行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
細胞電泳行為之研究：實驗、理論與應用--子計畫二:細胞
電泳行為之研究：理論與實驗測試(2/2)
研究成果報告(完整版)
計 畫 類 別 ： 整合型 計 畫 編 號 ： NSC 95-2627-B-002-008- 執 行 期 間 ： 95 年 08 月 01 日至 96 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立臺灣大學化學工程學系暨研究所 計 畫 主 持 人 ： 徐治平 計畫參與人員： 博士班研究生-兼任助理：葉禮賢、葉禮賢 碩士班研究生-兼任助理：陳旂瑩、丁和國、黃治華 博士後研究：鄒光耀 處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 96 年 07 月 16 日
細胞電泳行為之研究：理論與實驗測試(2/2)
Electrophoretic Behaviors of Cells: Theory and Experimental (2/2)
計畫編號: NSC95-2627-B-002-008 執行期限: 95/08/01-96/07/31 主持人: 徐治平 臺灣大學化工系 教授 一、中文摘要 本研究以人類肝癌細胞 HepG2 為研究對象，同時進行細胞電泳實驗與數值模擬。實驗結 果顯示，HepG2 肝癌細胞在 pH 值 4 附近存有一等電位點，這表示此種細胞表面至少各含有 一酸性及鹼性官能基。數值模擬配合實驗量測的結果則顯示，忽略離子體積效應會低估細胞 表面官能基的密度及二價陽離子與細胞表面官能基之鍵結常數，但不影響酸鹼官能基解離常 數的大小。 關鍵詞: HepG2 肝癌細胞；電泳；離子體積效應 二、計畫緣由與目的 於亞洲大部份地區，肝癌為首三種致命 癌症，預計全球每年均有550,000人死於肝 癌，當中約360,000死亡病例來自東亞地區。 因此，近年來的學者無不積極投入研究人類 肝癌細胞HepG2的行列，以期待能研發出新 的藥物來有效治療肝癌患者，降低死亡率。 對於部份肝臟已被切除的肝癌患者，則必須 使用生物性肝臟支持系統(BLSD)來輔助病人 所餘肝臟的運作，以避免肝昏迷的情況發 生。目前幾乎所有的生物性肝臟支持系統都 包含三個部份：生物性元件、生物反應器及 血液或血漿灌流系統。在生物性元件部份， 理論上人類肝細胞是人工肝臟最理想的填充 組織，但由於人肝短缺，科學家們便積極發 展初代人肝細胞株。其中，最受到矚目且已 被應用於臨床上的，就是由人類肝癌細胞 HepG2經過DNA複製及改質所分化出的C3A 細胞株。C3A 細胞株具有正常肝細胞功能、 所需細胞增殖時間短等優點，但如果此種細 胞在治療時不小心進入病人循環系統，則可 能對病人造成危害。由上述可知，在發展正 常人類肝臟細胞株未有顯著突破的同時，肝 癌細胞HepG2所分化的細胞株可視為現今人 工肝臟的細胞主要來源。 細胞電泳是指生物細胞於外加電場的作 用下，在電解質溶液中產生相對於靜止流體 移動的現象，通常用於鑑定生物細胞的表面 特性。對於生物細胞而言，其表面電荷、表 面電位和薄膜內官能基的解離程度有關，因 此，傳統的電泳理論對於帶薄膜的生物細胞 並不適用。1,2 後期的學者，則同時以實驗和 模擬的方式分析生物細胞的電泳行為，並將 所得的結果和 Smoluchowski 所導的電泳公式 相比較，以探討之間的差異。3-6 基於上述的 觀察，Levine 首先嘗試以一平板表面帶有離 子可穿透薄膜且有固定電荷分佈於內的模型 來探討紅血球的電泳行為，其所得到的電泳 遷移率較小於 Smoluchowski 公式所得到的結 果。7接著 Ohshima 與 Kondo 改善此模型並推 導出較簡單的解析解，但僅適用於對稱電解 質溶液。8 Tseng 則加以考慮電荷可調整的模 型，並討論 pH 值和離子強度對細胞電泳遷移 率的影響。9然而，上述學者的研究結果皆以 傳統 Gouy-Chapman theory (GCT) 假設為基 礎，即將溶液中的離子視為點電荷。反之， 要接近真實的情況則必須考慮了離子體積效 應的影響，即 Modified Gouy-Chapman theory (MGCT) 。Valleau 與 Torrie 在處理一帶電平 板浸在完全解離的電解質溶液中的問題時， 發現 MGCT 的結果和利用 Monte Carlo 方法 模擬的結果相符。10 由於相關HepG2肝癌細胞表面性質的研 究至今仍相當缺乏，本研究便以此細胞為研 究對象，同時進行細胞電泳實驗與數值模擬 以探討其表面特性，所獲得的結果將可提供 我們另一種角度去預防或治療肝癌患者。 三、理論與實驗方法 1. 理論模型 如圖 1 所示，我們考慮一表面覆蓋有離 子可穿透性薄膜的平板來模擬 HepG2 肝癌細 胞，假設細胞薄膜內的固定電荷來自於薄膜 內酸鹼官能基的解離，且緩衝溶液中存在一 價和二價陽離子。
Figure 1. Schematic representation of the problem con-sidered, where an electric field E parallel to the surface of a cell is applied, U0 is the electrophoretic velocity of
the cell, and d is the thickness of membrane layer. The direction of U0 implies that the surface of the cell
con-tains negative fixed charge. Ion sizes are considered, and the system contains Ca2+ or Mg2+.
根據 Possion 方程式，用來描述薄膜內外 的電位方程式為 d x x x dx d fix f el + ≤ ≤ − = 1[ ( ) ( )] , 0 1 2 2 ρ α ρ ε φ (1a) ∞ ≤ ≤ − = x d x dx d el , ) ( 2 2 2 ε ρ φ (1b) 其中，φ為電位，各α值為各離子之區域變 數，該離子存在時α=1，反之α=0。d 為薄 膜厚度，ρel和ρfix為自由電荷密度與膜內固 定電荷密度，ε1和 ε2分別為薄膜內外的介 電常數。假設溶液中的離子呈 Boltzmann 分 佈，則ρel可表示為 ] ) exp( ) exp( ) exp( ) exp( ) exp( [ 0 0 0 0 0 term buffer RT F C RT bF bC RT F C RT cF cC RT aF aC F buffer OH OH b b H H c c a a el α φ α φ α φ α φ α φ α ρ + − − − + − + − = − − + + (2) 其中，a、c和b 分別為一、二價陽離子價數 和一價陰離子價數， 0 a C 、 0 c C 、 0 b C 、 0 + H C 、 0 − OH C 分別為在體溶液中，一、二價陽離子濃度、 一價陰離子濃度、氫離子濃度、和氫氧根離 子濃度，F、R、T 分別為法拉第常數、氣體 常數、絕對溫度。 假設薄膜內存在均勻分佈之酸鹼官能 基，H2A 與 BH+，且二價陽離子 M2+會和解離 後帶負電的官能基發生鍵結反應。若 Nma及 Nmb分別代表於薄膜內酸鹼官能基的密度，經 整理後可得ρfix的表示式為 ) 2 ( / 1 2 2 2 2 2 1 1 1 2 1 1 2 2 1 1 1 1 1 + + + + + + + + + + + + + − − + + = M m a a M H m a a a H a H a a H a M H m a ma H b mb fix C K K K C C K K K K C K C K K C K C C K K FN C K FN ρ (3) 其中， HA HA H a C C /C K 2 1= + − 與Ka2 =CH+CA2−/CHA− 為 酸一次、二次解離常數，Kb1=CH+CB/CBH+為鹼 一 次 解 離 常 數 ， Km1=CHAM+ /CHA−CM2+ 與 + − = / 2 2 2 MA A M m C C C K 為二價陽離子一次、二次鍵 結常數。 接著考慮系統中的流體為不可壓縮之牛 頓流體，使用 Navier-Stokes 方程式描述為 d x E x fu dx u d el = ≤ ≤ + − ( ) 0 , 0 2 2 1 ρ η (4a) ∞ ≤ ≤ = + x E d x dx u d el( ) 0 , 2 2 2 ρ η (4b) 其中，η1與 η2為薄膜內外液體的黏度，E 為所施加平行於平板表面的電場強度，f 為薄 膜內的摩擦係數。最後利用有限元素數值方 法，將適當的電位與流速邊界條件分別帶入 主控方程式(1)與(4)，即可求得生物細胞的電 泳遷移率μ=-U0/E。 2. 實驗方法 本研究利用電泳裝置(Malvern Zeta-sizer 3000) 量測 HepG2 肝細胞電泳遷移率的數 值。操縱變因包括：溶液的 pH 值、離子強度 及二價陽離子的種類。實驗步驟如下： (1) 配製含有 2.5 mM NaCl、2.0 mM CaCl2、 280 mM glucose 、 10 mM buffer NH2C(CH2OH)3 (pH 7 to 9)或 Na-acetate (pH 4 to 6)的 basic solution，同時使用稀 釋過後的 HCl (pH ≅ 0.5)調整溶液至不同 的 pH 值。其中使用 glucose 的目的為使 溶液的滲透壓維持恆定。 (2) 實驗所使用的儀器為 Malvern Zeta-sizer 3000，首先熱機 10 min 並事先鍵入溶液 的資料，包括介電常數、黏度及溫度。 (3) 於培養液中取出適量的 HepG2 細胞，並 加入預先配製的 basic solution，調整細胞 的個數濃度約為 30 萬個/10 cc 左右，靜置 5 min 後即可開始測量。 (4) 使用針筒吸取適量於步驟 3 中所配製好
之溶液，直接注入儀器的電泳槽中，注射 過程必須避免產生氣泡，之後即可測量溶 液的電泳遷移率及 zeta 電位。 (5) 每次實驗後必須注入去離子水清洗電泳 槽，才可繼續其他實驗。 (6) 改變溶液中的二價陽離子(Ca2+)濃度，分 別為 0.05、0.5、1.0、2.0、5.0 mM，並調 整 glucose 的濃度使溶液滲透壓維持恆 定。實驗中，固定 basic solution 的 pH 值 約 7.2 左右，重複步驟 3-4。 (7) 改 變 二 價 陽 離 子 的 種 類 (Mg2+ 、 Hexamethonium)，重複上述實驗，測量在 不同混合電解質溶液中細胞電泳遷移率 的變化情形。 四、結果與討論 模擬結果顯示，離子體積所產生的效應 可以分為兩部分：(1) 因為電解質離子考慮體 積時進入薄膜內的數量相較於忽略體積時減 少，使得遮蔽效應變小，而|μ|變大；(2) 考 慮解離官能基體積時其數量相較於忽略體積 時減少，使得帶電量減少，而|μ|變小。如圖 1 所示，當解離官能基體積還小時，|μ|受到 上述第一部分之影響較劇，因此|μ|較忽略離 子體積效應時來的大；當解離官能基體積漸 漸增大，上述第二部分之影響變大，因此|μ |較忽略離子體積效應時來的小；整體來看， 當解離官能基體積漸漸增大時，|μ|會持續變 小。圖 3 則呈現一價陽離子體積對μ的影響， 當一價陽離子體積愈大，能進入薄膜內的一 價陽離子數量減少，使得遮蔽效應變小，造 成|μ|愈大；相反地，當一價陰離子體積愈大 時，|μ|愈小。 利用擬合方法來獲得 HepG2 肝癌細胞表 面性質的步驟為：使用實驗中含有機二價陽 離子時其與薄膜內官能基之鍵結常數為 0 來 當做數據擬合的開端，先找出無鍵結時其他 參數之大小，包含薄膜厚度d、酸鹼官能基密 度Nma、Nmb和解離常數Ka1、Kb1，再利用實 驗數據找出 Ca2+與 Mg2+之鍵結常數。擬合的 實例(Ca2+ )如圖 4 與 5 所示。 利用上述擬合方法，表 1 列出所有相關 HepG2 肝癌細胞表面性質的參數值。由此表 的結果可以發現，忽略離子體積會低估薄膜 內官能基密度以及二價陽離子鍵結常數，但 不影響酸鹼官能基的解離常數。
Figure 2. Variation of mobility as a function of fixed charge size for the case when pH=10. Discrete symbols, ionic sizes considered, curve, ionic sizes neglected. Pa-rameters used are, T=298 K, ε1=ε2=78.5x8.854x10-12
C/V-m, η1=η2=8.91x10-4 Ns/m2, f=1x1010 Ns/m4, E=800
V/m, d=60Å, Nma=6.2 mM, Nmb=8.7 mM, Ka1=2.51 mM,
Ka2=0, Kb1=2.5x10-2 mM, Km1=0, and Km2=0.
Figure 3. Variation of mobility as a function of scaled effective radius of monovalence cations xa. Parameters
are the same as in Fig. 2.
Figure 4. Variation of the mobility of HepG2 cells as a function of pH for the case when cell suspension contains 2.5 mM NaCl, 2 mM Ca2+, and 280 mM glucose. pH is
buffered by either 10 mM NH2C(CH2OH)3 (pH 7 to 9) or
Na-acetate (pH 4 to 6). Discrete symbols, experimental data, the width of error bar represents two standard de-viations. Solid curve, simulated result, ionic sizes con-sidered with Km1=2.5x10-2 mM-1 and other paramethers
the same as in Fig. 2..
Figure 5. Variation of the mobility of HepG2 cells as a function of the concentration of Ca2+. pH is buffered at about 7.2 by 10 mM NH2C(CH2OH)3. Discrete symbols,
experimental data, the width of error bar represents two standard deviations. Solid curve, simulated result, ionic sizes considered with Km1=2.5x10-2 mM-1 and other
pa-ramethers the same as in Fig. 2.
Table 1. Summary of the results of fitting parameters.
五、參考文獻
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