、抗血小 板凝、降膽固醇及降血糖作用及保護心血管及肝臟的功效。菇類成分中 能引起生物生理活性物質已被文獻指出像是多醣體、三萜類(terpenoids)、 多醣體生態複合物(polysaccharide-peptide complexes)及蛋白質[58]。. (一). 菇類對肝臟之研究 給予 Lentinula edodes (shiitake)椎茸具有保護 Concanavalin A 所誘發. 的肝損傷的作用，水萃之椎茸所含多酚類以丁香酸(Syringic Acid)及香草 酸(Vanilic Acid)為主，研究顯示椎茸不但可以降低 AST、ALT、且能降 低 TNF-α、IFN-γ、IL-6 發炎細胞激素，也能有效清除自由基，這些抗 氧化作用能有效抑制氧化傷害引起的肝損傷[59]。 給予糖尿病大鼠 Agaricus bisporus (white button mushroom; WBM)洋 菇冷凍乾燥粉末顯示可以降低血漿中葡萄糖及三酸甘油酯的含量，肝臟 酵素活性(AST、ALT)肝臟重量。另外在高膽固醇血症大鼠上，洋菇可 以顯著降低血漿中總膽固醇及低密度脂蛋白(LDL-C)含量及肝臟中膽固 醇及三酸甘油酯含量並隨著增加血漿中高密度脂蛋白含量，以上結果顯 示洋菇具有降血糖及血脂的效用[60]。 Mukitake mushroom (Panellus serotinus)剝茸給予誘導成非酒精性肝 臟疾病的 db/db 小鼠，顯示可以降低肝臟中三酸甘油酯含量及肝腫大的 14.
(22) 現象，降低 AST、ALT，增加脂肪分解酵素 carnitine palmitoyltransferase (CPT)活性，降低脂質合成酵素 fatty acid synthase (FAS) 及 malic enzyme 活性，另外也能顯著降低在血漿中胰島素、adiponectin、單核細胞趨化 蛋白-1(MCP-1, monocyte chemoattractant protein-1) 含量，抑制 IKKβ 活 性，顯示可以改善胰島素抗性、抑制發炎細胞激素，發現撥茸可以透過 干擾 IKKβ–NFκB 訊息傳遞路徑而降低了 MCP-1 的含量來達到減緩 NAFLD 的進展[61]。 研究顯示不論是水萃或是乾燥粉末之 Hatakeshimeji(學名: Lyoph -yllum decastes Sing.) (北風菌)，顯示可以降低給予高膽固醇飲食大鼠血 漿中的膽固醇且並不影響到血中 HDL-C 的量，在一般飲食大鼠上，給 予 Hatakeshimeji 也顯示可以降低血漿中三酸甘油酯及磷脂質的含量，會 增 加 7α-hydroxylase 酵 素 活 性 增 加 糞 便 中 膽 酸 排 出 量 ， 可 能 是 Hatakeshimeji 中的可溶性膳食纖維 β-葡聚醣可增加小腸的黏著性降低膽 酸及膽固醇及三酸甘油酯及/或在吸收因此降低血漿中總膽固醇濃度 [62]。. 15.
(23) 第四節 毛木耳之文獻回顧 (一) 菇類簡介 “醫食同源，藥食同根”這句名言可謂菇類做為食品的最佳註解，近年 來對菇類的關心與研究越來越高，作為食品的菇類，從營養特性、嗜好 特性加上食用後調整身體機能三方面來做評價，近年來的報告指出菇類 的藥理活性除了可增強免疫力、調節體況及病病康復力等作用外，對癌 症、腦中風、心臟病等所謂的成人病有預防及改善的效果，此外也發現 菇類含有降血壓與膽固醇等物質，在當今營養過剩且高齡化的社會，菇 類必能成為未來新興機能性食品並引起關注。[63] 菇類富含 β-葡聚醣、幾丁質、雜多糖(果膠質、半纖維素、聚醣醛 酸苷)等食用纖維，可作為低熱量食品原料，並有特有香味和鮮味，在當 今社會相當受歡迎，。菇類的美味是以 GMP、AMP 等核甘酸為主體， 在取決於麩胺酸、琥珀酸、蘋果酸等及游離糖來作調和[63]。. (二). 毛木耳之介紹. 毛木耳(學名:Auricularia polytricha)又俗稱為紅茸或或黑茸，在歐美 國家又稱為 Jew’s ear(意旨猶太人的耳朵)，為膠質菇(jelly fungi)的一種， 屬木耳科(Auriculariaceae)木耳屬(Auricularia)，外型略似耳狀，呈棕色或 棕黑色，中國木耳類最早記載於(神農本草經)收錄有<五木耳>之名稱。 毛木耳多產於溫帶及亞熱帶、熱帶地區，而台灣屬亞熱帶、熱帶地區所 以非常適合栽培。杜金池與鄭 爕 調 查 台 灣 產 野 生 木 耳 屬 得 到 A. auricula-judae、A. polytricha、A. delicata、A. mesenterica、A. peltata 以 16.
(24) 及 A. fuscosuccinea 共七種[64]。目前廣為栽培食用的木耳為黑木耳（A. auricula-judae）與毛木耳（A. polytricha），毛木耳子實體中具有髓質， 茸毛層有較長的茸毛，而黑木耳則沒有髓層，茸毛層的茸毛也較短。因 此與黑木耳相比，毛木耳質地較為粗韌有嚼勁，黑木耳質地較軟嫩，毛 木耳不但是中國人普遍的食用菌之一也可作為藥用，有滋養強壯、清肺 益氣、補血活血、鎮靜止痛、防止高血壓及便秘等功效[65]。 毛木耳是一種以木材為營養源的腐生型好氣性真菌，喜歡在偏微鹼 的環境中生長屬木材腐朽菌。早期台灣採用段木天然培植法，近幾年自 日本引進太空包技術取代段木培植法，不但可降低生產成本可使產量大 幅提升[65]。. 17.
(25) 表三 毛木耳與黑木耳差別 毛木耳. 黑木耳. 學名. Auricularia Polytricha. Auricularia auricula. 別名. wood ear 、red ear. 雲耳. 產地. 亞熱帶、熱帶 (東南、亞台灣). 溫帶 (東北亞). 口感. 粗韌有嚼勁. 軟嫩. 茸毛. 較長. 較短. 髓層. 有. 無. 圖片. 18.
(26) (三). 毛木耳的營養價值. 毛木耳是中國人普遍的食用菌之一，為低熱量、富含膳食纖維、維 生素及多種酵素的高營養價值食品，也是人類最早利用為副食品的菇類。 菇類的營養成分大致介於肉類和蔬果之間，肉類雖含高量蛋白質，也含 有高脂肪和高膽固醇[65]。 研究指出毛木耳的蛋白質是米、麵、蔬菜無可比擬的，富含有所有 的必需胺基酸，其維生素 B2 的含量是米、麵的十倍，鐵質比肉類高一百 倍，鈣質含量是肉類的 30~70 倍，每一百克新鮮子實體內含有維生素 C 達兩百毫克[65] 。 毛木耳多醣成分主要部分是熱水及鹼均不溶的葡聚醣Ⅱ為主體，而 熱水或鹼可提取的水溶性酸性多醣僅占 13%，從木耳取得的多醣為由木 糖：甘露糖：葡萄糖：葡醣醛酸=1.0:4.1:1.3:1.3 所組成[63]。 表四 新鮮木耳成分分析 （100 克） 熱量. 水分. 粗蛋白. 粗脂肪. 碳水化. 粗纖維. 膳食纖. 灰分. （kcal） （g）. （g）. （g） 合物（g） （g）. 維（g）. （g） B2（mg）. 35. 90.8. 0.9. 0.3. 7.7. 0.9. 6.5. 0.3. 菸鹼素. 鈉. 鉀. 鈣. 鎂. 磷. 鐵. 鋅. 維生素. 0.05. （mg） （mg） （mg） （mg） （mg） （mg） （mg） （mg） 0.5. 28. 40. 33. 15. 17. 1.1. 0.1. 資料來源：行政院食品衛生處. 19.
(27) 木耳已知為傳統中國藥物且通常被當作為食材，在台灣有五種常見 的木耳種類包括毛木耳、jin ear 等，而毛木耳被發現在治療抗發炎、抗 腫瘤、血壓調節、心血管疾病、高膽固醇血症、高脂血症及慢性支氣管 炎，具有醫療活性[66]，推測可能是他們的抗氧化能力。與其他木耳相 比，毛木耳不僅具有好的抗氧化能力也有好的螯合鐵離子的能力[67]。 研究也指出毛木耳含有維生素 C、α-tocopherol、β-tocopherol、γ-tocopherol、 δ-tocopherol 與豐富的多酚含量及單寧等抗氧化物質，而多酚具有清除自 由基、捕捉氫離子的能力可有效抑制脂質過氧化作用[67, 68]，也有研究 指出黑木耳除了多醣體外還有豐富的生物鹼、B1、B2 維生素 C 及礦物 質成分[69]。. 20.
(28) (四). 毛木耳之成分分析及已知功能介紹 食用或藥用菇類的多醣體被認為對健康有眾多好處，而攝食的量與. 頻率和降低癌症死亡率有關係。在中國，黑木耳傳統被當作為食物和藥 物，而黑木耳的果實是一種可食的 black-brown mushroom，含有多量的 碳水化合物(將近 630g/kg 的乾重)及蛋白質，黑木耳所含的蛋白質、礦 物質(鈣、磷、鐵)和銀耳相較之下較高，而蛋白質富含離胺酸與白胺酸 已知對健康有益[70]。. 1. 對於體內氧化壓力的影響 作者 Yangchao Luo 等人指出餵食老鼠黑木耳多醣體不但可增加血 漿及肝臟超氧化物歧化酶(SOD)含量降低 MDA 的量且能增加清除氫氧 自由基、超氧自由基的能力，顯示出在抑制自由基及抑制 LDL 氧化上 有很強的抗氧化能力，同時也能改善肝臟的抗氧化酵素[71]。 酒精萃取黑木耳子實體可以延緩共軛雙烯出現且會抑制終產物 thiobarbituric acireactive substance(TBARS)產生，具有很高的抗氧化能力 [72]。 大陸學者探討黑木耳對家兔脂質過氧化脂效果，結果顯示黑木耳不 但在降血脂和抗動脈粥狀動脈硬化有很好的效果，也具有抑制脂質過氧 化的作用，可能因黑木耳含有高量的維生素 E、矽、鎂、鐵等微量元素 有關[73]。 黑木耳在濃度為 200µg/ml 時可超過 50% 降低亞麻油酸的過氧化作 21.
(29) 用，在抗氧化能力上及清除 DPPH 上都有不錯的能力，文獻也指出植物 萃取物的抗氧化能力及清除自由基的能力被認為是具有酚類、維生素 C、 生育醇(tocopherol)及類胡蘿蔔素(carotenoids)等[74]。. 2. 降低膽固醇作用 除香菇所含的低分子降膽固醇物質(eritadenine)外，黑木耳所含的酸 性多醣(glucuronoxylomannan)有顯著的降膽固醇作用[63]，研究指出給予 餵食高膽固醇飲食的 ICR 小鼠黑木耳子實體 120mg/kg/day，不但 在維持 HDL-C 的情況下可顯著降低血漿中總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇含 量並可增加 LPL 與總抗氧化能力的活性，顯示能有效抑制粥狀動脈硬化 的進展 [75]。黑木耳含有豐富的 β-葡聚糖、葡糖醛木 苷聚糖及膳食纖維， 而葡糖醛木苷聚糖含有陰離子官能基可減少膽固醇在腸道的吸收、增加 膽酸的排出，增加肝臟膽固醇轉換成膽酸量而有降低肝臟膽固醇的效果 [76]。在毛木耳的鹼不溶葡聚醣Ⅱ不能發現這種降膽固醇的作用，所以 一般認為降血膽固醇的作用可能是葡聚醣醛酸支鏈的 α-(1→3)-甘露聚 醣所具有的特殊酸性多醣結構，能抑制腸膜絨毛細胞吸收膽固醇及其衍 生物，毛木耳也含有亞麻油酸，可在體內與膽固醇結合成膽固醇酯，可 降低血漿中膽固醇[65]。. 3.. 抗發炎作用 在 Carrageenin 誘導的發炎反應試驗中發現給予老鼠黑木耳多醣體. (Glucuronoxyloglucomannan 、Glucuronoxylomannan)可以有效降低足蹠 22.
(30) 的腫脹程度而在燙傷誘導發炎反應試驗中具有降低痛覺反應的現象[77]。 此一結果證實了木耳多醣體的抗發炎效應。. 4. 調節宿主免疫反應作用 菇類蛋白質可以影響宿主的免疫系統，在治療許多不同的疾病上 可 能 具 有 潛 力 。 毛 木 耳 純 化 出 之 免 疫 調 節 蛋 白 (immunomodulatory protein,APP)可顯著調節淋巴細胞及巨噬細胞，AAP 可以促進細胞增生、 增加干擾素(IFN-γ)的分泌及促進 LPS 誘導的巨噬細胞(macrophage)增加 一氧化氮(NO)及腫瘤壞死因子(TNF-α)產生，根據這些結果顯示 APP 是 一種免疫刺激物可強化宿主的免疫反應[58]。. 5. 血糖調節之研究 Sone 作 者 等 人 指 出 黑 木 耳 水 溶 性 多 醣 體 富 含 酸 性 異 多 醣 (heteropolysaccharide)及少量的的中性 β-D-glucan，給予 diabetic KK-Ay mice 黑木耳萃取之水溶性多醣，尤其是中性多醣，發現可以有降低血漿 中餐前血糖、胰島素、糖化血色素（HbA1c） 、尿糖、攝食量及飲水量之 作 用 ， 因 此 可 以 改 善 高 血 糖 （ hyperglycemia ）、 高 胰 島 素 血 症 （hyperinsulinemia）及攝食亢進（hyperphagia） ，也發現限制食物攝取並 不是降低血醣的主要因子[78]。. 23.
(31) 6. 抗血栓研究 給予實驗動物黑木耳萃取多醣，發現可以抑制血小板凝集及血液凝 固，和水萃取及酸萃取相比，顯示用鹼萃取不含硫基的黑木耳多醣顯示 有較高的抗凝血活性，可經由催化抗凝血酶（antithrombin）來抑制凝血 酶（thrombin）的作用並不是經由肝素輔因子二號(heparin cofactor Ⅱ)。 黑木耳子實體可抑制血小板聚集，降低血液凝塊緩和動脈粥狀硬化，防 止血栓形成[79]。Markhija and Bailley 作者發現黑木耳中的腺嘌呤 (Adenosine)含量高達 154mg/g，此種物質在抑制血小板凝集有顯著的作 用，尤其有抑制腦部栓塞解除腦部血小板凝集的作用[80]。. 7. 抗腫瘤研究 已知香菇多醣(lentinan)及 schizophyllan(裂褶菌多醣)在抗腫瘤是較 具代表性，與一般菇類相比，木耳持有兩種分支度更高的 β-(1→3)-葡聚 醣，在抗腫瘤的活性亦不同，將此兩種葡聚醣用腹腔給予小白鼠探討對 Sarcoma-180 固形腫瘤的抑制效果，研究顯示用熱水提取的葡聚醣Ⅰ(分 支度 2/3)與 schizophyllan(裂褶菌多醣)有一樣的抑制效果，但分支度極高 的鹼不溶性葡聚醣Ⅱ(分支度 3/4)，在抗腫瘤的活性上相對較低，其抑制 率為 18%[63]。 Mengyao Yu 作者等人給予 sarcoma180 腫瘤小鼠酒精萃取毛木耳， 其中的某一部分多醣體 APPⅡA-由甘露醣(mannose)及木糖(xylose)組成， 顯示會增加經由活化巨噬細胞，增加 IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌、及 iNOS. 24.
(32) 的表現量來達到抗腫瘤的效果[81]。 8. 黑木耳與減重的關係 黑木耳為膠質菇的一種，乾燥後再吸水的膨脹係數很高，食用之後 會讓胃有飽的感覺，進入胃腸吸濕膨脹之後隨著胃腸蠕動貼附在絨毛細 胞表面，可減緩胃腸酵素分泌到胃腸中，且含有纖維素、半纖維素、果 膠等膳食纖維可促進胃腸蠕動幫助排便[65]。. 25.
(33) 第三章 研究動機及目的. 長久以來，我們總將脂肪肝通常和酒精攝取聯想在一起，臨床上， 歐美國家最主要的肝臟疾病是因長期多量飲酒，因絕大部份的肝疾病都 是 由 於 酒精 的 傷害 ， 但 在 近 15-20 年 以 來 ， 非 酒精 性 脂 肪肝 疾 病 (nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)卻成為歐美國家人口群中，肝 功異常必要先考慮的病因。在台灣由於飲食及生活習慣的改變，隨著肥 胖人口及罹患糖尿病的人口有逐漸增加的趨勢，罹患非酒精性脂肪肝的 病人也有日趨增加的趨勢，而此疾病更與更年期、年齡、代謝性症候群、 高血脂等常見之疾病有很大的相關性，可見問題之嚴重性。 在台灣，毛木耳的產量占大宗，卻鮮少有毛木耳相關的研究，先前 的研究大多針對於黑木耳，像是黑木耳多醣體已被研究出具有調節血 脂、血糖及抗發炎、提高體內抗氧化能力等功效，而毛木耳對於肝臟疾 病之研究又更少。先前本實驗室已研究出毛木耳萃取物具有降低卵巢切 除大鼠血中脂質代謝異常、增加肝功能指標 GOT、GPT 的作用，加上 毛木耳萃取物被研究出含有豐富的抗氧化物質，因此本實驗將利用毛木 耳萃取物探討是否具有改善 NASH model 的”two-hit”作用來達到延緩 NASH 的病理進程。. 26.
(34) 研究假說. 27.
(35) 第四章 研究架構. 使用 40 隻六週齡雄性 Spraque Dawley 大白鼠經適應期 4 天後，先 經由尾靜脈採血及體重測量後將老鼠分組，並給予不同劑量之毛木耳萃 取物，實驗動物採自由給食（ad libitum）並記錄每天飲食攝取量以監 測每組所吃的量，每週監測體重，實驗為期 12 週。犧牲前禁食 12 小時 後採集血液、取肝臟組織進行分析。. 28.
(36) 第五章 材料與方法 第一節 實驗設計. Groups： Control: rats fed on laboratory rodent diet HFD: rats fed on high fat diet HC: rats fed on high fat diet for 8 weeks then fed on laboratory rodent diet for 4 weeks HO: rats fed on high fat diet for 8 weeks then fed on laboratory rodent diet supplemented with 1.5% APE LO: rats fed on high fat diet for 8 weeks then fed on laboratory rodent diet supplemented with 0.75% APE. 圖二 實驗設計流程. 29.
(37) 一、. 檢體收集. 1. 血液 採集血液檢體後放置於含有 EDTA 及 heparin 的採血管後，於條件為 4℃ 以下之離心機離心（3220 g）20 分鐘，分離出血漿與血球，取出上層血 漿於微量離心管後，加入生理食鹽水，再以相同的條件離心，目的為清 洗血球，連續清洗三次後將紅血球分裝於微量離心管中，保存於-80℃下， 待日後分析。. 2. 肝臟組織 取下肝臟後，取肝大葉 1cm*1cm 左右大小，泡置於 10％福馬林中， 室溫保存待日後切片分析。. 30.
(38) 二、. 分析項目 aspartate aminotransaminase、alanine aminotransaminase、 total cholesterol、triglyceride、high dencity lipoprotein-. 血液分析. cholesterol、low dencity lipoprotein- cholesterol、glucose AC、insulin、Vitamin E、TBARS、Vitamin C、free fatty acid、fatty acid profile 肝 臟 H&E 、 Masson’s trichrome 切 片 染 色 、 total cholesterol、triglyceride、Vitamin E、硫代巴比妥酸反應. 肝臟分析. 物質(TBARS)、超氧歧化酶(SOD)、catalase、glutathione reductase、glutathione peroxidase、CYP 4A、fatty acid profile. 31.
(39) 第二節 實驗材料 1. 實驗動物 本實驗使用至 BioLASCO 公司購入六周齡的 SD 大鼠 40 隻，實驗 動物飼於動物房之不銹鋼籠中，飼養於十二小時 light-dark cycle，恆 溫的動物房內(23±1℃)，濕度 40-60％，水分與飼料充分供給，經適應期 4 天後將實驗動物分成五組：Control、HFD、HC、HO、LO 組。 2. 毛木耳萃取物 原料來源以太空包栽培之嘉義中埔地區商業栽培菌株，在冬季進行 取樣。取樣後由行政院農業委員會農業試驗所鳳山熱帶園藝試驗分所進 行毛木耳萃取以提供實驗所需。 3. 飼料配製 本實驗分為五組，使用 Laboratory Rodent Diet 5001（Purina Co., MO, USA） ，高脂飲食配製方法如表六所示，HO 及 LO 組依比例（圖二）加 入毛木耳萃取物，飼料每兩週配製一次，並放於 4℃中備用。. 32.
(40) 4. 飲食組成分 表五 Laboratory Rodent Diet 5001 主要營養組成 Table 5 Composition of Laboratory Rodent Diet 5001 Ingredient. (W/W)％. Protein. 23.9. Fat. 5.0. Fiber(Crude). 5.1. Carbohydrate. 48.7. Ash. 7.0. 33.
(41) 表六 高脂飲食配製方法及三大營養素比例 Table 6 Composition and of the high fat diets Composition. (W/W)％. Chow diet. 88. Lard oil. 10. Cholesterol. 2. 34.
(42) 表七高脂飲食之三大營養素比例 Table 7 Energy of high fat diet and fiber contant Groups. Control. HFD. HC. HO. LO. Carbohydrate. 58%. 52%. 58%. 58%. 58%. Fat. 13%. 30%. 13%. 13%. 13%. Protein. 29%. 18%. 29%. 29%. 29%. Fiber. 1.79g/day. 1.57 g/day. 1.79g/day. 2.25g/day. 2.02g/day. 35.
(43) 第三節 實驗方法 一、. 毛木耳萃取物分析. 1. 毛木耳萃取物製備 由行政院農業委員會農業試驗所鳳山熱帶園藝試驗分所製備提供， 萃取技術目前已申請專利。 2. 毛木耳萃取液成分分析 i.. 蛋白質含量測定[82] 取樣品 200μL、180μL A 劑及 20μL B 劑於 50℃反應 20 分鐘，待. 冷卻後加入 600μL C 劑於 50℃反應 10 分鐘，離心(10,621g )1 分鐘， 利用分光光度計測 650 nm 之吸光值，與標準溶液之吸光值對照換算 得知蛋白質含量。 A 劑：0.4% K．Na tartrate＋10% Na2CO3＋0.5M NaOH B 劑：2% K．Na tartrate＋3% CuSO4．5H2O＋0.1M NaOH C 劑：Folin-Ciocalteu reagent 稀釋液(FC reagent：H2O＝1：15) ii. 總多醣測定[83] 根據 Phenol-sulfuric acid method 測定。取樣品 200μL 加入 200μL 5％ phenol slon.及 1ml H2SO4，小心混合，靜置 30 分鐘後利用分光光 度計測 490 nm 之吸光值，與標準溶液之吸光值對照換算得知總多醣 含量。. 36.
(44) iii. 總多酚含量測定[84] 取樣品 1mL 加 5mL 水及 0.5mL Folin-Ciocalteus reagent，充分震 盪後靜置 5 分鐘，加入 0.5mL 20％ Na2CO3，混合後作用 2 小時，利 用分光光度計在 750nm 下測吸光值，以 gallic acid 為標準，利用標 準取線得到的斜率，依照公式計算濃度。 3. 毛木耳萃取液抗氧化活性測定 一、. 清除 DPPH 自由基能力測定[85] 取樣品 1mL 加 1mL 水及 0.2ml 5mM DPPH 在室溫下反應 30 分. 鐘，利用分光光度計測 517nm 之吸光值，與標準溶液之吸光值對照 換算得知清除 DPPH 自由基能力。 二、. 還原力測定[86] 取樣品 0.1mL 加 1mL working reagent（Acetate buffer：TPTZ：. FeCl3．6H2O = 10：1：1） ，在 37℃下反應 15 分鐘，利用分光光度計 測 592nm 之吸光值，與標準溶液之吸光值對照換算得知還原能力。 三、. 總抗氧化能力測定[87] 根據 trolox equivalent antioxidant capacity 方法，取 100μL 稀釋後. 的 ABTS＋及 10μL 樣品反應 15 分鐘後，用分光光度計測 734nm 之吸 光值，與標準溶液之吸光值對照換算得知總抗氧化力。. 37.
(45) 二、. 血漿分析. 1. 天門冬胺酸轉胺脢(aspartate aminotransaminase，以下簡稱 AST) AST 測定是使用 DiaSYS 的商業組合試劑（Holzheim, Germany）。 AST 是將 L-aspartate 及 α- ketoglutarate 轉變為 oxaloacetate 及 L-glutamate 的酵素。oxaloacetate 與 NADH 經由 MDH （malate dehydrogenase）作 用形成 NAD+，而 AST 酵素活性是利用分光光度計測 NADH 氧化成 NAD+在 340nm 下其吸光值的減少速率變化量。. 2. 丙胺酸轉胺脢(alanine aminotransaminase ，以下簡稱 ALT) ALT 測定是使用 DiaSYS 的商業組合試劑（Holzheim, Germany）。 ALT 是將 L-alanine 及 α- ketoglutarate 轉變為 pyruvate 及 glutamate 的酵 素。pyruvate 與 NADH 經由 LDH （lactate dehydrogenase）作用形成 NAD+，而 ALT 酵素活性是利用分光光度計測 NADH 氧化成 NAD+在 340nm 下其吸光值的減少速率變化量。. 38.
(46) 3. 血漿總膽固醇（total cholesterol，以下簡稱 TC） TC 的測定是使用 DiaSYS 的商業組合試劑（Holzheim, Germany）。 原理是利用 enzymatic colorimetric method（CHOP-PAP 法） ，將定量的血 漿加入呈色劑以 37℃水浴 5 分鐘，利用 cholesterol hydrolase、CHO （cholesterol oxidase） 、POD（peroxidase）與樣品中的 cholesterol 及 CHE （cholesteryl ester）作用，生成紅色的 4-（p-benzoquinone-mono-imino） 化合物，利用分光光度計在 500 nm 測其吸光值，再與標準溶液之吸光 值對照換算得知 TC 的濃度。. 4. 三酸甘油酯（triglyceride，以下簡稱 TG） TG 的測定是使用 DiaSYS 的商業組合試劑（Holzheim, Germany）。 原理是利用 LPL（lipoprotein lipase）將 TG 分解產生 glycerol，glycerol 經由 GK（glycerokinase）作用產生 G-3-P（glycerol-3-phosphate） ，G-3-P 經由 GPO（glycerol-3-phosphate-oxidase）作用產生過氧化氫（H2O2）， H2O2 與 aminoantipyrine、4-chlorophenol 經由 POD（peroxidase）反應形 成 quinoneimine。TG 的測定是利用分光光度計在 500nm 下測吸光值， 再與標準溶液之吸光值對照換算得知血漿 TG 的濃度。 39.
(47) 5. 高密度脂蛋白膽固醇（high dencity lipoprotein-cholesterol，以下簡 稱 HDL-C） HDL-C 的 測 定 是 使 用 DiaSYS 的 商 業 組 合 試 劑 （ Wiesbaden, Germany）。原理是利用第一步驟去除 LDL, VLDL and chylomicrons，在 經第二步驟呈色後，利用分光光度計測其在 593nm 之吸光值，再與標準 溶液之吸光值對照換算得知血漿 HDL-C 的濃度。 ＊1st step. ＊2nd step:. 40.
(48) 6. 低密度脂蛋白 （low dencity lipoprotein-cholesterol，以下簡稱 LDL-C） LDL-C 的 測 定 是 使 用 DiaSYS 的 商 業 組 合 試 劑 （ Wiesbaden, Germany） 。原理是利用第一步驟去除 HDL, VLDL and chylomicrons，在 經第二步驟呈色後，利用分光光度計測其在 593nm 下之吸光值，再與標 準溶液之吸光值對照換算得知血漿 LDL-C 的濃度。 ＊1st step:. ＊2nd step:. 7. 極低密度脂蛋白（Very low dencity lipoprotein-cholesterol，以下簡稱 VLDL-C） 本實驗以功式計算方式求出極低密度脂蛋白膽固醇之濃度。 極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)＝總膽固醇（TC）－高密度脂蛋白 （HDL-C） －低密度脂蛋白（LDL-C）. 41.
(49) 8. 空腹血糖（glucose AC） glucose AC 的測定是使用 DiaSYS 的商業組合試劑（Holzheim, Germany）。原理是利用 GOD（glucose oxidase）作用將 glucose 氧化產 生 H2O2，H2O2 與 4-aminoantipyrine、phenol 經由 POD（peroxidase）反 應形成 quinoneimine。glucose AC 的測定是利用在 500nm 下測吸光值的 變化量。. 9. 血漿胰島素測定 使用市售試劑組(Rat Insulin ELISA,Mercodia AB,Uppsala,Sweden)以 酵素免疫分析法(ELISA)，在波長 450nm 下，與標準溶液之吸光值對照 並換算得知血漿胰島素濃度。. 10.維生素 E（Vitamin E）[88] 取 200μL 血漿加入 300μL 50μg/mL α-tocopheryl acetate，充分震盪 1 分鐘，再加入 600μL hexane 充分震盪 2 分鐘，於 4℃下，以 10,621g 離 心 10 分鐘，收集上層液至另一微量離心管，重複上述步驟兩次，三次 的萃取液以真空抽乾，加入 350μL methanol 回溶，用真空過濾裝置 （Vacuum Manifold, MultiScreenTM HTS）0.45μm 過濾，然後注射 80μL 到 HPLC 中分析。血漿維生素 E 濃度，利用標準取線得到的斜率，依照 42.
(50) 公式計算濃度。最後血漿維生素 E 濃度表示為 μL/mL plasma 表示。 ＊ HPLC 條件如下 儀器：L-7100 pump（Hitachi） 、 L-7420 UV-VIS detector（Hitachi） 管柱：C-18, 5μm, 25cm×4.6mm 移動相：methanol: H2O＝98：2 波長：290nm. 11.維生素 C（Vitamin C）[89] 取 100ul 血漿加入 900ul 4℃的 Methanol，充分震盪 20 秒，以 10000g 離心 3min，收集上層液，用真空過濾裝置（Vacuum Manifold, MultiScreenTM HTS）0.45μm 過濾，並保存於-20℃直到注射到 HPLC 中 分析，注射 50μL 到 HPLC 中分析。血漿維生素 C 濃度，利用標準取線 得到的斜率，依照公式計算濃度。最後血漿維生素 C 濃度表示為 μM plasma 表示。 ＊ HPLC 條件如下 儀器：L-7100 pump（Hitachi） 、 L-7420 UV-VIS detector（Hitachi） 管柱：C-18, 5μm, 25cm×4.6mm 移動相：methanol: H2O:acetic acid glacial＝80：17.5：2.5. 43.
(51) 波長：254nm. 12.TBARS（thiobarbituric acid reactive substance）[90] 取 100μL 加入 4mL 0.22％ H2SO4、0.5mL 10％phosphotungstic acid、 1mL 0.67％thiobarbituric acid（溶於 H2O：GAA＝1：1），於 95℃水浴 1 小時，冰浴後加入 3mL butanol 進行萃取，在 4℃下 離心 15 分鐘，取上層液於螢光光度計 Ex515 nm/Em555 nm 下測其 含量。. 13.血漿脂肪酸分析[91] 第一步加入 200μl 血漿以 methanol、chloroform（3：4.5 by volume） 做粗脂質的萃取，所取得之萃取液予以真空抽氣抽乾後秤重即為粗脂肪 重 。 第 二 步 加 入 內 部 標 準 品 （ 17 ： 0, heptapalmitic acid ）、 12 ％ BF3-methanol（boron trifluoride- methanol），於 96℃下加熱 30 分鐘進行 脂質甲酯化反應，加入 pentane 於 4℃、3, 220 g 離心 20 分鐘後，取其上 清液後抽乾，溶於定量之 hexane 後，以氣相層析儀分析其脂肪酸組成。 ＊ 氣相層析儀條件如下 儀器：Trace GC 管柱：30m×0.32m×0.2μm 90％biscyanopropyl/10％. 44.
(52) phenylcyanipropyl polysiloxane 氮氣流速：30ml/min（spilt ratio ＝ 1：10） FID 檢測器：H2 流速 30ml/min，Air 流速 350 ml/min 積分儀：Chrom-Card 管柱溫度：160℃-240℃，每分鐘上升 1.5℃之速度至 240℃， 維持 10 分鐘 注入溫度：260℃ 檢測器溫度：260℃. 三、. 肝臟分析. 1. 病理切片製作 動物犧牲後，摘除肝臟並以 0.9%生理食鹽水灌流肝門靜脈後，以生 理食鹽水清洗，剝除多餘的結締組織，秤重並剪取最大葉肝臟，浸泡於 10%福馬林中後，送至中國醫藥大學附設醫院病理科以進行組織的脫水、 清洗、浸潤以及包埋等步驟，最後製成石蠟切片進行蘇木紫-伊紅染色 (haematoxylin&eosin stain)及 Masson’s trichrome stain 作為病理方面的觀 察，每個切片分成五個區域來觀察並記錄每個區域的分數以做統計。 依據 Brunt 等法，脂肪堆積分為 0~3 等級[10] Grade 0：含明顯脂肪顆粒之細胞佔肝臟細胞面積的 0% 45.
(53) Grade 1：含明顯脂肪顆粒之細胞佔肝臟細胞面積的 33%以下 Grade 2：含明顯脂肪顆粒之細胞佔肝臟細胞面積的 33~66% Grade 3：含明顯脂肪顆粒之細胞佔肝臟細胞面積的 66%以上 依據 Brunt 等法，發炎細胞分為 0~3 等級[10] Grade 0：沒有發炎細胞浸潤 Grade 1：1-2 foci/field Grade 2：2-4 foci/field Grade 3：more than 4 foci/field.. 2. 肝臟膽固醇濃度之測定 前製備 將冷凍的肝臟取出解凍，剪取 0.5g 肝臟組織，加入萃取溶劑 2 ㏄(chloroform:methanol=2:1,v/v)，在冰浴中以均質機磨碎後儲存於-20℃ 以待日後分析用。 取肝臟萃取液 10μL，加入 Triton-x-100，均勻混勻後以減壓濃縮機 抽乾，以市售試劑組(Rendox CH201;Antrim,U.K.)進行分析。加入反應劑 1000μL 混勻後在 37℃下以乾熱器加熱 5 分鐘，以分光光度計在波長 500nm 下測量吸光值，利用標準曲線換算出肝臟膽固醇濃度。 3. 肝臟三酸甘油酯濃度之測定 前製備 46.
(54) 將冷凍的肝臟取出解凍，剪取 0.5g 肝臟組織，加入萃取溶劑 2 ㏄(chloroform:methanol=2:1,v/v)，在冰浴中以均質機磨碎後儲存於-20℃ 以待日後分析用。 取肝臟萃取液 10μL，加入 Triton-x-100，均勻混勻後以減壓濃縮機 抽乾，以市售試劑組(Rendox TR213;Antrim,U.K.)進行分析。加入反應劑 1000μL 混勻後在 37℃下以乾熱器加熱 5 分鐘，以分光光度計在 500nm 波長下測量吸光值，利用標準曲線換算出肝臟三酸甘油酯濃度。. 4. TBARS（thiobarbituric acid reactive substance）[90] 剪取 0.5g 肝臟組織，加入萃取溶劑 2 ㏄(chloroform:methanol=2:1,v/v)， 取均質液進行 TBARS 測定，測定方法同血漿中測定 TBARS 之方法。. 5. 肝臟細胞質(Cytosol)及微粒體(Microsome)之製備 取 1 克肝臟於離心管中，加入 4 毫升 0.01M phosphate buffer(1 公升 含 1.068g K2HPO4、0.52gKH2PO4、11.5gKCl，pH7.4)均質後，離心 3000g 15 分鐘，吸取上層液，再以 10000g 離心 30 分鐘，最後以超高速離心機 離心(32000g 、1 小時)，將上清液移至 1.5ml 離心管，此部分即為細胞 質，而附著於超高速離心管壁的顆粒即為微粒體，加入 1ml microsome suspension buffer(1 公升含 6.23g K2HPO4、1.94g KH2PO4、0.37gEDTA， pH7.7)放置於-80 以待日後分析。. 47.
(55) 6. 肝臟 Glutathione Peroxidase 之活性測定 原理. 本實驗採商業分析套組(Glutathione Peroxidase assay kit, Cayman, Ann Arbor, MI, USA)分析 GPx 之活性。本套組利用 Glutathione reductase 之作用間接測量 GPx 之活性 。當 GPx 將氫過氧化物 H2O2 (Hydroperoxide) 轉換成 H2O，並將還原型 GSH 代謝成氧化型 GSH，而 GSSG 則需靠 GR 以 NADPH 當輔酶轉換成 GSH，因此酵素活性分析是在 H2O2 當受值時， 利用分光光度計以 340nm 波長測量計算 NADPH 減少的速度，間接求出 GPx 的活性，nmol/min/mg protein 表示。 計算方式: ∆A340 /min. =. A340 (Time 2) − A340 (Time 1) Time 2(min.) − Time 1(min. ). GPx activity =. ∆A340 /min. 0.19ml × × Sample dilution ÷ Total protein −1 0.00373M 0.02ml. 48.
(56) 7. 肝臟 Glutathione reductase 之活性測定 原理. 本實驗採商業分析套組(Glutathione reductase assay kit, Cayman, Ann Arbor, MI, USA)分析 GR 之活性。GR 主要可將 GSSG 還原成 GSH，以 維持細胞內 GSH 脂濃度，進而對抗氧化壓力。本套組利用 NADPH 氧 化之速率測定 GR 之活性。當 GSH 被氧化為 GSSG 時，GR 與 NADPH 便會再將 GSSG 還原回 GSH，且 NADPH 會氧化成 NADP+，於波長 340nm 下之吸光值會隨時間增加而遞減，及吸光值減少之速率與 GR 之活性成 比例關係，單位以 nmol/min/mg protein 表示。 計算方式: ∆A340 /min. = GR activity =. A340 (Time 2) − A340 (Time 1) Time 2(min.) − Time 1(min. ). ∆A340 /min. 0.19ml × × Sample dilution ÷ Total protein −1 0.00373M 0.02ml. 49.
(57) 8. 肝臟 Superoxidase dismutase(SOD)之活性測定 原理. 本實驗採商業分析套組(Superoxidase dismutase assay kit, Cayman, Ann Arbor, MI, USA)分析 SOD 之活性。SOD 是含有金屬之抗氧化酵素， 主要可將超氧陰離子(O2.-)轉變成 H2O2 與 O2，在細胞內重要抗氧化防禦 機制上扮演重要角色。本套組利用 Tetrazolium salt 之作用測定 SOD 之 活性。當 xanthine oxidase 存在下，O2 會轉變成 O2.-，此時 Tetrazolium salt 會與 O2.-結合並產生黃色物質 Formazan dye，以測定 SOD 清除 O2.-之活 性，在波長 450nm 下測定吸光值。單位以 U/mg protein 表示。. 9. 肝臟 Catalase 之活性測定 原理. 本實驗採商業分析套組(Catalase assay kit, Cayman, Ann Arbor, MI, USA)分析 Catalase 之活性。Catalase 普遍存在生物體內之抗氧化酵素， 其主要可清除細胞內之過氧化氫(H2O2)與活性氧物質(ROS)。本套主利用 Catalase 之過氧化功能來測定其活性。在 H2O2 存在下，含有甲醇的酵素 會 與. H2O2 形 成 甲 醛 (Formaldehyde) 會 與 特 殊 成 色 劑. Purpald(4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-trizole) 形 成 一 含 有 50.
(58) Aldehydes 之雙環結構，並隨著氧化反應而從無色液體轉變成紫色之測 試液，在波長 540nm 下測定吸光值，算出肝臟中 Catalase 的活性，單位 以 μmol/min/mg protein 表示。 計算方式: Catalase activity =. formaldehyde(μM) × sample dilution ÷ Total protein 20min. 10. 肝臟 TNF-α 含量之測定 操作原理 實驗採商業分析套組(Rat tumor Necrosis Factor alpha ELISA kit, ASSAYPRO, Winfield, Mo, USA)來分析肝臟 TNF-α 的含量。本套組利用 三明治酵素免疫分析法(Sandwish enzyme immunoassay)來測量 TNF-α 含 量，老鼠單株抗體特異性老鼠的 TNF-α 已預先 coating 在九十六孔盤上， 利用 immobilized antibody 及 biotinylated 多株抗體的三明治酵素免疫法 去 特 異 性 結 合 TNF-α 標 準 品 及 樣 品 的 TNF-α 含 量 ， 用 Streptavidin-peroxidase conjugate 來識別，其他未結合的物質利用 wash buffer 沖洗掉，並加入 peroxidase enzyme substrate，最後於波長 450nm 下測得吸光值。. 51.
(59) 11. 肝臟 IL-6 含量之測定 操作原理 實驗採商業分析套組(Rat IL-6 Platinum ELISA kit, eBioscience, BMS625TWO, RUO,USA)來分析肝臟 TNF-α 的含量。本套組利用三明治 酵素免疫分析法(Sandwish enzyme immunoassay)來測量 IL-6 含量，老鼠 單株抗體特異性老鼠的 IL-6 已預先 coating 在九十六孔盤上，血漿中的 IL-6 含量會和孔盤上的 IL-6 抗體結合後再加入 Biotin-Conjugate 作為一 抗 ， 用 Wash buffer 將 多 餘 的 Biotin-Conjugate 一 抗 洗 掉 再 加 入 Streptavidin-HRP 和一抗結合，用 Wash buffer 將多餘的 Streptavidin-HRP 洗掉後加入 Tetramethyl-benzidine 產生紫色色澤，加入 Stop solution 來終 止反應，最後用波長 450nm 下測得之吸光值回推測得吸光質回推標準曲 線測得樣品 IL-6 含量。 12. 肝臟 CYP4A 蛋白質之表現量 將肝臟微粒體蛋白質定量後調整至 1μg/μl，取 10μl 樣品加入等體 積 sample buffer 均勻混合 ，於 95℃條件下加熱 5 分鐘，之後轉移至 10% acrylamide gels 樣品槽中，以 130 伏特電壓進行電泳分析。 西 方 墨 點 法 (Western blotting) 與 免 疫 分 析 : 電 泳 完 成 後 先 切 除 stacking gel ， 同 時 截 取 一 片 separating gel 大 小 相 同 之 轉 印 模 (polyvinylidene difluoride membrane,PVDF) ， 將 此 膜 先 浸 泡 於 95% methanol 5 分鐘，浸泡後依序將海綿、濾紙、separating gel、PVDF 膜、 濾紙、海綿放置於三明治式塑膠板中，隨即放入轉印槽以 400mA 下轉 印 1 個半小時，轉印完成後將 PVDF 膜取出放入含 10%脫脂奶粉的 52.
(60) blocking buffer 1 個小時，取出後以 wash buffer 沖洗三次，每次 5 分鐘， 再以 PBS 稀釋 1000 倍的 CYP4A 一級單株抗體至於室溫下 1 小時；之 後取出之 PVDF 膜同樣以 wash buffer 沖洗三次，每次 5 分鐘，再加以 PBS 稀釋 10000 倍的二級抗體至於室溫下反應 1 小時；以 wash buffer 沖洗三次，每次 5 分鐘；最後加入 1ml 的顯色劑，經適當時間反應後陰 乾以 Image Gauge 軟體分析其蛋白質表現量。. 13. 脂肪酸分析[91] 第一步以取 0.25g 肝臟加入 1c.c. methanol 作粗脂質的萃取，所取 得之萃取液予以真空抽氣抽乾後秤重即為粗脂肪重。第二步利用 aminopropanol silica column 萃出紅血球磷脂質。第三步加入內部標準品 （17：0, heptapalmitic acid）、12％ BF3-methanol（boron trifluoridemethanol），於 96℃下加熱 30 分鐘進行脂質甲酯化反應，加入 pentane 於 4℃、3,220 g 離心 20 分鐘後，取其上清液後抽乾，溶於定量之 hexane 後，以氣相層析儀分析其脂肪酸組成。 氣相層析儀條件：同血漿脂肪酸分析。. 53.
(61) 第四節 統計分析 實驗結果以 SPSS12.0 軟體進行統計，以 One-way ANOVA 進行分析， 數據以平均值及標準偏差(mean±SEM)，p＜0.05 代表有顯著差異。. 54.
(62) 第六章 結果 一、. 非酒精性脂肪肝炎的模式誘發. 在預實驗方面，經過餵食高脂飲食飼料四週後，實驗動物肝切片圖 見圖十七，結果顯示，和 Control 組(Grade 0)相比，餵食四週的高脂飲 食老鼠顯著增加肝臟中脂肪滴泡(Grade 2)及發炎細胞含量(Grade 2) (P＜ 0.05)。 本研究顯示，餵食高脂飲食的老鼠(HFD、HC、HO、LO 組)和 Control 組相比，如表八所示，肝損傷指標方面，餵食高脂飲食的老鼠和 Control 組相比，血中 AST 及 ALT 顯著增加(P＜0.05)；在血漿脂質方面，如表 九所示，餵食高脂飲食的老鼠血中總膽固醇、三酸甘油酯、低密度脂蛋 白皆顯著高於 Control 組(P＜0.05)，而血漿中高密度脂蛋白膽固醇顯著 降低(P＜0.05) ；空腹葡萄糖、游離脂肪酸及血漿脂質過氧化作用方面， 如表十所示，餵食高脂飲食的老鼠血中空腹葡萄糖、游離脂肪酸及血漿 脂質過氧化作用皆顯著高於 Control 組(P＜0.05)，這些結果顯示，實驗 動物在餵食八週的高脂飲食後造成非酒精性脂肪肝炎，意即本研究所採 取的飲食誘導模式可以有效引發實驗動物非酒精性脂肪肝炎。. 二、. 毛木耳萃取物成分分析、抗氧化活性. 如表十一所示，毛木耳萃取物中所含脂肪、粗纖維、蛋白、粗灰份 及醣類分別佔乾重的 1.36％、89.77％、5.15％、1.92％及 1.80％。而毛 木耳萃取物中總多酚（total phenol） 、總黃 酮 (total flavone)及單寧（tannin） 含量分別是 9.10±0.08（mg gallic acid /g）、8.49±0.07（mg quercetin /g） 55.
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