中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/32345

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通識教育學報第九期第 245 至 257 頁 2006 年 6 月中國醫藥大學通識教育中心

熊果酸及齊墩果酸誘導人類肺癌細胞凋亡

黃雯雯1、楊家欣2、何偉真3 1 中國醫藥大學通識教育中心助理教授 2_{元培科學技術學院助理教授} 3_{大葉大學生物資源系教授}

摘要

熊果酸 (ursolic acid)及齊墩果酸 (oleanolic acid) 皆屬 pentacyclic triterpene 化合物，有研究顯示此類化合物具細胞毒殺作用 (cytotoxicity)，可誘導細胞分化 (differentiation)，並有抗突變 (antimutagenic)作用及抗病毒 (antiviral)等活

性。我們研究發現ursolic acid 對人類血癌細胞株 (K562，U937)，人類大細胞

肺癌株 (NCI-H460)，人類肺癌鱗狀上皮細胞株(CH-27)，人類肺癌細胞株(H1355)

皆具抑制效果，其中對CH-27 細胞株，NCI-H460 細胞株，H1355 細胞株，抑

制效果更為顯著，IC50分別為50、100 and 300 μg/ml；而 oleanolic acid 對上述

細胞株的毒殺作用似乎並不明顯。為更進一步探討熊果酸 (ursolic acid)之抗癌機制，因此我們以熊果酸處理CH27 細胞，進行 DNA 電泳分析，發現有 DNA 裂解現象，至於細胞周期試驗顯示無論是熊果酸還是齊墩果酸對CH27 細胞株的細胞周期無明顯滯留現象，顯示二者沒有抑制細胞周期的作用。經西方墨點法測試蛋白質，結果顯示Bcl-2 蛋白質的量隨處理時間增長而增加，而 Bax 蛋白質量則有下降的趨勢，顯示其抑制癌細胞生長的作用可能是藉由細胞凋亡 (apoptosis) 的途徑產生，造成凋亡的原因可能是透過與 Bcl-Xs 蛋白質相關機制，同時Bax 蛋白質量降低亦是熊果酸導致細胞凋亡的機轉之一，值得作更深入之探討。

關鍵字: 熊果酸 (ursolic acid)、齊墩果酸 (oleanolic acid)、人類肺癌細胞株、細胞凋亡(apoptosis)

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246 熊果酸及齊墩果酸誘導人類肺癌細胞凋亡

一、前言

我們在先前的實驗及文獻中發現茄科植物鈕仔茄

Solanum incanum

具有

對癌細胞生長抑制的作用1,2

，並富含熊果酸 (ursolic acid, UA)3

，此成分亦可在許多藥用植物中發現，因此我們即進行熊果酸 (ursolic acid)對癌細胞株毒殺作用之探討，將來或可作為部分抗癌中草藥的指標成分。熊果酸 (ursolic acid)為一種 pentacyclic triterpene 化合物，具細胞毒殺作用 (cytotoxicity)，可誘導細胞分化 (differentiation)，並有抗突變 (antimutagenic)作用及抗病毒 (antiviral)等活性4,5,6,7,8

。齊墩果酸(oleanolic acid, OA)的化學結構與熊果酸類似，文獻報導二者皆具抗發

炎、抗腫瘤作用 9 ，本研究將比較齊墩果酸及熊果酸對人類肺癌細胞的抑制作用，並深入探討其誘導癌細胞凋亡(apoptosis)之機轉。癌症一向是世界各國人口死亡的主因，國人癌症死亡人口亦長年居十大死亡原因之首，其中肺癌的發生率及致命率非常高，目前臨床上治療肺癌的方式主要是外科手術的切除、化學療法、放射線療法 10 ，此外，尚有高溫療法、免疫療法及中草藥療法等，但預後並不十分良好，因此為了發展更有效的治療方法，可能要對肺癌細胞的生長特性作更深入的了解。一般肺腫瘤可區分為二大類，其一為小細胞肺癌 Small cell lung carcinoma, SCLC)，另一種則為非小細胞肺癌 (Non-small cell lung carcinoma, NSCLC)。而非小細胞肺癌又包括鱗狀上皮細胞肺癌 (Squamous cell carcinoma, SQCC) 、大細胞肺癌 (Large cell carcinoma, LCC) 及腺細胞肺癌 (Adenocarcinoma, ADC)等，CH27 細胞株是由國人分離而來，屬鱗狀上皮細胞肺癌，藉由研究熊果酸及齊墩果酸對此癌細胞株 (CH27)之制作用或可對國人肺癌的治療有一些幫助。目前研究顯示細胞死亡的方式大致區分為幾類，其中細胞壞死 (necrosis) 和細胞凋亡 (apoptosis)最為人知。細胞壞死為被動式死亡，細胞受到突然的嚴重傷害時，會使細胞內粒線體 (mitochondrion) 漲大，細胞無法調節滲透壓而細胞膜破裂溶解，細胞內溶解酵素 (lysosomal enzymes) 大量釋出，周圍組織細胞產生發炎反應。至於細듳凋亡則是有計畫性的死亡，是細胞在正常狀態下所發生有程序性的死亡過程。細胞凋亡時，細胞會有細胞膜皺縮 (shrinkage)，染色質縮合 (chromosome condensation)、DNA 斷裂 (DNA fragmentation)，以及形成凋

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通識教育學報第九期 247

亡小體 (apoptotic bodies)等現象出現 11,12

，但不會誘發發炎反應。直接偵測細胞凋亡的方法，可採用瓊脂凝膠電泳法 (agarose gel electrophoresis) 來觀察， DNA 會呈階梯狀排列的片段分析。執行細胞凋亡的機轉可能是一群蛋白水解酶 (protease)，尤其是 caspase (cysteine asparate-specific protease) 有關，經由一連串的蛋白質酶解作用(proteolysis cascade)，將死亡訊息傳送至下游，讓下游酵素 (如 endonuclease) 破壞 DNA 使細胞死亡。粒線體則是釋放出細胞色素c (cytochrome c)，釋放至細胞質中的 cytochrome c和 Apaf 1 結合後，即活化 caspase-9。 caspase-8 和 caspase-9 的活化可啟動下游的 caspase-3 等蛋白質活化，一連串的活化機制最後造成核膜蛋白 (lamin) 的分解、PARP [poly (ADP-ribose) polymerase] 切斷以及 DNA fragmentation 等現象，最後導致細胞凋亡。因此藉由 DNA 裂解及以西方墨點 (Western blot)偵測和凋亡有關蛋白質 (Bcl-2, Bax 等)13

的表現量即可初步了解熊果酸是否可誘發 CH27 細胞凋亡。

二、實驗方法

(一）細胞株之培養

K562、U937、CH27、NCI-H460、H1355 等細胞株繼代培養於 RPMI-1640 培養基中，並添加 10 ﹪FBS、100 units/ml penicillin、100 μg/ml streptomycin、2 mM

L-glutamine；細胞置於 37℃，5﹪CO2，溼度為 95﹪的培養箱中培養。 (二）細胞增殖率試驗 1.應用 MTT method 測定肺癌細胞 CH27，NCI-H460，H1355 之增殖率，取 2.5×104 /ml 的細胞置於 96 well 培養皿的小槽中，以不同濃度的藥物與之培養 24 小時或 48 小時後，加入 10 μl 5mg/ml MTT，於 37℃反應 4 小時，再加等量含 0.02N HCl 的 isopropanol 溶解後，以 ELISA reader 分析其於 570 nm 下各樣品的吸光值，並計算細胞增殖率。

2.以 PI (propidium iodide) exclusion 方法測定 K562、U937 血癌細胞株之增殖率，將 2.5×105

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248 熊果酸及齊墩果酸誘導人類肺癌細胞凋亡培養 24 或 48 小時後，收集細胞，加入 PI 使其終濃度為 5μg/ml，以流式細胞儀分析之，樣品中死亡細胞與活細胞的數目及比率，以 CELLQuest 軟體分析計算，以對照組之活細胞數為 100﹪，各處理組的活細胞數與對照組活細胞數的百分比率則為細胞增殖率。 (三）DNA 裂解之電泳分析細胞株經抽提物處理 24 小時後，收集細胞，加入 0.5 ml lysis buffer（20 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，0.2﹪Triton X-100）輕輕混合均勻後於冰上靜置 10 分鐘。經 13,000 rpm 離心 10 分鐘後取上清液，加入 0.1 mg/ml proteinase K 於 50℃水浴中反應 24 小時後，再加入 50 μg/ml RNase A 於 37℃水浴中反應 30 分鐘。再以 phenol：chloroform （1：1）萃取，上清液中的 DNA 以 50﹪isopropanol 及 1 μl glycogen（20 mg/ml）沉澱。純化的 DNA 樣品以 1 ﹪agarose gel (含 1 μg/ml ethidium bromide 核酸染色劑)電泳分析，於 UV 燈下觀察並照相記錄之。

(四）西方墨點(Western blot)分析

不同時間點收集的細胞分別以下列兩種緩衝液處理之。 (1) 欲測定總蛋白質中 Bcl-2、Bax、β-actin 等蛋白質的表現量，則加入 300 μl whole cell-lysis buffer （含 62.5 mM Tris-HCl pH 6.8，2﹪w/v SDS，10% glycerol ，50 mM DTT，0.1 ﹪ w/v bromphenol blue） (2) 欲測定細胞質中 cytochrome c蛋白質量的變化，則加入 150 μl cytosol-lysis buffer（含 pH 7.4 Tris-HCl 50mM，EDTA 0.5 mM，EGTA 0.5 mM， 0.3﹪2-mercaptoethanol，0.2 mM PMSF，5 μg leupeptin，55 μg aprotinin 之

1×PBS）。混合均勻之細胞懸浮液經超音波震碎後，以 13,000 rpm 離心 10 分鐘，

收集上清液並測量蛋白質濃度。取各時間點處理的蛋白質總量為 30 μg 與 3× SDS 樣品緩衝液充分混合後，於 100℃水中煮沸 5 分鐘，以 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)展開後，將蛋白質轉移至 PVDF （polyvinylidene difluoride）膜上。PVDF 膜先以含有 5﹪non-fat milk 的 TPST（0.05 ﹪Triton X-100 in PBS）緩衝液處理後，加入對人類蛋白質具專一性之初級抗體

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（primary antibody，如 anti-Bcl-2、anti-Bax 等），以辨識各蛋白質，4℃反應隔夜後再利用接有 horseradish peroxidase 之次級抗體 (如 HRP conjugated anti-rabbit IgG 或 HRP conjugated anti-mouse IgG) 與之反應。各專一性抗體所辨識之蛋白質量的多寡，利用 Western LightningTM

Chemiluminescence Reagent Plus Kit 試劑組進行酵素化學冷光反應後，再以 Kodak X 光底片曝光呈像。

(五）細胞週期之測定

經抽提物處理後之癌細胞株，於間隔時間點收集，用 1×PBS 清洗後，加入低張 PI 溶液（0.1﹪ sodium citrate，0.1﹪ Triton X-100，20 μg/ml PI），30 分鐘後立即以流式細胞儀測定 DNA 含量，再以 Modfit 軟體分析細胞週期變化。

三、結果與討論

我們研究測試 ursolic acid 對肺癌細胞株(CH27，NCI-H460，H1355)及血癌細胞株(U937 及 K562) 皆有抑制生長的作用，於處理 24 或 48 小時後，以 MTT method 或 PI 染色及流式細胞儀分析法偵測細胞增殖率後結果顯示，ursolic acid 純品能顯著抑制以上各癌細胞株的增殖(圖 1，2，3)，並大致呈現劑量依存性（dose-dependent）之關係。而 oleanolic acid 對其他細胞株生長的抑制則不如預期 (data not show)，同樣的，對 CH27 肺癌細胞株亦無明顯的抑制作用(圖 4)。而 ursolic acid 對癌細胞株增殖的抑制實驗結果顯示，ursolic acid 對癌細胞株有不同的致死敏感度，意味著 ursolic acid 可能為具選擇性之癌細胞生長抑制劑。而 ursolic acid 對肺癌細胞株(CH27，NCI-H460，H1355)增殖率抑制作用中，對 CH27 抑制效果最為明顯，且 CH27 為台北榮總由國人所分離之肺癌細胞株，值得對其進行進一步的研究(目前篩選抗癌藥物的重要指標有藉由細胞週期的停滯、誘導細胞凋亡與分化以達到抑制癌細胞的增生等機制)。而和 ursolic acid 皆屬 pentacyclic triterpene 化合物的 oleanolic acid，二者結構類似9

，但對癌細胞株的增殖抑制似乎有很大差別，將來或許可就結構的變化對癌細胞株的影響做進一步探討。

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為了證實在 ursolic acid 抑制 CH27 人類肺癌細胞之增殖是經由細胞凋亡的途徑，我們以 50μg/ml (IC50) ursolic acid 處理 CH27 人類肺癌細胞後，抽取細胞

質內的 DNA，並以瓊脂凝膠電泳分析，結果發現 DNA 呈 180 bp 梯度片段裂解

的現象（圖 5）。由 ursolic acid 處理後之人類肺癌鱗狀上皮細胞株 CH-27 可偵測

到細胞凋亡的特性，包含細胞核的濃集及斷裂、DNA 的裂解等現象。顯示高劑量 ursolic acid 抑制肺癌細胞之增殖主要是經由細胞凋亡。ursolic acid 具細胞毒

殺，誘導腫瘤細胞凋亡等作用14

，經本實驗證明正確。有研究顯示，經 ursolic acid 處理之 HepG2 human hepatoblastoma cells 有 G0-G1 滯留的現象15

，但在本實驗中細胞周期試驗顯示 ursolic acid 及 oleanolic acid 對 CH27 細胞株的細胞周期並無明顯滯留現象 (data not show)，表示二者沒有抑制細胞周期的作用，而 ursolic acid 誘發 CH27 細胞凋亡應不是經由抑制細胞周期而產生，同時亦顯示 ursolic acid 對不同細胞株之細胞周期的抑制作用具選擇性。西方墨點法測試經 ursolic acid 處理 CH27 細胞後之蛋白質，結果顯示 Bcl-2 蛋白質的量隨處理時間增長而降低，而 Bax 蛋白質量則有上升的趨勢(圖 6)，這和其他研究指出，ursolic acid 對 M4Beu melanoma cells 誘導凋亡是藉由改變 Bax-Bcl-2 之平□，即 Bax 表現量增

加，而 Bcl-2 表現降低之結果相吻合16

。但對其他凋亡蛋白質則似乎並無明顯的影響，顯示 ursolic acid 抑制癌細胞生長的作用是藉由細胞凋亡(apoptosis)的途徑所產生，造成凋亡的原因可能是透過與 Bcl-Xs 蛋白質相關機制，值得作更深入之探討。 Ursolic acid-H460 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 0 15.625 31.25 62.5 125 250 500 ( ug/ml ) P e rc e n t c e ll v ia b ili ty ( % ) 24hr Ursolic acid-H1355 0. 00 20. 00 40. 00 60. 00 80. 00 100. 00 0 15.625 3 1.25 62 .5 125 2 50 500 ( ug/ ml ) P e rc en t c e ll v ia b il it ( % ) 24hr

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通識教育學報第九期 251 Ursolic acid-CH27 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 0 1 5 .6 2 5 3 1 .2 5 6 2 .5 1 2 5 2 5 0 5 0 0 ( ug/ml ) P er ce n t ce ll v iab il it y ( % ) 24hr 圖 1. 不同濃度 ursolic acid 對 H1355，H460，CH27 肺癌細胞株增殖率之影響。細胞經過處理 24 小時後，以 MTT method 偵測並利用 ELISA reader 分析其於 570 nm 下測定各樣品的吸光值。每個數值以平均值±標準差來表示（取

樣數目為不同三重覆實驗）。

圖 2. 由左至右分別為 CH27 細胞株控制組，CH27 經 ursolic acid 處理 24hr 後細胞生長情形。

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252 熊果酸及齊墩果酸誘導人類肺癌細胞凋亡 Ursolic acid 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 0 6.25 12.5 25 50 75 100 ( ug/ml ) Pe rc e n t c e ll v ia b ilit y ( % ) K562 U937

圖 3. 不同濃度 ursolic acid 對 K562 及 U937 血癌細胞株增殖率之影響。細胞經過處理 24 小時後，以 PI 染色。細胞增殖率為各處理樣品與對照組的存活細胞數目之百分比值。每個數值以平均值±標準差來表示（取樣數目為不同三重覆實驗）。 Oleanolic acid-CH27 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 0 50 60 80 90 100 ( ug/ml ) P e rc e n t c e ll v ia b ility ( % ) 24hr 48hr 圖 4. 不同濃度 oleanolic acid 對 CH27 細胞株增殖率之影響。細胞經過處理 24 及 48 小時後，以 MTT method 偵測並利用 ELISA reader 分析其於 570 nm 下測定各樣品的吸光值。每個數值以平均值±標準差來表示（取樣數目為

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(hr.) M 24 16 0

圖 5. 電泳分析 ursolic acid 處理之 CH27 細胞核 DNA 斷裂情形。 M：DNA Maker。CH27 以 50 μg/ml 熊果酸處理。

0 3 6 12 18 Time (h)

圖 6. Western blot 分析 50 μg/ml ursolic acid 處理之 CH27 細胞內 Bcl-2，Bax 及β -Actin 蛋白質量的表現，β-Actin 為 internal control。

誌謝

感謝中國醫藥大學九十三學年度校內研究計畫 CMU93-GCC-05 之經補助，使本文得以順利完成，特此誌謝。

Bcl-2

Bax

β-Actin

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URSOLIC ACID AND OLEANOLIC ACID

INDUCED APOPTOSIS IN HUMAN

LUNG CANCER CELLS

W. W. Huang

1

, J. S. Yang

2

, W. J. Ho

3

1

Assistant Professor, General Education Center, China Medical University

2_{Assistant Professor, Department of Medical Technology, Yuan-Pei University}

of Science and Technology

3 _{Professor, Department of Bioresources, Da-Yeh University}

Abstract

The compounds of pentacyclic triterpene ( include ursolic acid and oleanolic acid ) have been reported to raise anti-tumor activities. In this study, we investigated the anti-tumor effects of ursolic acid (UA) and oleanolic acid (OA) on human lung squamous cancer CH-27 cells, human lung large cell carcinoma NCI-H460 cells and human lung cancer H1355 cells lines. UA inhibited the cell proliferation with dose- and time- dependence, and the IC50 of UA on CH27,

NCI-H460 and H1355 cells were 50, 100 and 300 μg/ml, respectively.

But OA seemed to have no cytotoxic effect on CH27, NCI-H460 and H1355 cells. UA showed to have better inhibitory effect on CH-27 than the other two (NCI-H460, H1355). We focused on the apoptosis experiment of CH-27 cells and found a phenomenon of DNA fragmentation. Our results were consistent with the published research data as evidenced by the up-regulation of pro-apoptotic Bax protein and the down-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 protein during UA induced apoptosis.

The precise mechanism of the induction of apoptosis by UA in CH27 cells will be the subject for further investigation in our research.

Key words: ursolic acid, oleanolic acid, human lung cancer cell lines, apoptosis Requests for reprints should be sent to General Education Center, Department of Biology , China Medical University, 91 Hsueh-Shih Road, Taichung 404, Taiwan E-mail: [email protected]