國立台東大學生命科學研究所 碩士論文
指導教授：郭曜豪 教授
桃實百日青化學成分及 其生物活性之研究
Studies on the Chemical Constituents and Biological Activities of Podocarpus nakaii
研究生：范龍雲 撰
致謝
時光飛逝，轉眼間又過了二個年頭，也即將完成碩士階段的歷 練。首先由衷感謝恩師郭曜豪教授，對於學生在天然物研究上的啟發 和教誨，更感謝老師提供舒適的實驗和生活環境，讓學生無後顧之憂 在研究方面，學生在此至上最誠摯的敬意與感激。
此外，感謝口試委員國立中山大學洋海資源系沈雅敬教授與國立 台東大學生命科學所廖尉岑博士對此論文細心審查，並提供寶貴的建 議，使本論文更加完善。在實驗方面，感謝國立中國醫藥研究所楊麗 明老師在生物活性檢測上的指導及幫助，以及感謝行政院農委會特有 生物保育中心黃士元博士，提供本論文材料的寶貴資訊。最後感謝台 東大學生科所彭仁君所長，對學生在外校做實驗的時間，給予最大的 方便與照顧。
在研究期間特別感謝國立中國醫藥研究所提供良好的環境及實 驗器材，使本實驗進行的如此順利。另外也要感謝學長姐和實驗室夥 伴在各方面的指導及照顧，包含：家成、肇麟、麗杰、慧琪、雅雯、
祐任、家慶、力川、萍君、羽涵、逸辰及其他學弟妹。另外感謝台東 大學惠嵐、尚澄、宏彥、玉珊、玟伶等及在台北這段時間收留過我的 大鈞和銘偉，當然還有 341 的兄弟們。
最後，感謝在背後永遠支持我的母親、哥哥及ㄧ路陪我走來的銓 佩，和許多親戚朋友的鼓勵。這本論文沒有你們是完成不了的，再ㄧ 次的由衷的感謝你們。還有要告訴老爸您擔心上不了成功嶺的弟弟研 究所畢業了。
桃實百日青化學成分及生物活性之研究
范龍雲
國立台東大學生命科學研究所
中文摘要
桃實百日青(Podocarpus nakaii Hayata)屬於羅漢松科羅漢松屬的 植物。進行一系列生物活性試驗篩選時，發現桃實百日青乙醇粗萃物 對於人類口腔上皮癌細胞(KB)及子宮頸癌細胞(Hela)具有細胞毒殺作 用，因此進行桃實百日青的莖皮部有效成分分離，從氯仿層中總共分 得十四個化合物，其中包含二個二萜類化合物，分別為lambertic acid (1) 和 4β-carboxy-17-hydroxy-19-nortotarol (2)；二個 norditerpenes 類 化合物，分別為inumakilactones B (3)和 podolactone E (4)；四個苯環 類化合物為isovanillin (6)、4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (7)、
vanillin acid (8)、4-ethoxy-3-hydroxybenzoic acid (9) ；二個固醇類化 合物，分別為 β-sitosterol (10) 和 β-stiosteryl glucoside (11) ；二個 chalcone 類化合物 4,4'-dihydroxychalcone (12)、podonakachalcone A (13)，以及 vomifoliol (5)和一個苯丙基類化合物 14。其中化合物 13 為新化合物。
在生物活性方面，化合物 3 和 4 具有相當的細胞毒殺效果，化合 物 1、7、10、12、13 和 14 亦有微弱的細胞毒殺作用。在針對第一型 拓樸異構酶(DNA Topoisomerase I)的抑制方面，發現化合物 2 和 12 有輕微的抑制效果
。
另外再進行抗氧化清除(DPPH)試驗，化合物 7、8、9 和 13 在濃度200 μg/ml 時對於 DPPH 都有達到 80%以上的有效 清除率。
Studies on the chemical constituents and bioactivities of Podocarpus nakaii
Lung-Yun Fan
As a continuing search for bioactive agents from Taiwanese plants , we found that the EtOH extracts of Podocarpus nakaii Hayata showed the cytotoxicity against several human tumor cells in vitro. Using bioassay-directed fractionation from the chloroform layer of crude EtOH extracts, fourteen compounds including two diterpenes, lambertic acid (1) 4β-carboxy-17-hydroxy-19-nortotarol (2), two norditerpene inumakilactones B (3), podolacton E (4), four benzenoid, isovanillin (6)4-hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (7), vanillin acid (8), 4-ethoxy-3-hydroxybenzoic acid (9), two steroid, β-sitosterol (10) β-stiosteryl glucoside (11), two chalcone, 4,4'-dihydroxychalcone (12), podonaka A (13), as well as vomifoliol (5), and one phenylpranoid, compound 14, were isolated. The structures of isolated compounds were elucidated by spectral analysis. Among them , compounds 13 were isolated for the first time from natural source .
Biological evaluation revealed that compounds 3 and 4 have strong cytotoxic effects, and compounds 1, 7, 10, 12, 13 and 14 have moderate cytotoxic effects, against Daoy, WiDr, KB and Hela tumor cells.
Furthermore, compounds 2 and 12 were demonstrated to have the inhibitory effect against DNA topoisomerase Ⅰ. Moreover, 7, 8, 9 and 13 have strong antioxidative effects assayed by DPPH.
目錄
頁次 中文摘要……….Ⅰ 英文摘要……….…….Ⅱ 目錄………Ⅲ 圖表目錄………Ⅴ 縮寫表………Ⅹ
第一章 緒論……….1
第一節 前言………1
第二節 研究目的………..……...6
第三節 桃實百日青植物介紹………..7
第二章 材料與方法………35
第一節 實驗儀器與藥品………35
第二節 桃實百日青化學成分之萃取與分離………37
第三章 結果與討論………40
第一節 結構解析………40
1-1 Lambertic acid (1)之結構解析………43
1-2 4β-Carboxy-19-nortotarol (2)之結構解析………50
1-3 Inumakilactones B (3)之結構解析………57
1-4 Podolactone E (4)之結構解析………64
1-5 Vomifoliol (5)之結構解析………68
1-8 Vanillic acid (8)之結構解析………84
1-9 4-Ethoxy-3-hydroxybenzoic acid (9)之結構解析…………88
1-10 β-Sitosterol (10)之結構解析……..………92
1-11 β-Stiosteryl glucoside (11)之結構解析……….………96
1-12 4,4'-Dihydroxychalcone (12)之結構解析………100
1-13 podonakachalcone A (13)之結構解析…..………106
1-14 化合物 14 之結構解析…….………113
第四章 生物活性試驗……….……120
第一節 癌細胞毒殺分析實驗………120
第二節 抑制 Topoisomerase I 催化活性試驗………123
第三節 細胞凋亡(Apoptosis)活性試驗………126
第四節 清除 DPPH 自由基能力之測定………129
第五章 結果………132
第六章 參考文獻………135
圖表目錄
圖之目錄 頁次
圖一、桃實百日青植物外觀及其果實………8
圖二、羅漢松(Podocarpus)屬植物化合物之化學結構………….……16
圖三、桃實百日青(Podocarpus nakaii)分離流程………39
圖1-1. Lambertic acid (1)之1H-NMR 圖譜………46
圖1-2. Lambertic acid (1)之13C-NMR 圖譜………46
圖1-3. Lambertic acid (1)之 HMQC 圖譜………47
圖1-4. Lambertic acid (1)之 HMBC 圖譜………47
圖1-5. Lambertic acid (1)之 COSY 圖譜………48
圖1-6. Lambertic acid (1)之 EI-MS 圖譜………48
圖1-7. Lambertic acid (1)之 IR 圖譜………49
圖2-1. 4β-Carboxy-19-nortotarol (2)之1H-NMR 圖譜……….…..……53
圖2-2. 4β-Carboxy-19-nortotarol (2)之13C-NMR 圖譜…………..……53
圖2-3. 4β-Carboxy-19-nortotarol (2)之 HMQC 圖譜………..……54
圖2-4. 4β-Carboxy-19-nortotarol (2)之 HMBC 圖譜………..……54
圖2-5. 4β-Carboxy-19-nortotarol (2)之 COSY 圖譜….………..………55
圖2-6. 4β-Carboxy-19-nortotarol (2)之 EI-MS 圖譜….…………..……55
圖2-7. 4β-Carboxy-19-nortotarol (2)之 IR 圖譜………...………56
圖3-1. Inumakilactones B (3)之1H-NMR 圖譜………..……....….……60
圖3-2. Inumakilactones B (3)之13C-NMR 圖譜……….….………60
圖3-3. Inumakilactones B (3)之 DEPT 圖譜………..……..………61
圖3-4. Inumakilactones B (3)之 HMQC 圖譜……….….…………61
圖3-5. Inumakilactones B (3)之 HMBC 圖譜…………..………62
圖3-8. Inumakilactones B (3)之 IR 圖譜………..………63
圖4-1. Podolactone E (4)之 1H-NMR 圖譜………66
圖4-2. Podolactone E (4)之 13C-NMR 圖譜………...…………66
圖4-3. Podolactone E (4)之 13C-NMR 圖譜…….….………….………67
圖4-4. Podolactone E (4)之 IR 圖譜………...………67
圖5-1. Vomifoliol (5)之1H-NMR 圖譜………70
圖5-2. Vomifoliol (5)之13C-NMR 圖譜………...………70
圖5-3. Vomifoliol (5)之 DEPT 圖譜………71
圖5-4. Vomifoliol (5)之 HMQC 圖譜………...…...…………71
圖5-5. Vomifoliol (5)之 HMBC 圖譜………...………72
圖5-6. Vomifoliol (5)之 COSY 圖譜………...………72
圖5-7. Vomifoliol (5)之 ESI-MS 圖譜………...………73
圖5-8. Vomifoliol (5)之 IR 圖譜………...…...………73
圖6-1. Isovanillin (6)之1H-NMR 圖譜………....………76
圖6-2. Isovanillin (6)之13C-NMR 圖譜………...………76
圖6-3. Isovanillin (6)之 EI-MS 圖譜………...………77
圖6-4. Isovanillin (6)之 IR 圖譜……….…...………77
圖7-1. 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (7)之1H-NMR 圖譜..….80
圖7-2. 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (7)之13C-NMR 圖譜…..80
圖7-3. 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (7)之 HMQC 圖譜….…81 圖7-4. 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (7)之 HMBC 圖譜…...81
圖7-5. 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (7)之 COSY 圖譜…...82
圖7-6. 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (7)之 EI-MS 圖譜..…...82
圖7-7. 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde (7)之 IR 圖譜……....…83
圖8-2. Vanillic acid (8)之 EI-MS 圖譜..……….…………87
圖8-2. Vanillic acid (8)之 IR 圖譜..……….………87
圖9-1. 4-Ethoxy-3-hydroxybenzoic acid (9)之1H-NMR 圖譜…………90
圖9-2. 4-Ethoxy-3-hydroxybenzoic acid (9)之13C-NMR 圖譜……...…90
圖9-3. 4-Ethoxy-3-hydroxybenzoic acid (9)之 EI-MS 圖譜………91
圖9-4. 4-Ethoxy-3-hydroxybenzoic acid (9)之 IR 圖譜………..91
圖10-1. β-Sitosterol (10)之1H-NMR 圖譜…………..………94
圖10-2. β-Sitosterol (10)之13C-NMR 圖譜………….………94
圖10-3. β-Sitosterol (10)之 EI-MS 圖譜…………..………95
圖10-4. β-Sitosterol (10)之 IR 圖譜……….…95
圖11-1. β-Stiosteryl glucoside (11)之 1H-NMR 圖譜…...…….…..…98
圖11-2. β-Stiosteryl glucoside (11)之 13C-NMR 圖譜…...…....………98
圖11-3. β-Stiosteryl glucoside (11)之 ESI-MS 圖譜……….………….99
圖11-4. β-Stiosteryl glucoside (11)之 IR 圖譜………...99
圖12-1. 4,4'-Dihydroxychalcone (12)之1H-NMR 圖譜……….……...102
圖12-2. 4,4'-Dihydroxychalcone (12)之13C-NMR 圖譜………...102
圖12-3. 4,4'-Dihydroxychalcone (12)之 DEPT 圖譜………..…...103
圖12-4. 4,4'-Dihydroxychalcone (12)之 HMQC 圖譜………...103
圖12-5. 4,4'-Dihydroxychalcone (12)之 HNBC 圖譜……….…...104
圖12-6. 4,4'-Dihydroxychalcone (12)之 COSY 圖譜……….…...104
圖12-7. 4,4'-Dihydroxychalcone (12)之 EI-MS 圖譜……...……..…...105
圖12-8. 4,4'-Dihydroxychalcone (12)之 IR 圖譜……….…...………...105
圖13-1. podonakachalcone A (13)之1H-NMR 圖譜………..…...109
圖13-2. podonakachalcone A (13)之13C-NMR 圖譜……….…...109
圖13-5. podonakachalcone A (13)之 HMBC 圖譜………...……..…...111
圖13-6. podonakachalcone A (13)之 COSY 圖譜………..……...111
圖13-7. podonakachalcone A (13)之 EI-MS 圖譜………..……...112
圖13-8. podonakachalcone A (13)之 IR 圖譜……….………...112
圖 14-1. 化合物 14 之 1H-NMR 圖譜……….……..…………...116
圖 14-2. 化合物 14 之 13C-NMR 圖譜………..…………...116
圖 14-3. 化合物 14 之 HMQC 圖譜………..………...117
圖 14-4. 化合物 14 之 HMBC 圖譜………..………...117
圖 14-5. 化合物 14 之 COSY 圖譜………..……….……...118
圖 14-6. 化合物 14 之 ESI-MS 圖譜………..……..……...118
圖 14-7. 化合物 14 之 IR 圖譜………..…………...119
圖四、化合物 1、2、3、4、12 和 13 對於 topoisomerase I 的試驗電泳 圖………125
圖五、CPT 與化合物 1、2、3、4、12、13 對於 topoisomerase I 的抑 制百分率………125
圖六、ELISA-Enzyme-linked immunosorbent assay……….128
圖七、1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH 之化學結構式…………129
表之目錄
頁次表一、羅漢松(Podocarpus)屬植物化合物之化學研究……….………9
表3-1 化合物(1) 之核磁共振圖譜數據整理………45
表3-2 化合物(2) 之核磁共振圖譜數據整理………52
表3-3 化合物(3) 之核磁共振圖譜數據整理………59
表3-4 化合物(4) 之核磁共振圖譜數據整理………65
表3-5 化合物(5) 之核磁共振圖譜數據整理………69
表3-6 化合物(6) 之核磁共振圖譜數據整理………75
表3-7 化合物(7)之核磁共振圖譜數據整理………..………79
表3-8 化合物(8)之核磁共振圖譜數據整理……..………85
表3-9 化合物(9)之核磁共振圖譜數據整理……..………89
表3-10 化合物(10)之核磁共振圖譜數據整理……...…….…………93
表3-11 化合物(11)之核磁共振圖譜數據整理….…….…...…………97
表3-12 化合物(12)之核磁共振圖譜數據整理………….………101
表3-13 化合物(13)之核磁共振圖譜數據整理………….………108
表3-14 化合物(14)之核磁共振圖譜數據整理………….………115
表二、Cytotoxicity data of compounds 1-14………122
表三、化合物 1-14 清除 DPPH 自由基能力之測定………..131
表四、化合物 7、8、9 和 13 與抗氧化劑 Vitamin E 比較表……..131
縮寫表
δ Chemical shift (ppm) COSY Correlated spectroscopy
DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO Dimethyl sulfoxide
EI-MS Electron impact mass spectrum
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay ESIMS Electrospray ionization mass spectrum FABMS Fast atom bombardment mass spectrum HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HMQC Heteronuclear multiple quantum coherence HPLC High performance liquid chromatography
Hz Hertz
IR Infrared
MS Mass spectrum
MTT 3-4,5-Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
NMR Nuclear magnetic resonance
NOESY Nuclear overhauser and exchange spectroscopy PBS Phosphate-buffered saline
PI Propidium iodide
UV Ultraviolet
第一章 緒論
第一節 前言
隨著時代的進步，為人類帶來了科技及生活上的便利，但隨著飲 食及生活環境的改變，現今的文明病也越來越多，根據 2005 年衛生 署公佈的十大死因中，癌症及老化疾病就佔了八成。其中癌症更是近 二十多年來蟬聯十大死因的榜首。但高療效、副作用小及不產生交叉 耐藥性的抗癌藥物仍然不多，而且目前的藥物在臨床上要達到根治的 目標都還相差甚遠，所以從天然物去尋找新穎、有效和副作用小的新 藥則仍是當務之急。
台灣位於北回歸線上，其地理位置涵蓋熱帶及亞熱帶，加上島中 高山林立，蘊育了熱、暖、溫、寒等各帶的生態體系，加上台灣四面 環海，並成為冰河時期植物的避難所，雖然台灣陸地面積不大，卻擁 有極為豐富的植物種類。根據台灣植物誌第二版所述，1目前台灣已 知的維管束植物有四千零七十七種，其中特有種就高達一千零六十七 種，所以針對台灣豐富的特有種中又不破壞生態下，去探討其化學成 分及生物活性，應有其開發潛能。
目前天然物研究的方向初步會以一些試驗方法，作為篩選其植物 是否有研究或開發新藥的潛能，細胞毒殺(MTT cytotoxicity assay)則 是篩選是否對於癌細胞有所毒殺的效用的方法之ㄧ，這種方法是利用 細胞的粒線體中含有的脫氫酵素(dehydrogenase)，此酵素與 MTT 反 應，會將MTT 之 tetrazolium 環切斷。此時，顏色由原有的淡黃轉為 暗藍之formazan。可以利用 ELISA reader 讀取波長 550 nm 之吸光度，
胞沒走向細胞死亡的途徑。因此近年來研發治療癌症的新藥研究方向 透過各種訊息傳遞調控並誘導癌細胞走向凋亡，達成消滅癌細胞功 用。2一般生物體內，細胞死亡的方式主要經由兩種途徑：一為壞死 (necrosis)，另一種為細胞凋亡 (apoptosis)。當細胞遭受到外來刺激或 壓力，如缺氧、缺血、化學毒等所引其的細胞死亡，其主要是經由壞 死的路徑，造成細胞內胞器膜及細胞膜上負責調控水分、電解質運輸 的蛋白質失去功能，引起細胞內水份不斷屯積，進而腫脹死亡﹔當細 胞進進行壞死時，會釋放發炎物質 (inflammation factors)，造成發炎 反應。2-4另一種發生在生物體內的細胞死亡方式，稱為細胞凋亡 (apoptosis)，也可稱為程式性死亡 (cell programmed death) ，是一正 常的細胞生理功能。在細胞型態學上 (morphology) 和壞死完全不同 的死亡方式，細胞凋亡的生理特徵包括了細胞膜變化、凋亡蛋白酶家 族 (caspase family) 的 活 化 、 與 去 氧 核 糖 核 酸 的 斷 裂 (DNA fragmentation)。細胞週期 (cell cycle) 是一連串有規律的細胞生理過 程。細胞週期大致可分為兩個時期：間期 (interphase) 及細胞分裂期 (mitotis phase)。間期有可分為三期：G0/G1、S、G2 phase。
一、 G0/G1 ：介於DNA合成(synthesis)前和細胞分裂之後。在此期 細胞維持正常代謝並且繼續生長，進行mRNA轉錄及蛋白質的合 成，但沒有DNA 的合成，所以細胞大小增大，而DNA含量不變。
在G1 晚期有一個限制點(restriction point)，會檢查染色體 (chromosome) DNA 是否受到破壞，以便進行修補(repair)的工 作，此期約需 花十到十二小時。5-7
二、 S 期 ：這階段細胞週期主要是進行DNA複製(replication) 工 作 。 在 這 個 時 期 ， 細 胞 大 小 固 定 ， 染 色 體 由 二 倍 體 增 加 到
長並且合成蛋白質之外，也會負責檢查染色體DNA的複製是否 完整，以準備進入下一個時期。此期約需花 三到四小時。
四、 M 期 ：進入間期細胞會由一個母細胞分裂成兩個子細胞，已 複製完整的染色體會各自分配到子細胞內，使得子細胞內的染色 體與母細胞完全一樣，此時期大約一小時可完成。而哺乳類細胞 在G0/G1 期、S期及G2/M期，各存有一個檢查點 (checkout point)，其中在G1和G2/M期兩個檢查點被研究的比較清楚。在 G1期的檢查點可以適時的偵測到細胞生長的條件是否適合細胞 增殖，來決定細胞進入S 期或停留在G1。而G2期檢查點則可以 感應到DNA合成是否已完成，來決定細胞是否可進入M期。5-7
目前常見的細胞凋亡檢測方法有：電泳分析、Propidium Iodide Staining 和 ELISA-Enzyme-linked immunosorbent assay 等 方 式 。 Propidium Iodide Staining流式細胞儀以最不破壞細胞的方式，來觀察 細胞內的各種生理變化的儀器，原理是以特定的螢光染劑接合細胞內 的酵素、分子或核酸，當細胞流至檢測器時可檢測每顆細胞的螢光強 度得知細胞內的變化。Elisa-based apoptotic assay 則是最快速且最省 藥品的檢測方式，此方法可以檢測早期細胞凋亡的現象，來判斷此藥 品是否使細胞走向necrosis或是apoptosis。
DNA拓樸異構酵酶 (DNA topoisomerase) 是細胞核內重要的蛋 白質，當DNA複製、RNA轉錄和DNA重組的過中所產生的超螺旋結 構的問題，都必須透過DNA拓樸異構酵酶來解決。而近年來以DNA topoisomerase 作用來篩選抗癌藥品，是生醫藥界的發展重點之一。
因為以DNA topoisomerase 為drug target 的作用機轉與以前所知抗癌
其 中 喜 樹 鹼(camptothecin) 便 是 與 第 一 型 拓 樸 異 構 酵 酶 (DNA topoisomerase I)結合成複合體(complex)，使DNA topoisomerase I失去 其活性，一旦喪失或受藥物抑制活性時，細胞則會受到嚴重的影響，
使其無法複製，甚至造成細胞死亡，故被應用於癌症的治療上。8-11 癌 細胞因需不斷進行複製，所以喜樹鹼可以有效的抑制癌細胞的生長，
但一些分裂快速的細胞也對喜樹鹼較敏感，故可能引起一些副作用，
比如說掉髮和口腔潰瘍。在本論文當中，針對具有細胞毒殺作用或細 胞周期調控的化合物，進行拓樸異構酶活性抑制實驗，探討可能之誘 導細胞死亡的原因，並期待能找到更具專一性之DNA topoisomerase I inhibitor。
近年來因飲食、生活習慣、工作壓力及環境等影響，身體的氧化 壓力也逐漸增加，體內的抗氧化機制漸漸衰退，造成許多慢性病也提 前發生，影響日後的生活品質。目前除了治療上的藥物外，對於預防 老化的觀念越來越重視，所以對於一些可以抗氧化及預防心血管疾病 的藥物或食品也逐漸的開發，因此在尋找減緩老化的化合物，也是現 今科學家探討的重要課題之一。
近年來有許多的報告都顯示生物體過多的自由基(superoxide anion (O.2-)、hydroxyl radical (.OH)、peroxyl radicals (ROO.-)、Nitric oxide (NO)、Lipid radical 等)與導致發炎、癌症或退化性疾病有密切
關係。12-15雖然生物體內有一套完整的防禦系統可以降低或消除氧化
性傷害，例如:Glutathione、Ceruloplasmin、GSH-peroxidase 等，但是 過量的氧化物質會產生不可逆的氧化傷害，因此攝取具有抗氧化或活 化抗氧化酵素之物質，則可以延緩老化或減少氧化物質的發生。
而DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)則是一個含奇數電子之穩定型
過去本實驗室曾以體外培養癌細胞方式篩選出桃實百日青具抗 癌活性，並初步研究桃實百日青之枝葉部分抗癌活性成分，16, 17其中 所分離到的成分大多為flavonoids、biflavonoids 或 steroid 類的化合物 居 多 ， 其 中 biflavonoids 中 的 podocarpusflavone A 和
Ⅱ-4″,I-7-dimethoxyamentoflavone 類有對於人類第一型拓樸異構酶 (Topoisomerase I)有抑制作用。由於以前分離出的化合物在羅漢松科 植物中並非主要抗癌之成份，而為徹底了解本植物的化學與活性成 分，因此，本論文進一步繼續探討桃實百日青莖皮部之化學成分及其 生物活性，並希望將分離出的有效物質可以更進一步開發成為新的藥 物。
第二節 研究目的
桃實百日青為台灣特有種，因此以本植物為研究題材，經酒精萃 取，再利用管柱層析、薄層層析法和高效能液相層析等方法，試著從
桃實百日青莖皮部中分離出具有生物活性之成分，並利用 NMR、
MS、IR 等光譜分析或其他物理或化學方式，鑑定結構然後將純化鑑 定之成分進行生物活性的探討，包含進行細胞毒殺(MTT cytotoxicity assay)、抗氧化清除 DPPH 活性測試、第一型拓樸異構酶 (DNA Topoisomerase I)和細胞凋亡(apoptosis)的抗癌機制探討。希望經由這 一系列的研究的有效物質可以進ㄧ步開發成為新藥。
第三節 桃實百日青植物介紹
羅漢松科 (Podocarpaceae)為常綠喬木或灌木。在全世界約有 20 屬，超過 120 種，分布於熱帶、亞熱帶和溫帶地區。主要以南半球為 主，僅少許分布於北半球僅其中多分布在菲律賓、印尼、馬來西亞印 度和中國大陸長江以南各省份。台灣地區本科原生種則有2 屬共 7 種 植物，依照1994 年第二版台灣植物誌第ㄧ卷所述，1分別隸屬於竹柏 屬(Nageia Gaerth.) 和羅漢松屬(Podocarpus L, H. erit ex Pers.)。前者有 長葉竹柏(N. fleuryi)及竹柏(N. nagi) 2 種，而後者包含蘭嶼羅漢松(P.
costalis)、大葉羅漢松 (P. macrophyllus var. macrophyllus)、小葉羅漢 松(P. macrophyllus var. maki )、叢花百日青(P. fasciculus) 和桃實百日 青(P. nakaii)等 5 種。其中叢花百日青和桃實百日青為台灣特有種，所 以在地理分布上有其特殊意義。
桃實百日青 (圖二)，主要分布在台灣中部中低海拔的闊葉林中
18，所以有許多的俗名，例如：土杉仔、百日青仔、山相思仔、百日 青、山相思樹、埔里羅漢松、埔里百日青及台灣羅漢松。桃實百日青 為常綠喬木，樹幹比直，樹高可達 15~20 餘公尺，樹幹直徑可達 60 公分，樹皮為灰紅褐色且有細長條的剝落，枝光滑，新芽略呈淡紅色，
葉為互生、細長、短柄或無柄、葉緣光滑且無毛、中脈明顯無側脈、
葉長披針型或寬線型約5~10 公分，葉寬約 8~12 公厘。桃實為雌雄異 株雄株約1-3 個雄毬花簇生，雌株開花期主要在秋季，種子約在夏季 成熟，先端的突起歪斜如桃子ㄧ般，種實球形，直徑約8 mm，生於 肥大之種托上。種托為倒錐狀圓柱形，長約1.5 cm， 成熟的種實，
種子著生在紅色的肉質種托上且種子表面有白色粉狀物，成熟時呈紅
外也有驅風、活血、解熱和解毒的功用。
另外，為了更了解本植物可能所含的化學成分，茲將本屬-羅漢 松屬 (Podocarpus)植物之文獻研究整理如下表(見表一)所示。羅漢松 科 植 物 現 有 發 現 的 化 合 物 中 ， 包 含 ；Fatty acids 、 Aromatics 、 Monoterpene 、 Sesquiterpenoids 、 Diterpenoids 、 Podolactones 、 Flavonoids、Biflavonoids 、Catechins、Steroids 和 Lignans 等不同骨 架的化合物，其中具有抗氧化、抗蟲和抗癌等功效。
圖一、桃實百日青植物外觀及其果實(黃士元 攝)
表一、羅漢松 (Podocarpus) 屬植物化合物之化學研究
Compound 化合物名稱 Source 基源 A. Fatty acids
Heptacosane (1) P. dacrydioides20 Hentriacontane (2) P. saligna21 Nonacosane (3) P. dacrydioides20 Eicosa-5c,11c,14c-trienoic acid (4) P. nagi22
Triacontane (5) P. saligna21 Ditetradecyl-carbinol (6) P. ferrugineos23 B. Aromatics
Benzene-1,4-diol (7) P. saligna21 Coumaric acid (8) P.macrophylla24 C. Monoterpene
(+)-Limonen (9) P. spicata25 D. Sesquiterpenoids
Atractylon (10) P. spicatus26 Curzerenone (11) P. spicatus26 Longifolene (12) P. spicatus26 γ-Muurolen (13) P. ferrugineus27 Bicyclogermacren (14) P. ferrugineus27 Selin-11-en-4α-ol (15) P. ferrugineus27 Selinadiene (16) P. spicatus26 δ-Cadinene (17) P. spicatus26 Germacren D (18) P. spicatus26 δ-Elemen (19) P. spicatus26 Podoandin (20) P. andina28 α-Copaene (21) P. spicatus26 Sclarene (22) P. spicatus26 E. Diterpenoids
5β-Hydroxy-6-oxasugiyl methyl ether (23) P. ferrugineus29 Pimaradiene (24) P. spicatus26 (+)-Ferruginol (25) P. spicatus26 2-Ketoferruginol (26) P. ferrugineus29
表一、羅漢松 (Podocarpus) 屬植物化合物之化學研究(續) Compound 化合物名稱 Source 基源
6-Dehydroroyleanon (31) P. ferrugineus29 12-Acetoxysugiyl methyl ether (32) P. gracilior30 2β-Acetoxysugiyl methyl ether (33) P. ferrugineus29 5-Dehydrosugiol (34) P. ferrugineos23 19-Oxototarol (35) P. nagi31
8(14)-Sandaracopimaren-2α,15ξ,16,18-tetrol (36) P. halli32 Royleanon (37) P. ferrugineus29 Abietatriene-(8.11.13) (38) P. ferrugineus27 Rimuene (39) P. saligna21 Isopimaradiene (40) P. spicatus26 17-Isophyllocladenol (41) P. lambertius33 Totarol (42) P. totara34 Hydroxytotarol (43) P. totara34 19-Hydroxytotarol (44) P. nagi31 Phylloclad-15-ene (45) P. spicatus26 Isopimarol (46)
Isopimaradiene (47)
P. spicatus26 P. ferrugineus29 19-Hydroxyferruginol (48) P. ferrugineus35 Totaryl acetate (49) P. gracilior30 Methyl podocarpate (50) P. totara34
4β-Carboxy-17-hydroxy-19-nortotarol (51) P. macrophyllus36 Phyllocladen (52) P. spicatus26
Isopimara-8,15-diene (53) P. spicatus26 Pimara-8(14),15-diene (54) P. spicatus26 3β-Hydroxytotarol (55) P. nagi31 Podocarpic acid (56) P. lambertius33 Lambertic acid (57) P. lambertius33 Pododacric acid (58) P. lambertius33 8,9-Abieten-15-ol (59) P. lambertius33 Sempervirol (60) P. gracilior30 8-Hydroxy-isopimarene (61) P. spicatus26
表一、羅漢松 (Podocarpus) 屬植物化合物之化學研究(續) Compound 化合物名稱 Source 基源
Totaral (66) P. nagi38 16-Hydroxy-totarol (67) P. nagi38
Abieta-6,8,11,13-tetraen-12-ol (68) P. dacrydioides20 Cupressene (69) P. dacrydioides20 Kaurane (70) P. macrophyllus36 Phyllocladene (71) P. ferruginea37 Isokaurene (72) P. spicatus26 Rosadiene (73) P. spicatus26 Sandaracopimaradienes (74) P. spicatus26 Carnosol (75) P. ferrugineus35 19-Acetate (76) P. ferrugineus35 Totaradiol (77) P. nagi38
4β-Carboxy-19-nortotarol (78) P. macrophyllus36 Macrophyllinoic acid (79) P. ferrugineus35 F. Podolactones
Inumakilactone (80) P. macrophyllus39 Hallacton A (81) P. hallii40
Nagilactone B (82) P. macrophyllus41 1-Deoxy-2,3-dehydronagilactone (83) P. nagi42
Nagilalacton A (84) P. nagi43 Podolacto E (85) P. neriifolius44 Nagilactone A (86) P. macrophyllus41 LactoneA (87) P. saligna45 15-Methoxycarbonyl-Nagilactone D (88) P. nagi46 Nubilacton A (89) P. nubigena47 Nagilalacton E (90) P. nagi43 Nagilactone F (91) P. nagi43 Nagilactone B (92) P. nagi46 Nagilactone D (93) P. nagi46
1-Deoxy-3β-hydroxy-nagilactone B (94) P. macrophyllus41 17-Hydroxy-3-deoxy-2,3-didehydro-nagilactone E (95) P. nagi46
表一、羅漢松 (Podocarpus) 屬植物化合物之化學研究(續) Compound 化合物名稱 Source 基源
Podolacton A (99) P. neriifolius48 Podolacton B (100) P. neriifolius48 2β,3β-Epoxy-podolid (101) P. neriifolius48 Inumakilactone B (102) P. neriifolius44 2,3-Dehydro-16-hydroxynagilactone F (103) P. nagi49 16-Hydroxynagilactone E (104) P. nagi49 Nagilactone I (105) P. nagi49 Nagilactone A (106) P. nagi49 Nagilactone C (107) P. nagi49 3-Deoxy-2α-hydroxynagilactone E (108) P. nagi49 2α-Hydroxynagilactone F (109) P. nagi49 3-Epinagilactone C (110) P. nagi49 Nagilactone J (111) P. nagi50 Salignone H (112) P. saligna51 Salignone A (113) P. saligna51 α,β-Unsaturatedδ-laction (114) P. urbanii52 Urbalactone (115) P. urbanii52 Inumakilactone A (116) P. neriifolius44 1-Deoxynagilactone A (117) P. nagi42 2,3-Dehydronagilactone (118) P. nagi42 Salignone M (119) P. saligna53 Nagilactone (120) P. nagi42 Salignone I (121) P. saligna53 Salignone K (122) P. saligna53 Salignone L (123) P. saligna53 Salignone J (124) P. saligna53 Salignone A (125) P. saligna53 Inumakilactone D (126) P. saligna53 Rakanmakilactone I (127) P. macrophyllus36 Rakanmakilactone H (128) P. macrophyllus36 Rakanmakilactone G (129) P. macrophyllus36
表一、羅漢松 (Podocarpus) 屬植物化合物之化學研究(續) Compound 化合物名稱 Source 基源
Podolacton C (133) P. macrophyllus54 Hallacton B (134) P. hallii40
Podolacton D (135) P. macrophyllus54 Rakanmakilactone A (136) P. macrophyllus54 Rakanmakilactone C (137) P. macrophyllus54 Rakanmakilactone D (138) P. macrophyllus54 Rakanmakilactone B (139) P. macrophyllus54 Rakanmakilactone F (140) P. macrophyllus54 Hallactone B (141) P. macrophyllus54 Podolactone C (142) P. macrophyllus54 Rakanmakilactone E (143) P. macrophyllus54 G. Biflavonoids
Hinokiflavone (144) P. elongata55 Amentoflavone (145) P. macrophylla24 Isoginkgetin (146) P. gracilior24 4',4''',7,7''-Tetra-methylamentoflavone(147) P. urbanii52 Amentoflavone hexa-acetate (148) P. urbanii52 Hexa-O-methylcupressuflavone (149) P. elongatus56 Ketoflavone (150) P. elongatus57 Heveaflavone (151) P. taxifolia58 Sotetsuflavone (152) P. elongatus57 Podocarpus-flavon A (153) P. urbanii52 II 4׳-Methylamentoflavone (154) P. taxifolia58 I 7, II 4׳-Dimethylamentoflavone (155) P. taxifolia58 Podocarpus flavone A (156) P. urbanii52 Podocarpusflavanone (157) P. taxifolia58 H. Flavonoids
Katuranin (158 ) P. spicatus59 Dihydroquercetin (159) P. spicatus60 Apigenin (160) P. macrophylla24 Kaempferol (161) P. spicatus59
表一、羅漢松 (Podocarpus) 屬植物化合物之化學研究(續) Compound 化合物名稱 Source 基源
Biochanin A (165) P. andina28 Irisolidone (166) P. andina28 Podospicatin (167) P. spicatus60 Taxifolin 7-O-β-glucoside (168) P. nivalis61 Luteolin 3'-O-β-xyloside (169) P. nivalis61 Co-occurring glycoside (170) P. nivalis61 5-O-β-D-Glucopyranoside (171) P. nivalis61 Luteolin 7-O-βglucoside-3'-O-β-xyloside(172) P. nivalis61 Orientin 2"-O-βglucopyranoside (173) P. nivalis61 Vitexin-2"-O-glucoside (174) P. nivalis61 I. Catechins
(-)-Epicatechin (175) P. nagi62 Cyanidin-3-rutinosid (176) P. lawrencii63 Peonidin-3,5-diglucosid (177) P. brevifolius64 Cyanidin-3-glucosid (178) P. lawrencii63 Peonidin-3-glucosid (179) P. brevifolius64 Myrtillin (180) P. totara65 Pelargonidin-3-glucosid-chlorid (181) P. brevifolius64 Delphinidin-3-glucoside-chloride (182) P. brevifolius64 Pelargonidin-3,5-diglucosid-chlorid (183) P. brevifolius64 Delphinidin-3,5-diglucoside-chloride (184) P. brevifolius64 Cyanidin-3-rutinoside (185) P. totara65 Delphinidin-3-neohesperidoside (186) P. totara65 Cyanidin 3-neohesperidoside (187) P. totara65 J. Steroids
β-Sitosterin (188) P. ferrugineos23
Stigmasterol (189) P. pivalis66 Clionasterol (190) P. totara34
20-Hydroxy-ecdysone (191) P. macrophyllus67 Ponasteron B (192) P. urbanii68 Ponasteron C (193) P. urbanii68
表一、羅漢松 (Podocarpus) 屬植物化合物之化學研究(續) Compound 化合物名稱 Source 基源
Makisteron A (197) P. macrophyllus67 3β,5α-Dihydroxy-6-stigmastanone (198) P. lambertius33 24(ξ)-Methyl-25(ξ)-cholest-5-ene-3b,26-diol (199) P. macrophylla24 24(ξ)-Ethyl-25(ξ)-cholest-5-ene-3b,26-diol (200) P. macrophylla24 Sitosterol-D-glucoside (201) P. latifolius70 K. Lignans
Matairesinol (202) P. spicatus71 Thujaplicatin methyl ether (203) P. spicatus71 L. Other
Hallol (204) P. halli32 Sequoyitol (205) P. sellowii72 Blumenol C (206) P. blume73 Blumenol B (207) P. blume73 Lauren-1-ene (208) P. halli32 Waihoensene (209) P. totara74
A. Fatty acids
1 2
4
OH
6 5
HO
3 O
B. Aromatics
HO OH
7
HO O
8 OH
C. Monoterpene
9
D. Sesquiterpenoids
O
H
10
O
H O
11
H H
12
H
H
13 14
HO H
15
H
16 17 18
19 20 21
O
O
H
H
H H
H
22
E. Diterpenoids
O OH
OMe
O
23 24 25
26 27 28
29 30 31
OH
OH
O
OH
O O
OH
O O
OMe
O HO
OH O
O OMe
O
O O
32 33 34
35 36 37
38 39 40
41 42 43
OMe OH
O O
O
O
OH
OH OH
O
O OH
OH
OH OH
O
OH
OH H
OH
OH
44 45 46
47 48 49
50 51
53 54 55
OH
OH
OH
OH
OH
HOOC OH
O
OH
52
HO
OH
56 57 58
59 60 61
62 63 64
65 66 67
OH
OH O
OH OH
OH OH
OH
OH
OH
OH
OH OH
O
OH O
OH H
O
68 69 70
71 72 73
74 75 76
77 78 79
OH
OHO
OH
O
OH
O
O
HO
OH
OH
OH
O OH
O
O OH
F. Podolactones
O
O O O
O
O
O
O O O
O
HO OH
80 81 82
83 84 85
86 87 88
89 90 91
O
O O
O
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OH HO
O
O O
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HO O O
O
O O
O
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O O HO
92 93 94
95 96 97
98 99 100
101 102 103
O
O O
O
HO O O
O O
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O
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O
O HO
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O
O O
O
OH
104 105 106
107 108 109
110 111 112
113 114 115
O
O O
O
O
O
O O
O
COOH
OH O
O O
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OH
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O O OH
O
O
O O
O
O
O
O O
HO
HO OH
O
116 117
118
119 120 121
122 123 124
125 126 127
O
O O
O
O
O
O O
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O
HO OH
O
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O O
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O
OH
O OH
O
O O
O
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O
O O
O
O O
OH OH
O O
O O
128 129 130
131 132 133
134 135 136
137 138 139
O
O O
O
O OH O
HO
O
O O
O
HO HO
Cl
OH
O
O O
O
O O
OH OH
O
O O
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HO HO
Cl
O
O
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OH HO
O
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O S O
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O
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O
S O
O
O HO
HO
O
O O
O
O S O
OH O
O O
O
O S
O O
140 141 142
143
O
O O
O
O S
O O
O
O O
O
O S O
Cl
HO
O
HO HO HO
HO
G. Biflavonoids
144 145 146
147 148 149
O HO
O OH
OHO OH
O
HO OH
O HO
O
O
OH
O OH
HO OH
O
O HO
O OH
O O OMe
O
HO OH
O HO
O OH
OMeO OMe
O
MeO OH
O MeO
O OH
OMeO OMe
O
MeO OH
O MeO
O OMe
OHO OMe
O
MeO OMe
