行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告
總計畫及子計畫一:放射線菌臭味產生機制與控制技術之研
究(2/3)
計畫類別： 整合型計畫 計畫編號： NSC93-2211-E-006-010- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學環境工程學系（所） 計畫主持人： 高銘木 共同主持人： 曾怡禎 計畫參與人員： 史盟秀 徐尉晏 許雅雯 吳彬豪 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 94 年 6 月 1 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
■ 成 果 報 告
□期中進度報告
自來水中生物性臭味產生機制與控制技術之研究：
放射線菌臭味產生機制與控制技術之研究（2/3）
計畫類別：□ 個別型計畫 ■ 整合型計畫
計畫編號：NSC 93－2211－E －006 －010－
執行期間：
93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日
計畫主持人：高銘木
共同主持人：曾怡禎
計畫參與人員：史盟秀、徐尉晏、許雅雯、吳彬豪
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、
列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢
□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：國立成功大學環境工程學系
國立成功大學生物學系
中 華 民 國 94 年 05 月 31 日
一、前言
如何將原水(raw water，未經淨化處理的水)淨化成為民生飲用之淨水，長久以來一直是 各國政府與廣大民眾所努力與盼望的目標。一般民眾對於辨別飲用水水質乾淨，最直接方 式是否含有臭味(odors)，在歐美各先進國家及日本對飲用水中的臭味問題，已成為民眾抱 怨水質不佳的原因之一(Jensen, 1994；Edward, 1986；Krasner, 1983；Yugi, 1983；Persson, 1983；Medsker, 1968)，國內台灣地區自來水中臭味問題亦常是人民所詬病水質問題之一(林 等，2002；汪與林，2000；陳，1993；陳，1982)。飲用水中常見的臭味包含土霉臭、魚腥 味、氯臭、腐敗臭、青草臭、藻臭等。另根據研究顯示(徐與高，1995)水中引發生物性臭味 產生主要與放射線菌與藻類有顯著之相關影響性，同時亦有學者(林等，2002；汪與林，2000) 之研究指出水源與淨水廠中主要臭味物質為 geosmin 與 2-MIB。由上述之成果在在顯示南 部地區飲用水水質惡化問題不僅延宕多時並亟待解決，其中水中臭味問題更是民眾直接感 受抱怨水質問題的主要來源。
二、研究目的
以往雖有許多研究成果顯示對水源及自來水中臭味物質產生季節、分佈、來源等有一 定程度直接證實，然對於現地產生生物性臭味之放射線菌菌種鑑定尚無明確之研究了解， 本研究計畫符合國科會環工學門規劃主題水組之自來水1-1-1 Problem with Eutrophic Source Water 及微生物/生物技術應用之目的，探討氮磷等營養源對放線菌在自來水中所引起的土 霉臭味之影響，並利用分子生物技術對所篩選出之放線菌進行菌種鑑定工作。三、文獻探討
由放線菌所產生的水源臭味問題，最引起大家關注。如Aham(1929)指出飲用水中所含 有之土霉臭味是由放射線菌所產生；Silvey(1959)研究發現英國河流生產的鮭魚含有土霉臭 亦由放射線菌所引起。因放線菌所引起的土霉臭味，在傳統淨水處理的過程中，很難將它 去除。水源區域常被發現的放線菌屬主要有 Actinomycetes、Streptomyces、Micromonospora、Nocardia 四屬，其中 Actinomycetes、Streptomyces、Micromonospora 三屬為主，均能產生
土霉臭味，而 Nocardia 屬雖不是主要臭味產生之菌屬，卻能引發流行病。放線菌利用的營 養物質不同，因而代謝產物略有不同，但所產生的臭味極為相似，均是土霉臭味。在世界 各蓄水池、湖泊、河川由放射線菌所引起的臭味問題，已不斷的發生，因此，放射線菌一 直為大家研究調查臭味來源的主要對象之一。Suffet et al. (1995) 將歷年來水中的臭味產生 問題進行整理歸納，在其Adance in Taste-and-Odor Treamtment and control 一書中，提到最 早發現水中臭味物質存在的是Gerber 和 Leehevalier (1965)，自水中分離出一種由放射線菌 引起臭味產生的物質，命名為 Geosmin，在低濃度時呈現土霉臭味，而於高濃度時則為刺 激性糞便臭(manorial odor)。而 Medsker (1968) 自 Streptomyces grieus 分離出引發臭味產生 的另一物質，並證明此物質為2-Methylisoborneol(2-MIB)。此二個化學物質，為水源中最常 見的土霉味物質。臭味物質為菌體二次代謝產物(Secondary metabolite)，其形成作用與關係 其生存或繁殖所必須之一次代謝物不同。一般而言，二次代謝物與營養源氮磷有密切的關
係，尤其以NO3-N 和 NH4-N 為主要之限制因子。故本研究擬以自高雄澄清湖水庫底泥所分 離純化放線菌種，應用分子生物技術進行菌種鑑定，並搭配不同營養源種類與濃度，進一 步探討營養源與放線菌產臭濃度之相關性。
四、研究方法
本研究中的放線菌種來源為澄清湖水庫中所採集得的底泥及水樣，首先進行菌種之純 化與增殖培養後，將所分離出之不同放線菌株，培養在不同濃度的氮、磷源之下，主要以 澄清湖水庫近5 年來的水庫水質測站監測值為依據，將氮源分為 NH4-N、NO3-N 與 NO2-N， 磷源以總磷值為參考；以5 年中最高及最低測值作為添加營養之組成，並搭配 2k因子設計 與ANOVA 軟體，探討不同營養來源與濃度對放線菌產臭之交互影響，各實驗條件與組別 如下表1 與表 2 所示。而所分離出之放射線菌株，則進一步運用分子生物技術(DNA 萃取、 PCR、RFLP、CLONING AND SEQUENCING 等)進行菌種鑑定工作。表1 本研究之實驗因子設計 Factors Levels A B C D - 0.02 0.16 0.01 0.03 + 0.72 1.54 0.24 0.25 其中A：為(NH2)2CO濃度(mg/l) B：為KNO3濃度(mg/l) C：為NaNO2濃度(mg/l) D：為K2HPO4濃度(mg/l) 表2 本研究之實驗組別 NH4-N NO3-N NO2-N k2HPO4 1 - - - - 2 + - - - 3 - + - - 4 + + - - 5 - - + - 6 + - + - 7 - + + - 8 + + + - 9 - - - + 10 + - - + 11 - + - + 12 + + - + 13 - - + + 14 + - + + 15 - + + + 16 + + + + 其中＋：high level －：low level
五、結果與討論
1.放射線菌種篩選分離純化： 利用特殊培養基SCA(Starch-Casein Agar)進行菌株之篩選，經過選殖至少 5 次，待其菌 相分佈相同後，進行大量培養及保存。本實驗中依照菌相特性選殖菌種，特性分述如下： (1) 是否產孢：放線菌特性之一為在不適應環境下會產生孢子；(2)產生抑制圈：在面臨其它菌 種的競爭下，放線菌會產生抗生素抑制其它微生物生長，以保持自己的競爭優勢；(3)陷落 培養基：以上2 種特性與黴菌相似，黴菌在生長時會以菌絲向外生長，但放線菌生長於 plate 時會深入培養基，這特性與黴菌則大不相同。以上述的篩選方式，對於採樣回來之水樣及 底泥進行人工選殖，其間共篩選十幾種菌種，經過格氏染色後，取七種格氏陽性菌種進行 後續實驗；再以分子選殖方式篩選，最後篩選出五株菌種(分別以菌種 1、2、3、4 與 5 表 示)進行後續實驗。 2.營養源氮、磷對放線菌產臭之影響： 不同營養鹽種類與濃度添加下，各菌種之產臭結果如下表3 所示；此外，並搭配 ANOVA 軟體進行產臭轉換效應分析，其結果如表4 所示。 表3 不同反應條件下，各菌種之產臭結果 組 別 菌種1 菌種2 菌種3 菌種4 菌種5 2-MIB (ppt) Geosmin (ppt) 2-MIB (ppt) Geosmin (ppt) 2-MIB (ppt) Geosmin (ppt) 2-MIB (ppt) Geosmin (ppt) 2-MIB (ppt) Geosmin (ppt) 1 3.03 ND 5.03 12.28 ND ND ND ND 0.78 ND 2 2.71 ND 5.50 ND 2.34 ND 2.98 ND 2.36 ND 3 2.71 ND 4.57 2.54 ND ND 1.18 ND 2.28 ND 4 ND ND 5.01 ND ND ND 3.05 ND 0.76 ND 5 3.39 ND 5.63 ND 5.65 ND 1.95 ND 5.49 ND 6 ND ND 35.47 ND 7.09 ND 0.95 ND 3.91 ND 7 ND ND 8.56 3.81 ND ND 1.48 ND 1.92 ND 8 ND ND 6.24 1.94 1.74 ND 2.49 ND 4.99 ND 9 ND 0.67 5.18 ND ND ND 6.31 ND 0.91 ND 10 ND 0.79 4.60 ND 4.96 ND 0.59 ND 1.56 ND 11 ND 1.49 ND ND 2.08 ND 0.35 ND 1.29 ND 12 ND ND 4.93 ND ND ND ND ND 2.54 ND 13 ND ND 7.36 ND 4.34 ND ND ND 1.37 ND 14 ND 2.16 3.19 2.71 3.08 ND 0.27 ND 0.71 ND 15 ND 1.13 42.9 18.31 2.08 ND ND ND 2.50 ND 16 ND ND 3.33 ND 3.72 ND ND ND 5.06 ND表4 菌種產臭轉換效應分析表
菌種 1 2 3 4 5
Odor 2-MIB Geosmin 2-MIB Geosmin 2-MIB Geosmin 2-MIB Geosmin 2-MIB Geosmin η 0.75 0.40 9.22 2.60 2.3 ND 1.35 ND 2.40 ND A -0.80 -0.04 -1.37 -4.03 1.09 ND -0.12 ND 0.67 ND B -0.80 -0.12 0.45 1.45 -2.2 ND -0.56 ND 0.53 ND AB 0.13 -0.61 -7.76 -1.64 -0.77 ND 0.76 ND 0.67 ND C -0.63 0.04 9.73 1.49 -0.93 ND -0.91 ND 1.68 ND AC -0.05 0.30 -2.69 -0.33 -0.21 ND 0.19 ND 0.18 ND BC -0.05 -0.13 1.90 3.88 -0.93 ND 0.76 ND 0.22 ND ABC 0.72 0.77 -9.13 -4.08 1.57 ND -0.32 ND 1.30 ND D 1.47 -0.04 -0.56 0.06 0.43 ND -0.81 ND -0.82 ND AD - 0.80 -0.12 -8.48 0.13 -0.28 ND -1.33 ND 0.28 ND BD 0.80 -0.61 7.26 2.45 1.1 ND -1.14 ND 1.18 ND ABD -0.13 -0.21 0.28 -3.61 -0.26 ND 0.53 ND 0.28 ND CD 0.63 0.04 0.79 3.76 -0.75 ND -0.83 ND -0.85 ND ACD 0.05 0.30 -9.34 -3.56 -0.42 ND 1.40 ND -0.18 ND BCD 0.05 -0.13 8.24 0.02 1.24 ND 0.81 ND 0.81 ND ABCD -0.72 -0.21 -1.1 -1.17 0.91 ND -1.10 ND -0.64 ND 利用ANOVA 進行產臭轉換效應分析中，因參考監測站之營養源濃度，在 88 年以後都 較穏定且偏低，而軟體反應出來之效應是以高低 Level 之間的差距為依據，故其主要影響 因子並不顯著，所以在探討影響因子方面，以絕對值大於或接近平均值η作影響因子之討 論，若沒有較接近平均值η之影響因子，則以最大之影響因子作討論。各分離菌種之結果 分述如下： (1)菌種 1： 2-MIB 以氨氮、硝酸氮為主要的單一影響因子；而複合因子之交 互影響亦頗為顯著；Geosmin 則以沒有單一影響因子，主要是以複合因子之影響為主。(2) 菌種 2：2-MIB 以亞硝酸氮為主要的單一影響因子；而複合影響因子則有主要為氨氮與亞 硝酸氮；Geosmin 以氨氮為主要的單一影響因子；而複合影響因子部份，仍以氮源佔大多 數，磷源僅在部分組別有些許影響情況發生。(3)菌種 3：2-MIB 主要以硝酸氮為單一影響 因子，其餘並沒有發現較顯著之影響因子；而Geosmin 則無偵測到，因曾有文獻結指出， 部份放線菌屬，如 Streptomyces grieus 只會產生臭味物質 2-MIB 而不會產生 Geosmin，故推 測此菌株因應屬此放線菌屬，此部分需仰賴後續分子生物菌種鑑定結果進一步佐證。(4)菌 種 4：其 2-MIB 以複合影響因子較為顯著，分別為氨氮與磷源之相關性，及氨氮、亞硝酸 氮、磷源之相關性；Geosmin 則亦偵測不到，與菌種 3 結果相似，推測應皆屬 Streptomyces grieus。(5)菌種 5：2-MIB 以亞硝酸氮為主要之單一影響因子，並沒有發現其餘較顯著之影 響因子；Geosmin 偵測亦無產生，故推測應與菌種 3 與 4 之情況相似。 綜合以上 5 種菌種之影響因子，以氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮之相關性為最通用之影響 因子。目前此方面之相關研究，多集中於探討氨氮及硝酸氮所導致之影響，尚無人著墨於 亞硝酸氮影響部分，其原因可能是因亞硝酸氮為中間產物，存在的時間並不久，但本研究 實驗結果卻顯示，亞硝酸氮在部分組別仍為臭味產生影響因子之ㄧ，故其重要性與影響程 度亦不容忽視。至於磷源部分，單一影響並不顯著，主要仍以和氮源間之交互影響為主。
3. 應用分子生物技術鑑定分離單株之菌種：
(1)DNA 萃取：將選出之微生物以大量培養方式，利用 kit 萃取其 DNA，以進行後續之 實驗； 由於萃取 DNA 的商業 kit 眾多，需依照微生物本身之生理構造選擇，且 DNA 萃取為最基本之步驟，萃取需要大量的時間及次數，故選擇kit 時最需考量的是效率 問題。 (2)PCR：在 PCR 過程中常有過多的雜訊出現，推估結果應該是 primers 專一性不足，導 致無法精準的夾出正確的PCR 產物；而通常進行較大量總體積 (50μL)之 PCR 實驗 時，較易有雜訊出現，故將反應體積改為較微量之20μL 及 10μL 後，則並無雜訊 之出現。故後期實驗皆以較小之總體積進行反應。
(3)Cloning 之效率：由於選用之 kit 其 positvie 之效率只有接近 60%，故在產物之藍白篩 選時，以最適之劑量配比，仍只能達到60%左右之水準。但其出現白點之 insert 成功 率較高，且出現之偽白點較少，故在此水準下仍屬可接受之範圍。
(4)Insert check：在做過 insert check 後發現其 PCR 產物皆出現為正確的位置，故以此 PCR 產物作為後續RFLP 所使用之樣本。
(5)RFLP 篩選：以 Hha I 及 Hinf I 2 種限制酵素進行菌種 DNA 片段偵測，以 Hha I 之效 果較好，能分辨出篩選出菌種間之差異，而Hinf I 則無法辨別出菌種間的差異性。故 在選擇酵素時，考量酵素之鑑別度為首要考慮之因素。 (6)Sequencing：委由生物科技公司對此 5 株分離菌種進行菌種鑑定後發現，其中菌種 2 屬 Actinomycetales 外，而菌種 3、4 及 5 皆為 streptomyces，此部分與先前菌種產臭結 果發現此三種菌株無Geosmin 產生之結果相符合，應與該菌屬不具 Geosmin 之產臭 能力有關。
六、結論與建議
本研究探討由選定之水庫底泥樣品，先以人工選殖方式篩選放線菌種，再以篩選出之 菌種，以批次培養方式，討論營養源氮、磷對其產臭之影響；以及利用cloning 及 RFLP 等 以16s rDNA 為分析基礎的分子生物鑑定技術，討論以人工選殖之放線菌，在分子生物學分 類之分類定位，在一系列的分析實驗中，得到之結論與建議如下： 1.依據近 5 年的監測站水文資料，澄清湖水庫的營養源變動不大，也不像 88 年之前有大量 營養源過甚導致產生嚴重的臭味問題。 2.根據其水文資料所作的營養源對產臭之影響，並沒有比較明顯的影響因子，只能取其較 大之影響數字進行討論；而其中因子並沒有較明顯的單一影響源。 3.複合因子中，通常以三種氮源複合影響為較重要之影響因子，而磷源除菌種 1 以外，其 餘皆以複合氮源之影響為重。4.DNA 萃取 kit 由於已商業化，如何選擇適合之 kit 為其重要之步驟；而其中又以打破細胞 壁為最重要之步驟。
無法培養的缺點，善用其工具能為鑑別方面作良好的分類。 6.PCR 之操作中，各劑量之濃度須找尋其最佳劑量及最佳操作條件，如此才能發揮 PCR 最 大效應。且因為PCR 時間冗長，故實驗前之規劃與設計需嚴謹，避免失敗及重覆。 7. Clone 中的最大效率只有 60%，如何加強其效率為其後研究之重要課題。 8. RFLP 其目的為辨別各種菌相，其中酵素之選取以其是否具有鑑別度為重要的關鍵。所以 在選取酵素前，若能先下載 Gene bank 裡的資料進行電腦模擬，應該選擇出較適合之限 制酵素，以免實驗結果不具鑑別度。
