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中醫補氣方劑對胃腺癌細胞株之影響評估; Effects of Bu Qi formula of Chinese Medicine on the Human Gastric Adenocarcinoma Cells

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Academic year: 2021

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(1)中醫補氣方劑對胃腺癌細胞株之影響評估 研究生 郭哲彰 指導教授 陳建仲 博士 中國醫藥學院 中國醫學研究所 現階段對於胃癌治療還沒有有效的抗癌藥物,因此本計畫試圖以胃 癌細胞株實驗來尋找有效的治療中藥方劑。 我們測試臨床常用於癌症化學治療調理的中醫補氣方劑:保元湯、 舉元煎、四君子湯、六君子湯、補中益氣湯,試圖篩選出對胃腺癌細胞 株 MKN-74 具毒殺能力而且能加強絲鏈黴素(Mitomycin C; MMC)對 MKN-74 細胞株之毒殺能力的補氣方劑。我們更試著討論補氣方劑與 MMC 組合的作用機轉,是否協同加強 MMC 對 MKN-74 細胞株之細胞 凋亡的反應,抑或是藉由其他機轉來毒殺細胞。於是我們利用 MTT assay 技術測試細胞的存活率,應用定量螢光顯微鏡分析法來計算細胞的凋亡 率。 實驗結果發現補氣方劑當中,補中益氣湯促進 MMC 對胃腺癌細胞 MKN-74 之毒殺能力最強,針對補中益氣湯與 MMC 的合併使用並不會 加強 MMC 誘導 MKN-74 細胞株細胞凋亡。因此補中益氣湯與 MMC 可 能誘導 MKN-74 細胞株朝向細胞壞死路徑。由於補中益氣湯促進 MMC 對胃腺癌細胞 MKN-74 之毒殺能力最強,因此可以進一步設計臨床試 驗,使用這兩種藥物於胃癌的治療以加強胃癌治療的效果。. 關鍵字:補中益氣湯. 胃癌. 細胞凋亡 細胞壞死 絲鏈黴素. 1.

(2) 2.

(3) 第一章 前言 近幾十年來,由於生物科技的進步,導致人類壽命的延長。但是工 業快速發展卻造成環境污染,人類生活的周遭充滿著有害致癌物,使得 癌症的死亡率在許多國家都是高居十大死因之首。我國癌症死亡率早在 民國 71 年就已經位居第一位而且蟬連至今。而癌症之治療方式,也隨 著生物科技之進步,日新月異。外科手術、化學治療、放射治療、免疫 療法、基因療法、分化療法等都是癌症現在常用的治療模式。傳統中醫 治療模式有著二千多年的臨床經驗累積,目前陸陸續續在中藥尋找出治 療某些疾病的特殊成份。如青蒿中萃取青蒿素治療瘧疾,砒霜中的砷治 療急性白血病。因此,中醫藥一直被認為在癌症治療上應該佔有一席之 地。 胃癌在我國佔男性癌症死亡原因居第四位 1,在全世界仍是最常見 的癌症之一 2,而胃腺癌是胃癌中最常見的一種,約佔所有胃癌的 90% -95% 3。胃腺癌是一種化學治療活性很低的癌症,現階段沒有抗癌藥對 胃腺癌細胞特別敏感,最常用的選擇是 Fluorouracil , Cisplatin, doxorubicin, etoposide, methotrexate, mitomycin-C 等。目前外科手術仍是較具積極 治療的方法,但由於其存活率與診斷出胃腺癌侵犯的期別有關,五年存 活率往往在 5% -15%4。由於其存活率低,因此術後常須輔助化學治療, 或者先在術前進行輔助化學治療,或是針對轉移性胃腺癌予以姑息性化 學治療。現階段沒有抗癌藥物對胃腺癌細胞特別敏感,往往有許多副作 用。因此,研發新的方法以及尋找新的藥物組合,是治療胃腺癌非常重 要的研究方向。資料顯示,有許多中藥或其萃取物對胃腺癌細胞具有毒 殺作用。如綠茶酚(green tea catechin, epigallocatechin gallate)4,辣椒素 (capsaicin)5,知母萃取物 6 , isoliquiriti- genin7。 由於臨床上用於癌症化學治療後調理之中醫方劑以補氣方劑居多 8,9 。因此本計劃選取五種補氣方劑:保元湯、舉元煎、四君子湯、六君 子湯、補中益氣湯,首先觀察各個補氣方劑對胃腺癌細胞的細胞存活 率,其次再篩選出一個對胃腺癌細胞株 MKN-74 毒殺能力最強的補氣方 劑,而且能加強 MMC 對 MKN- 74 細胞株之毒殺能力的補氣方劑。另外,. 1.

(4) 已知 MMC 對 MKN-74 細胞株會產生細胞凋亡 10,11,因此,我們有興趣 探討補氣方劑與 MMC 組合的作用機轉,是否能協同加強 MKN-74 細胞 株之細胞凋亡的反應,抑或是藉由其他路徑來促進細胞的毒殺作用。. 2.

(5) 第二章 文獻探討 壹、中醫文獻探討 一、胃癌 癌症在中醫屬於「積聚」範疇 12。而胃癌包含在中醫的「胃痛」、 「胃癰」、「胃翻」等範疇內。 積聚的名詞,首載於《內經》13 。該書對於本證的病因、病機及 治則有所論述。如《靈樞?百病始生篇》指出:「積之始生,得寒乃生。」 「若內傷於憂怒,則氣上逆,氣上逆則六輸不通,溫氣不行,凝血蘊裡 而不散,津液澀滲,著而不去,而積皆成矣。」《素問?六元正紀大論》 則指出其治則:「堅者削之,客者除之,結者散之,留者攻之,逸者行 之,堅者軟之。」此書對於治療本病,有著最原始開端與指導。 漢代,張仲景《金匱要略?五臟風寒積聚病證》篇提到:「積者, 臟病也,終不移;聚者,腑病也,發作有時,展轉痛移,為可治 14。」 不僅指出了積與聚臨床的特點,並且根據病情的輕重,判斷其預後。和 現代胃癌根據分期,來決定預後,極為相似。 隋代,巢元方於《諸病源候論》中也記載:「積者,臟病也,陰 氣之所生也;聚者,腑病也,陽氣之所成。虛勞之人,陰陽傷損,氣血 凝澀,不能宣通經絡,故積聚於內也。」明白地創立虛勞致積的理論學 說 15。 明代醫家張景岳在其所著的《景岳全書?積聚論治》中,對於其病 因病機有更全面的認識:「積聚之病,凡飲食、氣血、風寒之屬,皆能 致之,但曰積曰聚,當詳辨也。蓋積者,積壘之謂,由漸而成者也;聚 者,聚散之謂,作止不常者也。由此言之,是堅硬不移者本有形也,固 有形者曰積;或聚或散者,本無形也,故無形者曰聚,諸有形者,或以 飲食之滯,或以濃血之留。凡汁沫凝聚,旋成癥塊者,皆積之類,其病 多在血分,血有形而靜也。諸無形者,或脹或不脹,或痛或不痛,凡隨 觸隨發,時來往者,皆聚之類,其病多在氣分,氣無形而動也 16。」這 說明積聚發病原因與飲食偏差、氣血失調、風寒受襲所導致,在病理分. 3.

(6) 類上,將堅硬不移而有固定形體者,稱之為積,另將較柔軟且無固定形 體者稱為聚。其治療,前者從血分治,而後者從氣分治療。 關於積聚之治療,隨著時代演進有著不同的思惟,但大體如清代 《醫宗必讀?積聚》篇提到:「初者,病邪初起,正氣尚強,邪氣尚淺, 則任受攻。中者,受病漸久,正氣較弱,任受且攻且補。末者,病魔經 久,邪氣侵凌,正氣消殘,則任受補 17。」隨著正邪盛衰的趨勢而改變 其治療的方式。而扶正培本,配以去邪消積,但攻邪之藥,不可過猛, 以傷正氣。 關於類似胃癌病變及症狀的描述,如《素問?腹中論》說:「病有 少腹盛,上下左右皆有根… … 病名曰伏梁。… … 裹大濃血,居腸胃之外, 不可治,治之每切按之致死。」《難經》說:「心之積,名曰伏梁,起 臍上,大如臂,上至心下,久不愈,令人病煩心。」張仲景在《金匱要 略》提到:「朝食暮吐,暮食朝吐,宿穀不化,名曰胃反」,以及「脈 緊而澀,其病難治」的描述;嚴用和《濟生方》提到:「伏梁之狀,起 於臍下,其大如臂,上至心下,猶梁之橫架於胸膈者,是為心積… … 其 病腹熱而面赤,咽乾心煩,甚則吐血,令人食少肌瘦。」以上描述與胃 癌晚期幽門梗阻所發生的情況相似。 關於流行病學方面,明代張景岳指出:「少年少見此症,惟中衰 耗傷者多有之。」與現代醫學統計胃癌好發於 40 歲以上相符 18。 二、補氣方劑 以補養藥配製成方,用以治陰陽氣血不足或臟腑虛損之證者,統 稱為補益劑。在治則八法中屬於「補法」範圍,十劑中為「補劑」。《素 問?三部九候論》提到:「虛則補之」;《素問?至真要大論》提到:「損 者益之」;另外,《素問?陰陽應相大論》更提到:「形不足者,溫之以 氣;精不足者,補之以味」。這些都是補益劑的立論依據與應用原則 19。 補氣方劑,專指針對氣虛證,而氣虛之證以脾、肺氣虛為主。其 見證倦怠乏力,少氣懶言,語聲低微,動則易喘,食少便溏,舌淡苔白, 脈細弱。臨床上癌證末期,或化療後遺症常見氣虛之證候 8,9。常用補氣 藥人參、黨參、黃耆、白朮、炙甘草等為主組合成方劑。若兼氣滯者, 配木香、陳皮、砂仁等,調暢氣機,與補氣藥配合,增強脾胃運化之功. 4.

(7) 能,防其壅氣不化之弊;兼溼阻者,伍以利水滲溼藥,如茯苓、薏苡仁 等,使水溼下滲而脾運得健;若氣虛下陷,內臟下垂者,佐以升提藥如 升麻、柴胡、桔梗等,以提高補氣升提之功;兼陰虛脈弱者,酌加養陰 生津藥如麥冬、五味子,以補養氣陰。 補氣藥之代表方如:保元湯、舉元煎、四君子湯、六君子湯、補 中益氣湯。分述如下: (一)保元湯 出典:十藥神書。 組成:人參三錢 甘草一錢 黃耆三錢 肉桂五分 主治:虛損勞怯、元氣不足、又治痘瘡塌陷。 (二)舉元煎 出典:景岳全書。 組成:黃耆三錢 人參三錢 白朮三錢 炙甘草二錢 升麻三錢 (三)四君子湯 出典:和劑局方。 組成:黨參二錢 白朮二錢 茯苓二錢 炙甘草一錢 生薑三錢 紅棗二錢 主治:榮衛氣虛,臟腑怯弱,心腹脹滿,全不思食,腸鳴泄瀉,嘔噦吐 逆。 (四)六君子湯 出典:醫學正傳。 組成:黨參二錢 白朮二錢 茯苓二錢 炙甘草一錢 半夏一錢 陳皮一錢 生薑三錢 紅棗二錢 主治:脾胃氣虛兼痰溼,不思飲食,噁心嘔吐,胸脘痞悶,大便不實。 (五)補中益氣湯 出典:脾胃論。 組成:黃耆五錢 黨參五錢 白朮三錢 炙甘草五錢 陳皮二錢 當歸二錢 升麻二錢 柴胡二錢 生薑三錢 紅棗二錢 主治:氣高而喘,身熱而煩,其脈洪大而頭痛,或渴不止,其皮膚不任 風寒而生寒熱。. 5.

(8) 貳、現代文獻探討 一、細胞凋亡 細胞死亡分為兩種,一種稱為壞死(necrosis),另一種稱為細胞 凋亡(apoptosis),又稱為計畫性死亡(programmed cell death) 。當細胞受 到缺氧或外來毒素傷害時,最常死亡的形式為壞死,此時細胞腫脹,膜 完整性消失,細胞崩解且內容物釋出,易造成個體之發炎反應。但在 1965 年代 Kerr 及其同僚提出研究老鼠肝門靜脈結紮後的肝細胞變化時發現 到一種細胞縮小、包膜完整、無發炎反應的另一種細胞死亡方式,在 1972 年正式命名為細胞凋亡。由於細胞凋亡小體很快被吞噬掉,不易於體內 研究,且當時欠缺生物標記,因此沈寂一陣子,直到 1990 年代以後得 力於線蟲類(nematode)及果蠅的遺傳知識,細胞凋亡的研究才蓬勃發 展。細胞凋亡是真核細胞自然死亡的方式,就生理意義而言,生物個體 藉細胞凋亡可以主動去除那些受傷、老化或不要的細胞,以維持生物體 的發育及細胞恆定。例如,在胚胎發育過程,約有一半的神經細胞與周 邊組織細胞連結後,因得不到足夠周邊組織分泌的特異性神經生長因子 而死亡。在病理意義上,一些重要疾病如癌症、病毒性疾病、後天免疫 缺乏症候群和神經退化等疾病,與細胞凋亡的亢奮與不及相關。因此細 胞凋亡成為當前國內外研究的熱門課題 20-27。 細胞凋亡的研究方法目前有幾種指標可以參考。最常用的就是細 胞 形 態, 由 於 細 胞 凋 亡 活 化 了 許 多 內 生 性 蛋 白 質 脢( endogenous protease) ,導致細胞骨架被破壞(cytoskeletal distruption) 、細胞萎縮(cell shrinkage) 、細胞膜上會有泡沫狀(membrane blebbing)的產生,並產生 染 色 質 濃 縮 ( chromatin condensation) 的 現 象 20,28 。 本 實 驗 利 用 bisbenzimide trihydrochloride 染劑染濃縮的染色質,再利用螢光顯微鏡予 以觀察測量。 二、絲鏈黴素(Mitomycin C) 絲鏈黴素是從一種絲鏈黴菌 (streptomyces caespitosus)分離而得, 是一種烷化基劑,其作用會造成 DNA 雙股之間的交叉連結,進而抑制 DNA 的複製,目前被廣泛使用在癌症的化學治療上,特別在胃癌以及. 6.

(9) 胰臟癌。目前已知 MMC會造成胃腺癌細胞株細胞凋亡,非經由 Fas/CD95 路徑但能活化 caspases-8,3,929,其作用可以因 protein kinase C (PKC)的抑 制劑 SAF, the L-theo enantiomer of dihydrosphingosine; safingo 來提高細 胞凋亡之能力 30,31 ,並且得知此 PKC 抑制反應是藉由選擇性抑制 Cyclooxygenase-2 (COX-2) 所導致 11。. 7.

(10) 第三章 材料和方法 壹、實驗藥物和儀器 一、實驗儀器 (一)桌上型離心機 Spectrafuge Microcentrifuge 廠牌:Labnet 細胞凋亡實驗中,利用離心原理將細胞離心下來。 (二)震盪器 LAB.ROTATOR Model: DSR 2800V 廠牌:Digisystem Laboratory Instruments, INC MTT 實驗中,震盪細胞並將細胞溶解。 (三)VORTEX-GENIE 2 廠牌:Scientific Industries, INC 將中藥混合均勻以及在細胞凋亡實驗中將細胞重懸浮。 (四)一般天平 Explorer Balances 廠牌:OHAUS MTT 實驗中配制 MTT 時,秤重用。 (五)微量天平 Adeventurer Balances 廠牌:OHAUS 藥物濃縮後秤藥物重量 (六)攪拌器 廠牌:JII TSANN CO., LTD 細胞凋亡實驗配 3﹪Paraformaldehyde 所需。 (七)減壓離心濃縮機 Centrivap Console 廠牌:LABCONCO 中藥流浸膏冷凍乾燥取得粉末,並計算抽取濃度。 (八)ELISA Reader Stat Fax 2100 廠牌:Awreness Technology INC MTT 實驗測吸光值 (九)Freezer -20℃ 廠牌:Frigidaire 儲存中藥流浸膏,其他試劑。. 8.

(11) (十)玻片 Micro Slide 廠牌:Muto Pure Chemicals CO., LTD 細胞凋亡實驗使用。 (十一)蓋玻片 Microscopical cover-glasses 廠牌:Assistant 細胞凋亡實驗使用。 (十二)倒立相位差螢光顯微鏡 ECLIPSE TE300 廠牌:Nikon 細胞凋亡實驗使用觀察細胞。 (十三)照相系統 BX60 廠牌:Olympus 細胞凋亡實驗將細胞照相。 (十四)直立型離心機 Kubota 2010 廠牌:Kubota 細胞培養。 (十五)二氧化碳培養箱 BNA-211 廠牌:ESPEC 細胞培養。 (十六)直立式無菌無塵操作台 廠牌:Concrpt 細胞培養。 (十七)真空幫浦 廠牌:GAST 細胞培養及中藥過濾。 (十八)Pipet-Aid Drummond 抽吸藥品溶液。 二、實驗材料 (一)培養基 購自 Gibco MEM medium. 9.

(12) 100 Unit/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 20﹪heat-inactivated normal calf serum (二)MMC 購自 Sigma Chemical Co. (三)MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue)購自 Sigma Chemical Co. (四)SAF (safigo)購自 Aventi polar, Lipids, Inc (五)PBS 購自 Amresco (六)bisbenzamide (Sigma B 2883) 購自 Sigma Chemical Co. (七)人類胃腺癌細胞株(MKN-74)Early passage human gastric cancer 取自 Dr Gary Lab 三、實驗中藥方劑: 保元湯、舉元煎、四君子湯、六君子湯、補中益氣湯共五種,經科 達製藥公司 3 名中藥師共同鑑定其組成藥材基源,本實驗所使用相同之 中藥為同一批藥材。中藥基源說明如下: (一)保元湯 組. 成科. 別. 用. 部. 學. 名. 人參 五加科 去鬚根之乾燥 Panax ginseng C.A. Mey. 根 甘草 豆科 根、根莖 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 黃耆 豆科 乾燥根 Astragalus membranaceus Bunge var. mongholicus (Bunge) P.K. Hsiao 肉桂 樟科 乾燥樹皮 Cinnamomum cassia Presl. 10.

(13) (二)舉元煎 組. 成科. 黃耆. 別. 豆科. 人參 五加科 白朮 菊科 炙甘草 豆科 升麻 毛艮科. 用. 部. 學. 名. 乾燥根. Astragalus membranaceus Bunge var. mongholicus (Bunge) P.K. Hsiao 去鬚根之乾燥 Panax ginseng C.A. Mey. 根 乾燥根莖 Atractylodes macrocephala koidz. 根、根莖 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 根莖 Cimicifuga foetida L.. (三)四君子湯: 組. 成 科. 別. 用. 部. 人參 五加科 去鬚根之乾燥 根 白朮 菊科 乾燥根莖 茯苓 多孔菌 乾燥菌核 科 炙甘草 豆科 根、根莖 生薑 薑科 根莖 紅棗 鼠李科 乾燥成熟果實. 學. 名. Panax ginseng C.A. Mey. Atractylodes macrocephala koidz. Poria cocos (Schw.) Wolf. Glycyrrhiza uralensis Fisch. Zingiber officinale Rosc. Ziziphus jujuba Mill.. 11.

(14) (四)六君子湯: 組. 成 科. 別. 用. 部. 人參 五加科 去鬚根之乾燥 根 白朮 菊科 乾燥根莖 茯苓 多孔菌 乾燥菌核 科 炙甘草 豆科 根、根莖 姜半夏 天南星 塊莖 科 陳皮 芸香科 乾燥熟果皮 生薑 薑科 根莖 紅棗 鼠李科 乾燥成熟果實. 學. 名. Panax ginseng C.A. Mey. Atractylodes macrocephala koidz. Poria cocos (Schw.) Wolf. Glycyrrhiza uralensis Fisch. Pinellia ternata (Thunb.) Breit. Citrus reticulata Blanco Zingiber officinale Rosc. Ziziphus jujuba Mill.. (五)補中益氣湯: 組. 成 科. 黃耆. 別. 豆科. 人參 五加科 白朮 炙甘草 陳皮 當歸 升麻 柴胡 生薑. 菊科 豆科 芸香科 傘形科 毛艮科 傘形科 薑科. 用. 部. 學. 乾燥根. 名. Astragalus membranaceus Bunge var. mongholicus (Bunge) P.K. Hsiao 去鬚根之乾燥 Panax ginseng C.A. Mey. 根 乾燥根莖 Atractylodes macrocephala koidz. 根、根莖 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 乾燥熟果皮 Citrus reticulata Blanco 乾燥根 Angelica sinensis (Oliv.) Diels 根莖 Cimicifuga foetida L. 乾燥根 Bupleurum chinense DC. 根莖 Zingiber officinale Rosc.. 12.

(15) 貳、實驗方法 一、補氣中藥方劑的置備 取藥材 100 g 加入 7 倍水(700 ml)煎煮一小時後,過濾(100 目),然 後將濾後藥渣加入 5 倍水(500 ml)煎煮一小時,再次過濾(100 目),合兩 次濾液濃縮至 80 g。 二、補氣中藥方劑之產率 (一)保元湯 處方比例 原 人. 料 參. 比. 例 3.0. 煎煮量(g) 40.00. 甘 黃. 草 耆. 1.0 3.0. 13.33 40.00. 肉. 桂. 0.5. 6.67. 合. 計. 7.5. 100.00. 濕浸膏重: 83.32 g 乾浸膏率: 43.2% 乾浸膏重: 35.99 g 產率: 35.99% (二)舉元煎 處方比例 原 黃. 料 耆. 人. 比. 例 3.0. 煎煮量(g) 21.43. 參. 3.0. 21.43. 白 朮 炙 甘 草. 3.0 2.0. 21.43 14.28. 升. 麻. 3.0. 21.43. 合. 計. 14.0. 100.00. 濕浸膏重: 82.26 g. 13.

(16) 乾浸膏率: 48.28% 乾浸膏重: 39.72 g 產率: 39.72% (三)四君子湯 處方比例 原 人. 料 參. 比. 例 2.0. 煎煮量(g) 16.67. 白 茯. 朮 苓. 2.0 2.0. 16.67 16.67. 炙 甘 草. 1.0. 8.32. 生 紅. 薑 棗. 3.0 2.0. 25.00 16.67. 合. 計. 12.0. 100.00. 濕浸膏重: 85.43 g 乾浸膏率: 34.76% 乾浸膏重: 29.70 g 產率: 29.70% (四)六君子湯 處方比例 原 人 白. 料 參 朮. 比. 例 2.0 2.0. 茯. 苓. 2.0. 14.29. 炙 甘 草 姜 半 夏. 1.0 1.0. 7.14 7.14. 陳. 皮. 1.0. 7.14. 生 紅. 薑 棗. 3.0 2.0. 21.42 14.29. 合. 計. 14.0. 100.00. 濕浸膏量: 83.04 g. 14. 煎煮量(g) 14.29 14.29.

(17) 乾浸膏率: 36.68% 乾浸膏重: 30.46 g 產率: 30.46% (五)補中益氣湯 處方比例 原 黃. 料 耆. 比. 例 5.0. 煎煮量(g) 16.13. 人 白. 參 朮. 5.0 3.0. 16.13 9.68. 炙 甘 草. 5.0. 16.13. 陳 當. 皮 歸. 2.0 2.0. 6.45 6.45. 升. 麻. 2.0. 6.45. 柴 生. 胡 薑. 2.0 3.0. 6.45 9.68. 紅. 棗. 2.0. 6.45. 合. 計. 31.0. 100.00. 濕浸膏重: 99.84 g 乾浸膏率: 41.31% 乾浸膏重: 41.24 g 產率: 41.24% 三、補氣方劑濃度製備 將上述五種方劑流浸膏用蒸餾水稀釋成 0.2 g/ml,分別取 20 ml 中藥 加入 20 ml PBS 充分混合,分入 2ml 離心管,以 7500 rpm 離心 30 分 鐘後取上清液過孔徑為 0.45 µm 的濾膜,以濾除細菌,緊接著用 PBS 稀 釋成 100 mg/ml,在無菌操作台上過 0.22 µm 孔徑的濾膜,以濾除病毒, 並將將藥物分裝並儲存於 -20℃冰箱。 四、細胞株培養 將 MKN-74 細胞株自液態氮中解凍,培養在 75T 培養瓶中以含有 15.

(18) 10% fetal bovine serum,100 Unit/ml penicillin,100 µg/ml streptomycin 的 MEM 培養基培養,每隔 2-3 天做依次繼代培養。繼代培養時,先以 Trypsin 緩衝液處理細胞,使之自附著面脫離,繼以含血清緩衝液終止 Trypsin 反應,整個培養過程在無菌操作台操作。處理後之細胞置於並 放置 37℃恆溫,含 5% CO2 飽和溼度的培養箱。 五、細胞生長抑制試驗- - MTT assay (一)原理 MTT是一種水溶性tetrazolium salt 呈黃色。在存活的細胞中具有活 性的active mitochondrial dehydrogenase 會將MTT轉化成不溶性之紫色 formazan。再經由 acidic isopropanol 來溶解formazan,經分光比色儀偵 測染劑顏色的濃度,換算出細胞存活率。 (二)實驗步驟 將胃癌細胞株細胞培養成每孔 2500 個細胞,接種於96孔培養盤 中,每孔接種200 µl細胞株,並加入不同濃度之實驗藥物各40 µl,依不 同分析時間培養細胞。當檢測細胞存活率時,先將培養盤不棄上清液, 每孔加入24 µl (總體積的十分之一)新鮮配制的含5 mg/ml MTT (Sigma M 5655)的phenol-red培養基。再置於37℃之5﹪CO2 培養箱中繼續培養3 小時。接著去上清液加入200µl acidic isopropanol (0.096N HCl) 溶解 formazan,震盪混合後30秒鐘後,以分光比色儀偵測570 nm波長的吸光 值並用630 nm 波長當背景值。 六、細胞存活率分析 以未加藥物的實驗組吸光值測量值當作100% ,並以此計算藥物實 驗組的癌細胞存活率。其計算公式如下: 細胞存活率﹦[藥物處理之吸光值值背景值] / [未經藥物處 理之吸光值-背景值] x 100% 七、細胞凋亡分析 本計畫使用定量螢光顯微鏡分析(Quantitative. 16. Fluorescent.

(19) Microscopy, QFM) (一)原理 利用bisbenzimide trihydrochloride 染劑能染上細胞凋亡所產生的濃 縮的細胞質(condensed chromatin), 再利用定量螢光顯微鏡(QFM) 予以觀察測量。 (二)操作步驟 經藥物處理過的培養皿,在室溫下用PBS 3 ml 沖洗 3次後加入 trypsin 1 ml 在 37℃下培養5分鐘,再以回收之PBS 沖洗後收取細胞懸 浮液上清液,以1200 rpm離心10分鐘,移去上清液並加入1ml PBS 重新 懸浮細胞沈澱,再將細胞移到2 ml 離心管離心形成細胞沈澱,用100 µL 3﹪paraformaldehyde ( 4℃ fresh )固定並重懸浮細胞後,先將細胞置於室 溫10分鐘,然後冷藏於4℃冰箱一段時間。接著用離心機離下細胞並移 除固定液,再以用一倍的 PBS 1 ml 沖洗並震盪,吸出PBS 並用50 µl Diluted stain染被固定的細胞。其中Diluted stain的配置如下: Stock=8 mg/ml bisbenzamide (Sigma B 2883) in PBS Dilute stain=20 µl Stock +10 ml PBS (1:500 稀釋) 接著將被染色的細胞株培養在室溫下 10-15分鐘後,每次取15µl細 胞液滴在玻片上,利用螢光顯微鏡,每張玻片觀察約600個細胞,計算 細胞凋亡細胞出現的百分率。 (三)實驗分組 本實驗共分兩大組,將補中益氣湯分別與 MMC 0.25 µg/ml 及 MMC 1.0 µg/ml 作 用 比 較 , 在 細 胞 培 養 三 天 後 , 以 利 用 bisbenzimide trihydrochloride 染劑及定量螢光顯微鏡分析(Quantitative Fluorescent Microscopy, QFM),其分組如表所示。(表 3.1 ) (表 3.2 ). 17.

(20) 表 3.1 補中益氣湯與 MMC 0.25 µg/ml 對 MKN-74 細胞株的細胞凋亡反 應實驗分組表 第一天. 第二天. 第三天. 第一組(負對照)PBS 第二組 補中益氣湯. PBS 補中益氣湯. PBS 補中益氣湯. 第三組. PBS. PBS. MMC 0.25 µg/ml. 第四組 第五組. 補中益氣湯 補中益氣湯 MMC 0.25 µg/ml MMC 0.25 µg/ml Wash MMC add 補中益氣湯 補中益氣湯. 第六組. MMC 0.25 µg/ml Wash out MMC Add PBS. 第七組(正對照)PBS. PBS. PBS MMC 0.25 µg/ml +Safingo 50 µM. 表 3.2 補中益氣湯與 MMC 1.0 µg/ml對 MKN-74 細胞株的細胞凋亡反應 實驗分組表 第一天 第一組(負對照)PBS 第二組 補中益氣湯 第三組. 第二天. 第三天. PBS 補中益氣湯. PBS MMC 1.0 µg/ml. MMC 1.0 µg/ml Wash out MMC 補中益氣湯 add 補中益氣湯. 第四組. MMC 1.0 µg/ml Wash out MMC addPBS 第五組(正對照)PBS PBS. PBS MMC 1.0 µg/ml+ Safingo 50 µM. 八、統計方法 實驗數據以 mean ±SD 表示。統計上使用 two side student’s t test 來 比較差異。分析結果以 P 值小於 0.05 視為統計上有差異。分析回歸曲線 來定藥物抑制作用的 IC50 及 IC10 值。. 18.

(21) 第四章 結果 一、MKN- 74 細胞株細胞數目的測定 為了確定本實驗的細胞仍屬於快速生長期,我們將不同細胞數的細 胞株 1000-6000 cells/well 種在 96 孔培養盤中,培養三天後,用 MTT assay 計算各組細胞存活率 (圖 4.1) 。實驗發現,細胞數目在 2000 cell/well 到 3000 cell/well 仍屬快速生長期,因此最後決定取 2500 cells/well,來 進行以後 MKN-74 細胞株培養的實驗。 二、計算五種補氣方劑的 IC10 及 IC50 為了得到五種補氣方劑的 IC10 及 IC50,我們將補氣方劑依不同濃度 加入細胞株培養三天,用 MTT assay 分別畫出其細胞存活曲線(圖 4.2 至圖 4.6) 。再依存活曲線取其線性回歸,分別得到五種方劑的 IC10 IC50 濃度。由於保元湯線性回歸後 IC10 為負值,因此,改以 IC25。五種補氣 方劑的 IC10 及 IC50 詳附於(表 4.1) ,接下來的實驗中,我們將取 IC10 及 IC50 的藥物濃度與 MMC 作用,觀察是否促進 MMC 對胃癌細胞毒殺能 力,並篩選最有效之方劑。 三、MMC 不同濃度的細胞存活曲線 為了下一步補氣方劑合併 MMC 的細胞毒殺試驗,我們必須先確定 MMC 在不同濃度下的細胞存活率。首先取 MMC 濃度分別 0.25 µg/ml 1.0 µg/ml 、 4 µg/ml 、 8 µg/ml 、 16 µg/ml 加入 MKN-74 細胞株一起 培養一天,然後用 MTT assay 計算其細胞存活率。 (圖 4.7)其結果顯示 MMC 0.25 µg/ml 的細胞存活率:94.9 ±3.9﹪,MMC 1.0 µg/ml 的細胞存 活率:75 ±7.7﹪。因此,我們在接下來的實驗,補氣方劑促進 MMC 對 胃癌細胞毒殺能力及篩選最有效之方劑實驗中,MMC 的濃度採用 1.0 µg/ml 及 0.25 µg/ml。由於 MMC 0.25 µg/ml 對胃癌細胞幾乎不產生抑制 作用,且較逼近於臨床實際的血中濃度,因此在最後篩選的出來的補中 益氣湯與 MMC 的作用機轉實驗中,MMC 則採用 0.25 µg/ml。. 19.

(22) 圖 4.1 MKN- 74 細胞株細胞數目的測定 將不同細胞數的細胞株 1000-6000 cells/well 種在 96 孔培養盤中,培養 三天後,用 MTT assay 計算各組細胞存活率。結果發現,細胞數目在 2000 cell/well 到 3000 cell/well 仍屬快速生長期,因此決定取 2500 cells/well,來進行 MKN-74 細胞株培養的實驗。 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。n = 3。. 20.

(23) 圖 4.2 保 元 湯 對 MKN74 細 胞 株 的 存 活 曲 線 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。** P < 0.01 與不加藥對照組比較(n = 3)。. 21.

(24) 圖 4.3 舉 元 煎 對 MKN74 細 胞 株 的 存 活 曲 線 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。** P < 0.01 與不加藥對照組比較(n = 3)。. 22.

(25) 圖 4.4 四 君 子 湯 對 MKN74 細 胞 株 的 存 活 曲 線 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。** P < 0.01 與不加藥對照組比較(n = 3)。. 23.

(26) 圖 4.5 六 君 子 湯 對 MKN74 細 胞 株 的 存 活 曲 線 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。** P < 0.01 與不加藥對照組比較(n = 3). 24.

(27) 圖 4.6 補 中 益 氣 湯 對 MKN74 細 胞 株 的 存 活 曲 線 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。** P < 0.01 與不加藥對照組比較(n = 3)。. 25.

(28) 圖 4.7 不 同 濃 度 的 MMC 對 MKN74 細 胞 株 的 存 活 影 響 其結果顯示 MMC 0.25 µg/ml 的細胞存活率:94.9 ±3.9﹪,MMC 1.0 µg/ml 的細胞存活率:75 ±7.7﹪。 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。n = 3. 26.

(29) 表 4.1. 各 種 補 氣 方 劑 的 IC10 與 IC50 值 IC10. 保元湯 舉元煎 四君子湯 六君子湯 補中益氣湯. IC50 a. 0.43 mg/ml 0.68 mg/ml 3.14 mg/ml 3.85 mg/ml 0.82 mg/ml. a: IC25 值. 27. 3.85 mg/ml 1.82 mg/ml 4.78 mg/ml 5.95 mg/ml 2.41 mg/ml.

(30) 四、五種補氣方劑與 MMC 1.0 µg/ml 對 MKN-74 細胞株的毒殺試驗 本實驗將篩選出與 MMC 合併作用下,具有促進 MMC 細胞毒殺作 用之中醫補氣方劑。首先取五種補氣方劑之 IC10 及 IC50,分別加入 MKN-74 細胞株內一起培養 2 天,利用 MMT assay 計算出細胞存活率 (圖 4.8 至圖 4.12) 。結果顯示 MMC 加入保元湯、舉元煎、補中益氣湯 具有促進細胞毒殺反應。 五、保元湯、舉元煎、補中益氣湯促進 MMC 0.25 µg/ml 對 MKN-74 細 胞株的毒殺試驗 為進一步篩選出保元湯、舉元煎、補中益氣湯三種補氣方劑中,何 者合併 MMC 的細胞毒殺作用最強。因此將保元湯、舉元煎、補中益氣 湯以其 IC10 濃度加入 MKN-74 細胞株內一起培養 2 天,第三天加入 MMC 0.25 µg/ml,以 MTT assay 計算細胞存活率(圖 4.13)。其結果補 中益氣湯與保元湯有明顯能促進 MMC 的細胞毒殺作用,其中以補中益 氣湯最顯著。 六、補中益氣湯與 MMC 對 MKN-74 細胞株的細胞凋亡反應 本實驗主要在探討補中益氣湯與 MMC 合併使用後促進細胞毒殺作 用的作用機轉。因 MMC 劑量之不同我們將實驗共分成兩大組(表 3.1) (表 3.2),細胞培養三天後,利用 bisbenzimide trihydrochloride 染劑及 定量螢光顯微鏡分析法(Quantitative Fluorescent Microscopy, QFM)計 算細胞凋亡之百分率。 實驗結果發現,MMC 在 0.25 µg/ml 時,不論有無加入補中益氣湯, 或是之前、之後加入,對於細胞凋亡的發生百分率均無明顯意義(圖 4.14) 。而在 MMC 1.0 µg/ml 使用一天後加入補中益氣湯兩天與沒有加入 補中益氣湯有顯著差異,P<0.01。而 MMC 在第一天加入與第三天加入 其細胞凋亡率有明顯的差異,P < 0.05(圖 4.15),細胞凋亡之螢光圖見 (圖 4.16)。因此得到在 MMC 1.0 µg/ml 使用後再加入補中益氣湯比起沒 有加的反而抑制胃癌細胞產生細胞凋亡。而 MMC 1.0 µg/ml 對胃癌細胞 株的細胞凋亡反應有明顯的延遲現象。. 28.

(31) 圖 4.8 保 元 湯 與 MMC 1.0 µg/ml 對 MKN-74 細 胞 株 的 毒 殺 試 驗 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。n = 3. 29.

(32) 圖 4.9 舉 元 煎 與 MMC 1.0 µg/ml 對 MKN-74 細 胞 株 的 毒 殺 試 驗 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。n = 3. 30.

(33) 圖 4.10 四 君 子 湯 與 MMC 1.0 µg/ml 對 MKN-74 細胞株的毒殺試驗 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。n = 3。. 31.

(34) 圖 4.11 六 君 子 湯 與 MMC 1.0 µg/ml 對 MKN-74 細胞株的毒殺試驗 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。n = 3。. 32.

(35) 圖 4.12 補 中 益 氣 湯 與 MMC 1.0 µg/ml 對 MKN-74 細胞株的毒殺試驗 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。n = 3。. 33.

(36) 圖 4.13 三種補氣方劑促進 MMC 0.25 g/ml 對 MKN-74 細胞株毒殺作用 之比較 結果顯示補中益氣湯與保元湯有明顯能促進 MMC 的細胞毒殺作用。其 中以補中益氣湯最顯著。 實驗結果以 mean ± S.D.來表示。* P < 0.05, ** P < 0.01 與 0.25 g/ml mitomycin C 處理實驗組比較(n = 3)。. 34.

(37) 圖 4.14 補 中 益 氣 湯 與 MMC 0.25 µg/ml 的 細 胞 凋 亡 的 反 應 第一組:對照組 第二組:補中益氣湯 3 days 第三組:MMC 0.25 µg/ml 1day 第四組:補中益氣湯 2 days 後加 MMC 0.25 µg/ml 1 day 第五組:MMC 0.25 µg/ml 1 day wash 後加補中益氣湯 2 days 第六組:MMC 0.25 µg/ml 1 day wash 後培養 2 days 第七組:第三天加入 MMC 0.25 µg/ml 及 safingo 50 µM 實驗結果發現,MMC 在 0.25 µg/ml 時,不論有無加入補中益氣湯,或 是之前、之後加入,對於細胞凋亡的發生百分率均無明顯意義。 其結果以 mean ± S.D.來表示。n = 3。. 35.

(38) 圖 4.15 補 中 益 氣 湯 與 MMC 1.0 µg/ml 的 細 胞 凋 亡 的 反 應 第一組:MMC 1.0 µg/ml 1 day 第二組:補中益氣湯 2 days 後加 MMC 1.0 µg/ml 1day 第三組:MMC 1.0 µg/ml 1 day wash 後加補中益氣湯 2 days 第四組:MMC 1.0 µg/ml 1 day wash 後培養 2 days 第五組:第三天加入 MMC 1.0 µg/ml 及 safingo 50 µM 實驗結果 MMC 1.0 µg/ml使用一天後加入補中益氣湯兩天與沒有加入補 中益氣湯有明顯差異,P<0.01。而 MMC 在第一天加入與第三天加入其 細胞凋亡率有明顯的差異,P < 0.05。 其結果以 mean ± S.D.來表示。* P < 0.05, ** P < 0.01(n = 6)。. 36.

(39) 圖 4.16 補中益氣湯與 MMC 1.0 µg/ml 對胃癌細胞株的細胞細胞凋亡反 應 螢光點表示 MKN-74 細胞被 bisbenzimide trihydrochloride 染上細胞核中 的濃縮染色質,表示細胞進行凋亡反應。發現正對照組(MMC 1.0 µg/ml + safingo 50 µM)產生細胞凋亡的比率最多。其次是 MMC 1.0 µg/ml 1 day wash 後培養兩天,第三是 MMC 1.0 µg/ml 1 day wash 後加補中益氣 湯 2 days。顯示出補中益氣湯抑制 MMC 的細胞凋亡反應。. 37.

(40) 第五章 討論 臨床上發現,胃癌的發生是一個複雜的過程,涉及機體多個系統變 化。如局部病理型態、組織學特徵、全身免疫狀況、微量元素、血液流 變學等。這些改變均與中醫辨證分型存在一定關係 32-35。研究顯示,胃 癌組織中,細胞增值活性 PCNA、P53 蛋白、c-erbB-2 蛋白表達明顯增 高,其中以中醫證型虛證組表現顯著 36。其中脾虛與胃癌前病變關係密 切。胃癌前病變,主要伴存於慢性萎縮性胃癌(CAG)。其中 96 篇有 關 CAG 論文中報導的 7496 例 CAG 辨證證型進行歸納,共有證型 23 個, 脾虛證佔首位 37。脾虛症狀的輕重與胃癌前病變及胃癌發生、發展各階 段病變之關係呈現正相關 38。此外,更進一步發現,脾虛氣滯的胃病其 細胞分裂增殖加速,細胞分化產生障礙。由此可知,脾虛氣滯證的胃病 有相當的癌變傾向 39。此外,幽門螺旋桿菌(H.P)是已知的胃癌危險 因子。近來研究發現脾虛證與 H.P 感染關係密切 40。胃黏膜上 c-myc, p21, p53 陽性表達與 H.P 感染、胃黏膜病變呈平行關係,顯示 H.P 感染、致 癌基因及抑癌基因表達與脾虛證關係密切 41。 中醫理論「脾為後天之本、氣血生化之源」及「邪之所湊,其氣必 虛」,健脾補氣為治療胃癌之主軸。研究發現健脾法可延長胃癌患者生 存期,並發現脾虛的嚴重度可預估患者的存活時間及預後 42。由於補氣 方劑中多以健脾為主軸,因此,本實驗針對脾虛證型選定補氣相關方劑 進行研究,以吻合胃癌發生的病理表現。 MMC 應用於化學治療上其副作用主要是骨髓抑制,最常見白血 球、血小板的減少。在中醫辨證上以虛證為主 9,針對白血球減少,臨 床主要以氣虛表現為主,見頭暈、乏力、易汗出,治宜補氣。因此補氣 中藥對於化學治療副作用的緩解有一定的幫助,更加深本實驗選定補氣 方劑的動機。 從研究結果發現,補氣方劑中篩選出補中益氣湯優於其他補氣方 劑,針對給予中醫方劑二天後,第三天再投與 MMC 的實驗中,補中益 氣湯確實能促進 MMC 對胃癌細胞株 MKN-74 的毒殺作用、降低胃癌細 胞之存活率。補中益氣湯是補氣方劑之一種,其適應證型為脾氣虛合併 中氣下陷,臨床上常用於癌症中晚期或是緩解化學治療之毒副作用以及. 38.

(41) 腫瘤術後調養 9,43。最近,體內或體外實驗 44-50 發現補中益氣湯具有化學 保護作用(chemopreventive effects)以及生物反應調節作用(biological response modifier),動物實驗中發現本方劑具有預防性抗腫瘤反應 51,52。 一些報導顯示,補中益氣湯抗腫瘤之成分可能與四種成份有關,像 astragaloside53, ginsenoside54, saikosaponin 55-57, glycyrrhizin58,59。目前,補 中益氣湯抗腫瘤實驗多以活體為主,對於補中益氣湯在細胞作用的詳細 機轉論述較少,更遑論補中益氣湯與化療藥物毒殺細胞的作用機轉,尤 其是針對胃癌。 本實驗結果證實補中益氣湯可促進 MMC 的胃癌細胞毒殺反應。進 一步,我們想探討補中益氣湯促進 MMC 毒殺細胞之作用機轉。由於已 知 MMC 對胃癌細胞株能產生細胞凋亡反應 11,29。而印象中,一般天然 藥物較不具強烈之副作用或是發炎反應。因此,本實驗針對補中益氣湯 是否能促進 MMC 產生細胞凋亡反應進行設計,並嘗試補中益氣湯在 MMC 使用之前或之後加入,比較觀察其細胞凋亡之反應。由定量螢光 顯微鏡分析法得知,補中益氣湯並不能協同促進 MMC 產生細胞凋亡反 應,不管是 0.25 µg/ml 或 1.0 µg/ml。實驗中,有一組正對照組(positive conrol)選取 Safingo 加上 MMC。Safingo 本身是 PKC 的抑制劑,先前 研究顯示 Safingo 可以藉由抑制 PKC 的反應,促進 MMC 產生細胞凋亡 10,11 ,因此,本實驗取其當作正對照組。而實驗組中,當 MMC 在 0.25 µg/ml 時,不論有無加入補中益氣湯,或是之前、之後加入其比較均無 明顯意義。因此,我們嘗試提高 MMC 劑量至 1.0 µg/ml,看是否會拉大 差距,經統計得知,MMC 在第一天加入與第三天加入其細胞凋亡率有 明顯的差異(P < 0.05),因此發現 MMC 本身對胃癌細胞株的細胞凋亡 反應具有延遲現象,亦即 MMC 只給藥一天,在第三天的細胞凋亡率明 顯高於第一天。這一有趣現象是雖不是本次實驗探討的重點,但可提供 在研究 MMC 抗癌藥理上,另一個重要的啟發。補中益氣湯在 MMC 1.0 µg/ml 之前與之後加入有明顯的差異(P<0.05)。而 MMC 1.0 µg/ml 使 用一天後加入補中益氣湯兩天與沒有加入補中益氣湯比較有顯著差異 (P<0.01)。因此得到在 MMC 1.0 µg/ml 使用後再加入補中益氣湯比起 沒有加的反而抑制癌細胞產生細胞凋亡。推論補中益氣湯會抑制 MMC 1.0 µg/ml 產生細胞凋亡,尤其以 MMC 1.0 µg/ml 使用之後加入補中益氣. 39.

(42) 湯其抑制更顯著。針對補中益氣湯能促進 MMC 的細胞毒殺作用,但補 中益氣湯抑制 MMC 的細胞凋亡反應,可確知補中益氣湯對於胃癌細胞 產生細胞壞死反應。 目前研究顯示壞死也是計畫性死亡的一種 60。以往所知,細胞壞死 的產生是身體受病毒、細菌、原生物的感染,然後被細菌毒素,免疫反 應如補體(complement),自然殺手細胞(activated natural killer),腹 膜吞噬細胞(peritoneal macrophage)所誘發。近來發現,身體的其他病 理狀態感染性疾病、Alzheimer disease、癲癇、缺血、發炎疾病均證實與 壞死有關,證實與 cytokines, NO, reactive oxygen species(ROS)的分 泌息息相關。越來越多的的證據顯示,細胞壞死是被調控的,是一種計 畫性死亡。一般所熟知由細胞凋亡所控制的女性濾泡成熟至卵子的過 程,primary T lymphocytes 受活化導致死亡,大腸細胞的更新,目前都 證實細胞壞死亦參與其中 61-63。相信本實驗可以繼續往訊息傳遞路徑探 討,找尋補中益氣湯對於胃癌細胞株壞死的作用機轉。 其次,高尚德等人發表補中益氣湯對肝癌細胞有細胞凋亡作用 64, 與本實驗比較,其發表的補中益氣湯 IC50 依不同肝癌細胞株約為 432µg/ml-2284 µg/ml 與本實驗的 IC50 2.41 mg/ml 相差不多,因其實驗 所用細胞株與本實驗不同,因此補中益氣湯對不同細胞誘發不同反應是 極有可能性的。在補中益氣湯合併 MMC 的共同作用方面,Toshitaka 等 人發表 65 有關補中益氣湯對 MMC 所誘發免疫功能低下的老鼠對於 HSV-1 病毒的感染有保護作用。其作用方向與本實驗的癌症治療方向不 同。另外,游智勝等人 66 發表豬苓萃取物合併 MMC 對肝癌模型老鼠, 發現合併治療比起分別治療可明顯增加其存活率。此研究方向與本實驗 類似,但沒有進入細胞層次探討其機轉。因此我們從體外實驗出發,先 明白補中益氣湯對胃癌細胞之作用機轉,進而向上提升為動物實驗、人 體實驗,一方面運補中益氣湯促進化療藥物毒殺細胞的作用,另一方面 利用健脾補氣來減少化療藥物之副作用,降低胃組織癌變機會。 本實驗仍有許多要探討之處,例如本實驗在細胞存活試驗中應增加 一組正常細胞組,藉以觀察補中益氣湯的實驗濃度是否影響正常胃細 胞。其次,在中藥製備過程中,由於本實驗仿造臨床中藥煎煮過程,利 用純水抽提,並經過多道滅菌過濾,是否有效成份會因抽提過程,或加. 40.

(43) 水稀釋過程將不溶於水的有效成份遺失,這些仍需要進一步探討。 另外,本實驗推測補中益氣湯對胃癌細胞株的毒殺作用來自細胞壞 死,下一步本研究將尋找細胞壞死有效的偵測 Marker,進一步證實補中 益氣湯的對胃癌細胞的毒殺作用確實來自細胞壞死。. 41.

(44) 第六章 結論 一、保元湯、舉元煎、四君子湯、六君子湯、補中益氣湯中,保元湯及 補中益氣湯均明顯促進 MMC 的細胞毒殺作用,其中以補中益氣湯 作用最強。 二、當 MMC 0.25 µg/ml 時,補中益氣湯無明顯促進或抑制 MMC 0.25 µg/ml 產生細胞凋亡反應。 三、當 MMC 1.0 µg/ml 時,補中益氣湯會抑制 MMC 1.0 µg/ml 產生細胞 凋亡,尤其以 MMC 1.0 µg/ml 使用之後加入補中益氣湯其抑制更顯 著。由此可知,補中益氣湯對胃癌細胞的毒殺作用應來自細胞壞死 反應。. 42.

(45) 第七章 參考文獻 1. 中華民國公共衛生年報. 行政院衛生署. 1999;60-61. 2. Palli D. Epidemiology of gastric cancer: an evaluation of available evidence. J Gastroentrol. 2000;35 Suppl 12:84-89. 3. Tadataka Y, Davide HA, Loren L. Textbook of Gastroenterology, 3rd ed. 1996:1500-1524. 4. Hibasami H, Komiya T, Achiwa Y, Ohnishi K. Induction of apoptosis in human stomach cancer cells by green tea catechins. Oncol Rep 1998;5:527-529. 5. Kim JD, Kim JM, Pyo JO, Kim SY, Kim BS,Yu R. Capsaicin can alter the expression of tumor forming-retated genes which might be followed by induction of apoptosis of a Korean stomach cancer cell line, SNU-1. Cancer Lett 1997;120:235-241. 6. Yoshio T, Hitoshi T, Taku T, Haruhide S. Growth inhibition and apoptosis of gastric cancer cell lines by Anemaeehena asphodeloides Bunge. J gastroenterol 2001;36:79-90. 7. Ma J, Fu NY, Pang DB, Wu WY, Xu AL. Apoptosis unduced by isoliquiritigenin in gastric cancer MGC-803 cells. Planta Medica 2001;67:754-757. 8. 曹庭興、朱悟淳:中藥在腫瘤化療過程中對毒副反應的緩解作用。 中國醫院藥學雜誌,1999;19(8):484-485. 9. 徐素紅:癌症化療毒副反應的中醫防治。中國腫瘤臨床與康復, 1999;6(3):72-73. 10. Gary KS, Adriana HF, Scott KD, Desiree E. Reports. J of the National Cancer Institute 1995;87(18):1394-1398. 11. Hsueh CT, Chiu CF, David PK, Gary KS. Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances mitomycin-C-induced apoptosis. Cancer Chemother Pharmacol 2000;45:389-396. 12. 何紹奇:現代中醫內科學。中國醫藥科技出版社,1990:536-539.. 43.

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(51) Effests of Bu Qi formula of Chinese Medicine on the Human Gastric Adenocarcinoma Cells Che-chang Kuo Major professor: Jian-jung Chen Institute of Chinese Medicine Science, China Medical College Gastric cancer is a common cancer worldwide and is reported to be the one of the most common cause of death in Taiwan. However, many patients are found to have advanced cancer at the time of diagnosis, and have poor prognosis despite of cytotoxic anticancer therapy. In this study, we aim to identify an effective regimen combining Tranditional Chinese medicine (TCM) and Mitomycin-C (MMC) on MKN-74 human gastric adenocarcinoma cell line. We are interested in identifying the most effective combination and its mechanism,by way of MTT assay and the Quanitative Flurescent Microscopy assay. Among all the TCM tested, Bu-Zhong-Yi-Qi-Tang (BZYQT, Japanese named Hochu-Ekki-To, TJ-41) enhanced MMC induced cytotoxicity most, BZYQT in combination with MMC showed enhanced cytotoxicity but no increased apoptosis when compared to MMC alone. These cytotoxic MKN-74 cells by BZYQT are from cell necrosis, but not from cell apoptosis. These results provide rationale for further animal study, and clinical trial on gastric cancer therapy. Key word: Bu-Zhong-Yi-Qi-Tang; Hochu-Ekki-To; gastric cancer; Apoptosis; necrosis; Mitomycin-C. 49.

(52) 50.

(53)

數據

表 3.1  補中益氣湯與 MMC 0.25 µg/ml 對 MKN-74 細胞株的細胞凋亡反 應實驗分組表  第一天  第二天  第三天  第一組(負對照)PBS  PBS  PBS  第二組  補中益氣湯  補中益氣湯  補中益氣湯  第三組  PBS  PBS  MMC 0.25 µg/ml  第四組  補中益氣湯  補中益氣湯  MMC 0.25 µg/ml  第五組  MMC 0.25 µg/ml  Wash MMC add 補中益氣湯  補中益氣湯  第六組  MMC 0.25 µg/ml  W
圖 4.1  MKN- 74 細胞株細胞數目的測定  將不同細胞數的細胞株 1000-6000 cells/well  種在 96  孔培養盤中,培養 三天後,用 MTT assay  計算各組細胞存活率。結果發現,細胞數目在 2000 cell/well 到 3000 cell/well 仍屬快速生長期,因此決定取 2500  cells/well,來進行 MKN-74 細胞株培養的實驗。  實驗結果以 mean  ±  S.D.來表示。n = 3。
圖 4.2  保 元 湯 對 MKN74 細 胞 株 的 存 活 曲 線
圖 4.3    舉 元 煎 對 MKN74 細 胞 株 的 存 活 曲 線
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參考文獻

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