麩醯胺添加對子癇前症引致之黏著分子表現之影響
Effects of glutamine supplementation on the expression of cellular adhesion molecule induced by preeclampsia
許淳森
1仇思源
1梁守蓉
1張君堯
1邱琬淳
2 *葉松鈴
2 #Department of Obstetrics and Gynecology, Wan-Fang Hospital
1, Graduate Institute of Nutrition and Health Sciences
2, Taipei Medical University 市立萬芳醫院婦產科部
1臺北醫學大學保健營養學研究所
2前言前言
子癇前症（preeclampsia）為臨床上常見的妊娠併發症，其症狀包括高血壓、蛋白尿及水腫等。有研 究發現，子癇前症的孕婦會有全身性的發炎反應及內皮細胞（endothelial cell，EC）受損的情形，其胎盤 可能會分泌過多的細胞激素（包括：IL-1β、IL-6及IL-8等），進而刺激內皮細胞的黏著分子（adhesion molecules）表現增加，造成白血球之滾動、黏著及遷移至組織中，使孕婦及胎兒之氧化壓力增加，造成母 體組織之損傷，並會使胎兒發生血管病變、生長遲緩甚至死亡。因此若能降低子癇前症孕婦血管內皮細胞 上黏著分子的表現，或是減少白血球遷移到組織中，應可減輕其引致之組織傷害；另外亦有研究發現子癇 前症之孕婦其血漿中同半胱胺酸（homocysteine）會升高、一氧化氮（nitric oxide；NO）含量則會降低，
亦會影響到EC之功能。麩醯胺（glutamine，GLN）為免疫細胞及腸黏膜細胞之重要能量來源，由於其在 體內可以自行合成，故常被忽略其重要性。近來之研究發現，在創傷或是異化性代謝疾病時，血液及骨骼 肌中的GLN濃度明顯下降，其下降量的多寡，往往與病患之存活率相關，因此在某些疾病狀況下GLN被認 為是一種必需胺基酸。有研究顯示，GLN可以減少腸道中細胞黏著分子（intercellular adhesion molecule- 1；ICAM-1）之過度表現；給予老鼠 indomethacin 刺激腸道產生發炎反應時，發現GLN之給予可以減少白 血球發生黏著及遷移的現象。因此GLN對於內皮細胞的黏著分子之表現，具有其影響力。目前並無任何研 究探討營養素介入對於子癇前症孕婦免疫黏著分子表現、細胞激素分泌與一氧化氮含量之影響，由於EC功 能的好壞與否，會影響孕婦及胎兒的健康狀況。因此本研究目的，主要是想了解子癇前症孕婦血漿中GLN 濃度是否較正常孕婦低；另外以人類臍帶靜脈內皮細胞為實驗模式，給予GLN介入後，探討子癇前症孕婦 血液對於細胞黏著分子、細胞激素及一氧化氮之影響。
材料與方法
一、血液中麩醯胺及黏著分子含量之分析
收集正常孕婦10名、子癇前症孕婦16名，分析其血液中 GLN、sICAM-1 及sVCAM-1 之含量。
二、人類臍帶靜脈內皮細胞之收集
將人類臍帶靜脈血管以含有collagenase type I（1 mg/ml）之 PBS 灌流20分鐘，沖下之HUVEC 放入含有 20% FCS之 M 199培養，再將之繼代培養在含有0.1% gelatine之培養皿中，經過2-3次繼代所得到的 HUVEC，再進入實驗。
三、實驗設計
將不同濃度的GLN（0、300、600、1000 μM）加入 insert中與 HUVEC共同培養24小時，再加入子癇前 症孕婦之血漿刺激，每1.5 小時收集insert上層培養液和 HUVEC供分析（如下圖所示）。GLN 300μM為 低生理濃度，600μM為正常生理濃度， 1000μM則為高濃度。
○
結果與討論 結果與討論
一、正常女性之血中GLN平均濃度約為 600μM，由本實驗結果得知正常孕婦血中 GLN濃度略低於未懷 孕婦女，而子癇前症患者其血液中GLN濃度顯著低於正常孕婦組。但黏著分子之含量則在兩組之間沒有 統計上的差異。有研究指出在懷孕末期，血漿中sVCAM濃度，不論在有或無子癇前症均無差異，與本實 驗之結果相似。
統計方法 統計方法
數據以mean ± SD 表示，進行 two-way ANOVA with fisher’s test，p < 0.05表示有統計上的差異。
GLN sICAM sVCAM
nmole/ml ng/ml ng/ml
Preeclampsia 346.5 ± 55.4* 297.9 ± 66.8 2347.2 ± 547.4 Normal 466.0 ± 9.2 297.8 ± 36.6 1971.6 ± 703.1
Table 1. Plasma glutamine, sICAM and sVCAM concentrations in pregnant women with or without preeclampsia.
* p< 0.05 vs women with normal pregnancy.
二、Fig. 1 之結果顯示：600 μM GLN之添加，在子癇前症孕婦血漿刺激後4.5及 6小時，可顯著較其他濃 度組降低HUVEC 之ICAM-1 表現。此結果顯示與低生理濃度GLN組相較，培養在正常生理濃度GLN之內 皮細胞可降低ICAM-1之表現量，推測 GLN之添加可能有助於減輕子癇前症引致血管內皮細胞之發炎反 應。
三、Fig 2. 之結果顯示：NO 之濃度在各組及各時間點上均無統計上的差異。有研究顯示不論有或是無罹 患子癇前症之孕婦，其血漿均不會影響內皮細胞上NOS（NO synthase）之 mRNA表現，因此 NO可能不 是影響EC活化的因子；在本實驗結果發現不論GLN添加之濃度多寡，均不影響 HUVEC 之 NO分泌量，
顯示GLN降低 ICAM-1之表現並不是藉由調控NO之故。
四、Fig 3. 結果顯示：IL-8之分泌量隨著時間的增加而增加，但各時間點組間並無差異， 顯示GLN對於 HUVEC在以子癇前症孕婦血漿刺激後IL-8之分泌並無影響。過去的研究發現，嚴重的子癇前症孕婦血漿 可能會藉由刺激NO之釋出，進而促進內皮細胞IL-8之分泌， IL-8之分泌也會促進ICAM-1之表現。在本實 驗中我們並未觀察到三者之間的相關性，可能是因為內皮細胞無法誘發足夠的NO來調節IL-8之分泌， 至 於GLN之添加是藉由何種機制來調節ICAM-1之表現，則有待更進一步之研究。
Fig.1 Effect of pretreatment with different glutamine ( 0, 300, 600, 1000 μM ) concentrations on ICAM-1 expression in HUVEC stimulated by preeclamptic plasma. * p< 0.05 compared with groups at the same time point
Fig.3 Effect of pretreatment with different concentrations of glutamine ( 0,300,600,1000μM ) on IL-8 production from HUVEC after stimulation with preeclamptic plasma. * p< 0.05 compared with groups at the same time point.
Fig.2 Effect of pretreatment with different concentrations of glutamine ( 0, 300, 600, 1000μM ) on nitric oxide released from HUVEC after stimulation with preeclamptic plasma.
* p< 0.05 compared with groups at the same time point.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0 1.5 3 4.5 6
Time (h)
IL-8 (pg/ml)
0 300 600 1000 0
5 10 15 20 25 30 35
0 1.5 3 4.5 6
Time (h) NO (μM)
0 300 600 1000
* *
0 10 20 30 40 50 60 70
0 1.5 3 4.5 6
Time (h)
ICAM-1(%)
0 300 600 1000
結論結論
本研究發現：子癇前症孕婦血漿中GLN 濃度低於未患有子癇前症之孕婦；且正常生理濃度GLN之添 加，可以降低子癇前症孕婦血漿刺激HUEVC 所引致之 ICAM-1 表現。
參考資料參考資料
1. Var A, Yildrim Y, Onur E, Kuscu NK, Uyanik BS, Goktalay K and Guvenc Y. (2003) Endothelial dysfucntion in preeclampsia. Gynecol Obstet Invest 56: 221-224.
2. Daniel Y, Kupferminc MJ, Baram A, Geva E, Fait G and Lessing JB. (1999) A selective increase in plasma soluble vascular cell adhesion molecule-1 level in preeclampsia. Am J Reprod Immunol 41: 407- 412.
3. Wang X, Athayde N and Trudinger B. (2004) Maternal plasma from pregnant women with umbilical placental vascular disease not affect endothelial cell mRNA expression of nitric oxide synthase. J Soc Gynecol Investig 11: 149-153.
HUVEC 2×105
0、300、600、1000 μM GLN 24 h
子癇前症孕婦之血漿
進行分析
（1）Insert上層：分析IL-8、NO量
（2）以flow cytometry測量細胞上 ICAM-1 表現量
0 1.5 3.0 4.5 6.0 h 0 h
