嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告
計畫編號：CNBT9501
計畫名稱：CD93 在單核球分化之功能研究
執行期間：95 年 1 月 1 日至 95 年 12 月 31 日
□整合型計畫 ■個別型計畫
計畫總主持人： 計畫主持人：陳品晟
子計畫主持人：
中華民國96 年 2 月 26 日
摘要
人類 CD93 蛋白是一種位於細胞表面的穿膜醣蛋白。其被發現表現在單核 球、嗜中性球、血小板、小神經膠質細胞、內皮細胞、早期幹細胞等多種細胞。
CD93 蛋白具有 652 個胺基酸，其中包含了碳水化合物辨認區域、五個 EGF 相似 區域、一個黏蛋白相似區以及一個短的細胞內尾端。CD93 蛋白最初被命名為 C1qRp，認為和補體分子 C1q 促進的吞噬作用有關。然而最近的一些報導卻認為 CD93 蛋白並不參與在 C1q 促進的吞噬作用中。因此 CD93 蛋白的功能目前仍然 是未知而且是有爭議的。在本計畫中，我們擬選殖並構築 CD93 基因的表現載 體，並將CD93 及其不同長度的片段 DNA 轉殖入單核球 THP-1 細胞表現，研究 CD93 及其片段蛋白質對於 THP-1 細胞分化為巨噬細胞的影響，以及分析這些蛋 白質對巨噬細胞之吞噬作用的影響。結果發現，當THP-1 細胞接受 PMA 刺激而 分化為巨噬細胞時，CD93 蛋白的表現會下降。當 THP-1 細胞過量表現 CD93 蛋 白時，細胞的吞噬作用會被抑制，並且 THP-1 細胞吸附到內皮細胞的能力也會 被抑制。這些結果顯示，CD93 蛋白可能調節了單核球的某些功能。
背景
人類 CD93 蛋白是一種位於細胞表面的穿膜醣蛋白。其被發現會表現在單 核球(monocytes)、嗜中性球(neurophils)、血小板(platelets)、小神經膠質細胞 (microglia)、內皮細胞(endothelial cells)及造血幹細胞(haematopoietic cells)等多種 細胞1。CD93 基因位於人類第 20 號染色體，為可表現出具有 652 個胺基酸的蛋 白質。其蛋白質結構，由N 端開始依序為含 C-type 碳水化合物辨識區域(C-type carbohydrate recognition domain, CRD)，五個上皮細胞生長因子(epidermal growth factor, EGF)相似區域，一個黏蛋白(mucin)相似區，穿膜 (transmembrane) 區域，
以及最末端一個僅含有 47 個胺基酸的細胞內尾端(intracellular tail)。CD93 預測 的分子量為66 kD，但以西方點墨法分析後為 126 kD，推測此蛋白可能具有高度 的醣化作用2,3。
CD93 最初被命名為 complement component 1q receptor (C1qRp)，意即 C1q 的受體。C1qRp 蛋白在 1989 年被發現並分離出 4，並在後續的研究中，發現此 蛋 白 質 的 單 株 抗 體 可 以 抑 制 由 C1q 所 促 進 的 單 核 球 吞 噬 作 用 (monocytic phagocytosis)，表示 C1q 可能藉由與此蛋白質結合而調控吞噬作用 5。此外，附 著到 C1qRp 抗體的細胞亦會促進吞噬作用 6。一直到 1997 年，由 Nepomuceno 等人選殖出CD93 的 cDNA，經由序列比對才確定 C1qRp 即為 CD932。
雖然 CD93 被認為可能在調控單核球的吞噬作用扮演角色，但最近卻有不 同的看法。在CD93 與 C1q 結合的研究中，Tenner 等人發現以 CD93 抗體(U40.3、
R139 及 R3)處理過後的人類單核球，並不能抑制 C1q 結合到細胞上，僅有 R3 抗體約有30%的抑制效果。由於 R3 抗體是 IgM 的型態，推測是因為巨大的空間 排列而阻礙蛋白質接觸到 C1q 的結合位置，而非專一性地阻斷 CD93 與 C1q 的 結合7。因此推測CD93 可能不是 C1q 直接結合的受體 ( Tenner et al., 1999)。此 外，Gasque 等人利用 CD93-Fc 融合蛋白為材料，發現亦無法與 C1q 做結合 8。
而在2004 年，CD93 基因剔除老鼠被製造出來，發現其不像 C1q 基因剔除老鼠，
會發生紅斑性狼瘡等疾病，間接証明CD93 與 C1q 可能沒有直接的相互作用。相 對的，CD93 剔除老鼠可以健全的存活與生長，唯一受到影響的是吞噬細胞清除 凋亡細胞的作用。由此推論CD93 可能參與辨識凋亡細胞的過程，進而傳遞清除 凋亡細胞的訊息9。
為了進一步研究 CD93 與細胞吞噬作用的相關性，Tenner 團隊使用基因工 程方法將CD93 之細胞內片段與 GST (glutathione S-transferase)接在一起，並表現 出融合蛋白。再利用GST (glutathione S-transferase) pull down 的方法，尋找可能 會與CD93 細胞內片段蛋白進行交互作用的蛋白質。結果發現 CD93 會與 moesin 發生交互作用。以螢光免疫色法觀察人類單核球，也觀察到Moesin 與 CD93 分 佈在相同的位置，確定這兩種蛋白質在細胞內亦會結合在一起。Moesin 為 zrin/radixin/moesin(ERM)家族的一員，ERM 蛋白可作為一些細胞膜蛋白與細胞骨 架蛋白，如actin，的架橋蛋白。更深入的研究發現，CD93 細胞內片段蛋白的細 胞膜旁(juxtamembrane)區域之正電荷胺基酸，以及 C 端末尾的 11 個胺基酸，對 於moesin 的結合是相當重要的。Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)亦會 藉由影響CD93 與 Moesin 的交互作用。這些結果顯示 CD93 可能藉由與 moesin 結合，影響細胞骨架蛋白，進而調控細胞功能10。
最近的研究也發現，表現在單核球及嗜中性球細胞表面的CD93，會因為一 些刺激，包括發炎反應，而被切除。這些被切除並被釋放到細胞外的CD93 片段，
包括有CRD，以及 EGF 相似區域等片段。而這些片段也可在血液中被發現，顯 示CD 93 的切割在正常生理條件下是存在的11。而這些游離的CD93 片段蛋白，
是否具有其他生理功能，則是完全未知。
CD93 在許多不同種類的細胞也都有表現，顯示 CD93 在不同的生理狀況 下，可能具有不同的生物功能。例如人類CD93 在老鼠的同源基因 AA4，會大量 表現在老鼠的血管內皮細胞，被推測與調控細胞生長，參與血管的重新塑型、血 管新生以及微血管生成有關12。
研究方法
本計畫將以單核球為材料，研究CD93 在發炎反應時所扮演的角色。研 究方法分列如下：
1. 從人類單核球前期細胞株 U937 中抽取 RNA，以 RT-PCR 方法選殖人類 CD93 基因。再以 PCR 方法取得全長、刪除 CRD (CRD-deleted，∆L) 與 刪除細胞內區域(cytoplasmic-deleted，∆C)的 CD93 基因。DNA 兩端分別 以 EcoR I 和 BamH I 限制酶切割後轉接至螢光蛋白(GFP)表現載體 pEGFP-N1。CD93 與 pEGFPN1 載體接合後轉移到大腸桿菌 DH5-α 勝任 細胞，再以 kanamycin 初步篩選菌落。將選出的菌落進行小量培養後抽 取 DNA，並以 EcoR I 和 BamH I 限制酶切割加以確認。再利用 CD93-pEGFPN1 質 體 作 為 模 版 ， 以 PCR 夾 出 CRD 區 域 缺 失 的 CD93DNA ， 並 在 5’ 端 接 上 CD93 基 因 前 端 的 訊 息 片 段 (signal peptide)DNA，選殖出的表現載體稱為 CD93-∆L -pEGFPN1。CD93-∆C 的 基因片段同樣是以CD93-pEGFPN1 為模版，以 PCR 方法得到 C-tail 缺失 的CD93，再以 EcoR I 和 BamH I 限制酶切割後，接合並且進行轉移，篩 選菌落以及確認序列，將此基因表現載體命名為 CD93-∆C -pEGFPN1。
實驗步驟如下：
A. U937 cell RNA 的萃取
1.將 U937 細胞用 trypsin-EDTA 打下後，加入適量的 TRIzolR ○ Reagent 2.加入 300µl 的 chloroform ( 每 1ml TRizol 需加入 300µl 的 chloroform ) 。 3.用手劇烈搖晃約 30 秒然後靜置於室溫下 3 分鐘。
4.在 4℃下離心 12,000 x g ( ~10,000 rpm ) ， 15 分鐘。
5.小心吸出上清液。
6.加入等量的 isopropyl alcoholic。
7.小心的將離心管正反翻轉 10 次。
8.在室溫下靜置 10 分鐘。
9.在 4℃下離心 12,000 x g ( ~10,000 rpm ) ，10 分鐘。
10.將上清液吸出, 保留在管底的 RNA pellet。
11.加入 600µl 的 75% RNase-free enthanol ，vortex 5~10 次。
12.在 4℃下離心 10,000 x g ( ~8500 rpm ) ，5 分鐘。
13.將上清液吸出，並將離心管倒放，靜置室溫下 15 分鐘
14.視 RNA pellet 的大小加入 50 or 100 or 200µl 的 DEPC 水並靜置在 60℃下 10 分鐘
B. 反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
1.將 1µg 的 RNA 置於 65℃下 5 分鐘，然後迅速置於冰上至少 5 分鐘。
2.配置 mixed buffer。
Oligo (d T) 15 primer……….1µl 10mM dNTP………...2µl RNase-free water……….9.5µl RNasin……….0.5µl MMLV reverse transcriptase………...1µl 5X MMLV RT buffer………..4µl
3.將 mixed buffer 加入含有 1µg 的 RNA 的 PCR 專用離心管。
4.置於 37℃下反應 5 分鐘。
5.置於 42℃下反應 60 分鐘。
6.置於 70℃下反應 10 分鐘。
7.置於 4℃下至少 5 分鐘。
8.循環 35 次
C. 人類 CD93、∆L CD93、∆C CD93 -PCR 1.配置 mixed reaction buffer
Sense primer………1µl Antisense primer………. 1µl dNTP………1µl Taq polymerase……….0.5µl 10X PCR buffer………...5µl H20………..36.5µl 加入5µl RT-PCR 產物(總體積 50µl) 2.放入基因放大儀反應
[註]：Primer sequence
Primer Sequence C1qRp 3’
(stop deletion) 5’-CGC GGA TCC CAG TCT GTC CCA GGT GT-3’
C1qRp 1129
antisense 5’-GGG GTA CCC TTG GGG GCA GC-3’
C1qRp 1129
sense 5’-GGG GTA CCA GCT GGA CTC GA-3’
C1qRp 5’ 5’-GGA ATT CCG ATG GCC ACC TCC ATG GGC CTG-3’
C1qRp Signal 5’ 5’-CCC AAG CTT ATG GCC ACC TCC ATG GGC-3’
C1qRp Signal 3’ 5’-GGA ATT CCC CCG CCC CGG GCT GGG TCA G-3’
C1qRp TM 3’ 5’-CGG GAT CCC CCA GAC CCA GGG CCA GCA G-3’
C1qRp 2Ds 5’-TTG GAA TTC CCC AAG TAT GGC TGC AAC TTC-3’
D. 構築質體的方法
D1.限制酶切割質體 DNA
將預備切割的載體 (pEGFP-N1) 依照實驗的不同，換算出所需的體積，
根據所需作用的限制酶，選擇最適當的限制酶反應緩衝液，在特定的溫 度下反應，而反應時間依照 DNA 的數量而有所差異，平均約 1 到 3 小 時。
D2.載體 DNA 的瓊脂膠電泳(agarose gel electrophoresis)
1. 製作瓊脂膠電泳膠片，以 TAE 為膠片的緩衝液，0.8 %之電泳膠片。
瓊脂膠(Agarose) 0.8 g
0.5X TAE buffer 100 ml
以微波爐加熱溶解，待冷卻至40-50 ℃，加入溴化亞乙 烯溶液，混合均勻，倒入模型中待凝固備用。
溴化亞乙烯溶液(EtBr, 10 mg/ml) 5 µl
2. 將限制酶作用完成的載體 DNA，加入總體積十分之一的 10X loading dye，混合均勻，取適當體積的混合物於前一步驟準備好的瓊脂膠電泳 膠片中，在同一膠片的另一個樣品槽中注入DNA marker，以作為 DNA 樣品分子量大小的依據，用 100V 的電壓在水平式電泳槽中進行電泳 分析，以紫外燈觀察結果，照相作為紀錄。
D3.載體 DNA 片段回收
1. 將經過適當限制酶切割的載體 DNA，在 0.8 %瓊脂膠電泳膠片中進行 電泳分析。
2. 在紫外燈下觀察結果，以刀片切下正確分子量位置含 DNA 片段的瓊脂 膠，置於乾淨的1.5ml 小離心管內。
3. 使用 Gene-spinTM 1-4-3 DNA Extraction Kit 來進行 DNA 片段的回收。
4. 加入與切下的瓊脂膠相同體積的 binding buffer，於 60 ℃靜置 5 ~ 15 分 鐘，直到管內的膠體完全溶解。
5. 將已完全溶解的膠體混合液加入 spin column 中。
6. 離心 12000 rpm 1 分鐘，去除下層廢液。
7. 再加入 500 µl binding buffer，離心 12000 rpm 1 分鐘，去除下層廢液。
8. 加入 700 µl washing buffer，離心 12000 rpm 1 分鐘，去除下層廢液。
9. 離心 12000 rpm 3 分鐘，以移除殘餘的液體。
10. 將 spin-down 管柱置於乾淨的 1.5 ml 小離心管中，加入 50 µl elution solution，離心 12000 rpm 3 分鐘，即可得到回收的 DNA 片段。
D4.接合反應( ligation )
1. 將所得到的載體與插入的 DNA 利用接合酶 (ligase)進行接合。
2. 載體 DNA 與插入 DNA 的莫耳比調整為 1 : 3 ~ 1 : 5。
3. 再加入 1 µl 的 T4 DNA ligase 與所需的 ligation buffer。
4. 於 16 ℃水浴槽反應 16 小時。
D5.勝任細胞(DH5α strain competent cell)的製備
1. 將 DH5α strain 的 E.coli 接種於 LB 培養基上，使用三區畫法以達到有 單一菌落的存在，37 ℃培養 16 小時。
2. 從培養基上挑取單一菌落，接種於 10 ml SOB 培養液中，37 ℃水浴槽，
以200 rpm 震盪培養 8 小時。
3. 取 4 ml 的已培養好 SOB 菌液，到另一含有 250 ml SOB 培養液的錐形 瓶中，於18 ℃以 200 rpm 震盪培養 16 ~ 24 小時。
4. 量測菌液在 OD600的吸光值，代表菌液的濃度，當吸光值達到0.55 ~ 0.6 時，將含菌液的錐形瓶置於冰上10 分鐘。
5. 再於 4 ℃以 3500 rpm 離心 10 分鐘，收集細菌。
6. 加入 80 ml 的 TB 重新懸浮菌體。
7. 於 4 ℃以 3500 rpm 離心 10 分鐘，收集細菌。
8. 再加入 20 ml 含有 7% DMSO 的 TB 重新懸浮菌體。
9. 快速將菌液分裝到 1.5 ml 的離心管中，分裝有菌液的離心管立即置入液 態氮中急速冷凍，最後移到-80 ℃保存。
D6.載體 DNA 或接合反應後 DNA 的形質轉移 (transformation)
1. 將載體 DNA 或接合反應後 DNA 加入 200 µl 的勝任細胞中，靜置於冰 上30 分鐘。
2. 移至 42 ℃水浴槽中反應 90 秒鐘，再置冰上 2 分鐘。
3. 加入 800 µl 的 SOC 培養液，於 37 ℃水浴槽，以 200 rpm 震盪培養 1 小時。
4. 以 3000 rpm 離心 2 分鐘，移除 800 µl 的上清液。
5. 以剩下的液體重新懸浮菌體，均勻塗抹於LB 培養基上，於 37 ℃培 養12 ~ 16 小時。
2. 我們利用人類單核球細胞 THP-1 來研究 CD93 的功能，觀察活化的 THP-1 細 胞是否會影響人類 CD93 的表現。將 THP-1 以刺激發炎反應的物質，PMA (phorbol myristate acetate)、TNF-α或 LPS 處理 24 與 48 小時後，THP-1 細胞 會由懸浮型態的細胞，發生型態變化並貼附於培養皿底部，分化為具有高度 吞噬能力的巨噬細胞。收集細胞，以 1% paraformaldehyde 固定後， 再以 anti-CD93 抗體(VIMD2b)偵測細胞表面的 CD93 蛋白，經螢光二級抗體作用 後，以流式細胞分析儀(flow cytometer)分析細胞表面的 CD93 蛋白變化。實 驗步驟如下：
A. THP-1 細胞的轉染
1.準備 0.5 µg 的 CD93-pEGFPN1 質體、 L CD93 -pEGFPN1 質體、 C CD93-pEGFPN1 質體與室溫的 NucleofectorTM Solution。
2.將 THP-1 用室溫的 NucleofectorTM Solution 配製為 1.5x106 / 100µl。
3.將上述的混合液加入套組所附的透明小容器中。
4.選擇 U-01 程式進行電擊。
5.迅速將混合液充分吸出，放入 37 ℃的 RPMI-1640 培養液中，培養超過六 小時後，等細胞開始表現外送蛋白時，進行其他實驗。
B. THP-1 細胞的分化
1.將 THP-1 細胞以 RPMI-1640 配製為 1x106顆/ml 的濃度
2.在 6-well 培養皿中加入上述濃度細胞 2ml，以最終濃度為 10 nM PMA (Sigma)處理。
3.在 37 ℃培養箱中培養至少 16 小時，可以觀察到分化後 THP-1 細胞由原 本懸浮圓形細胞，轉變為緊貼在培養皿底部的細胞。依照分化的程度不 同，有部分細胞會有拉長類似偽足的細胞構造產生，隨著細胞分化的時 間越久，形變的比率也會升高。
實驗結果
經由本計畫的執行，我們選殖出CD93 的 cDNA，並得到 CD93 全長、
CD93-∆L-及 CD93-∆C-pEGFP 等表現載體。將 CD93 轉殖入單核球 THP-1 細 胞表現後，我們分析CD93 的表現對 THP-1 細胞被 PMA 刺激而分化成巨噬 細胞之影響，也探討CD93 對巨噬細胞之吞噬作用的影響。
一、 構築人類 CD93 全長 (CD93-pEGFPN1) 、人類 CD93 刪除 lectin-like 區 域 (CD93∆L -pEGFPN1) 、 人 類 CD93 刪 除 細 胞 內 尾 端 (CD93∆C -pEGFPN1) 的基因
由於人類CD93 基因中內含一個插入序列，因此我們先分離出人類淋巴 瘤細胞株 U937 的 mRNA，反轉錄為 cDNA 後，再進行基因的選殖。人類 CD93 全長 1956bp，從 1129bp 位置分兩段 PCR (表一)，再將產物接起來，
成為全長的CD93。兩端分別以 EcoR I 和 BamH I 限制酶切割後接入哺乳動 物表現載體 pEGFPN1，pEGFPN1 是一個有綠色螢光蛋白 GFP 基因的載体 (附錄一)。人類 CD93 基因與 pEGFPN1 載體接合後轉移到 DH5-α勝任細胞 中，再以 kanamycin 初步篩選菌落。將選出的菌落進行小量培養後抽取 DNA，並以 EcoR I 和 BamH I 限制酶切割加以檢視，其切下的片段大小為 1956bp (圖一)，在限制酶確認無誤後的質體，將其命名為 CD93-pEGFPN1，
接著進行正向與反向的 DNA 定序(附錄二)，確認定序結果無誤。再利用 CD93-pEGFPN1 質體作為模版，以引子 C1qRp 2Ds 和 C1qRp 3’ stop deletion 夾出 CRD 區域缺失的 CD93的後半部，再以 U937 的 cDNA 和 Signal 3’與 Signal 5’引子，夾出前端的訊息片段(signal peptide)，兩個產物都以 EcoR I 限制酶切割後，互相接合並進行轉移，篩選菌落以及確認都與全長的過程相 同，其片段大小為1451bp，其命名為 CD93∆L-pEGFPN1。CD93∆C 的基因
片段同樣是以CD93-pEGFPN1 作為模版，以引子 C1qRp 5’和 C1qRp TM3’s 做聚合酶連鎖反應得到C-tail 缺失的 CD93，再以 EcoR I 和 BamH I 限制酶 切割後，接合並且進行轉移，篩選菌落以及確認都與全長的過程相同，其片 段大小為1802bp，其命名為 CD93∆C -pEGFPN1。
二、 PMA 刺激 THP-1 分化會降低人類 CD93 蛋白的表現
我們利用人類單核球細胞 THP-1 來研究 CD93 的功能。首先，我們觀 察由PMA 活化的細胞是否會影響人類 CD93 的表現。將 THP-1 在 10 nM 的 PMA (phorbol myristate acetate)處理，經 24 與 48 小時後，再以 anti-CD93 抗 體(VIMD2b)偵測 CD93 蛋白表現，並利用流式細胞分析儀分析細胞表面的 CD93 蛋白變化。由圖二所示，隨著 THP-1 被 PMA 刺激活化的時間增加，
細胞表面的CD93 蛋白表現量會逐漸減低。在刺激後的第一天降低約百分之 五十，第二天更降低到約百分之二十五的表現量。由此可知PMA 的刺激分 化THP-1 會降低人類 CD93 蛋白的表現。
三、 PMA 刺激 THP-1 分化會刺激對乳膠顆粒的吞噬作用
我們又更進一步觀察PMA 刺激 THP-1 分化為巨噬細胞後，其吞噬作用 是否有影響。將10 nM PMA 刺激活化 THP-1，經 24 與 48 小時後，收集細 胞並與相同濃度的乳膠螢光顆粒互相混合反應兩小時後，經過仔細的清洗，
藉由流式細胞分析儀偵測細胞的螢光量，代表其吞入的乳膠顆粒數量，以及 吞噬能力的強弱。由圖三所示，我們可以發現PMA 刺激的時間越長，THP-1 細胞吞噬乳膠顆粒的能力就越強，刺激一天後的吞噬能力相較於未活化但是 有加入乳膠顆粒作為陰性對照的組別來得高兩倍，而刺激過兩天的細胞吞噬 能力更是高於對照組九倍。配合先前觀察到PMA 的刺激分化 THP-1 會降低 人類CD93 蛋白的表現，顯示 PMA 刺激活化 THP-1 且降低人類 CD93 蛋白 的表現可能與吞噬能力有關。
四、 比較 THP-1 細胞轉染 CD93-pEGFPN1 、CD93∆L -pEGFPN1、CD93∆C -pEGFPN1 後吞噬乳膠顆粒能力的差異
為了進一步研究人類 CD93 蛋白的表現減少與巨噬細胞吞噬能力的相 關性，我們將不同人類 CD93 片段的質體轉染至 THP-1 作為實驗組，而轉 染入pEGFPN1 載體作為對照組，在細胞轉染並培養六小時後確保轉染入的 質體已經開始表現蛋白後，以10 nM PMA 刺激活化 THP-1，在 16 到 24 小 時間收取細胞，進行乳膠顆粒的吞噬實驗，最後以流式細胞分析儀偵測紅色 螢光。首先比較未轉染任何質體，但有 PMA 處理的細胞比未經由 PMA 刺 激的細胞有更多的紅色螢光，確定PMA 的刺激成功。再圈選有綠色螢光表 現細胞( pEGFPN1 為綠色螢光，表示有轉染入標的質體)，分析其紅色螢光 百分比(乳膠顆粒為紅色螢光，代表細胞吞噬乳膠顆粒的程度)。所得結果如 圖四所示，發現轉染入 CD93-pEGFPN1 的實驗組吞噬乳膠的百分比較空載 體對照組低百分之四十，而轉染入 CD93∆L-pEGFPN1、CD93∆C -pEGFPN1 的實驗組則與對照組沒有明顯的差異，顯示全長的人類CD 蛋白表現會影響 PMA 刺激分化 THP-1 的乳膠吞噬能力，造成吞噬能力的降低。當去除掉 lectin-like 區域以及細胞內尾端時，都會影響對吞噬能力的調控，而使吞噬 能力回復到和pEGFPN1 載體的對照組一樣。
五、 分析轉染CD93-pEGFPN1 、CD93∆L -pEGFPN1、CD93∆C -pEGFPN1 的 THP-1 細胞經 PMA 刺激分化後附著能力的差異
在觀察轉染全長的人類 CD93 蛋白會抑制細胞吞噬乳膠顆粒的同時，
我們也發現到轉染不同片段的人類CD93 基因後的 THP-1，經 PMA 刺激分 化後，其附著到培養皿的細胞數量有明顯的差異。我們由圖五可見，細胞 轉染CD93-pEGFPN1 的實驗組經刺激分化黏著的細胞數量明顯少於轉染入 pEGFPN1 載 體 的 對 照 組 。 黏 著 細 胞 數 降 低 百 分 之 六 十 ； 而 轉 染 入
CD93∆L-pEGFPN1 的實驗組則與對照組沒有明顯的差異。比較特殊的是轉 染入CD93∆C-pEGFPN1 的實驗組相對於對照組，細胞黏著的數量增加百分 之六十。
六、 觀察 THP-1 細胞轉染 CD93-pEGFPN1 、CD93∆L-pEGFPN1、CD93∆C- pEGFPN1 後對 TNF-α 活化的人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)黏著能力的 差異
最後，我們利用活化的血管內皮細胞來誘發 THP-1 成為巨噬細胞，以 此來研究 CD93 的功能。我們先將轉染後的 THP-1 細胞標定活細胞染劑 Calcein AM，再事先用 25 ng/ml TNF-α 活化的 HUVEC 培養一個小時，最後 用螢光儀偵測螢光，由螢光的高低表示細胞黏著的數量，藉此代表黏著能力 的差異。結果由圖六所示，細胞轉染 CD93-pEGFPN1 的實驗組黏著的細胞 數量明顯少於轉染入空載體的對照組，黏著細胞數降低百分之三十三，而轉 染入CD93∆C-pEGFPN1 的實驗組則與對照組沒有明顯的差異，再次證明人 類 CD93 蛋白是確實對於單核球細胞黏著到內皮細胞的能力有其抑制的作 用。
討論
CD93 自 1986 年被發表以來，其功能仍不太清楚。在本研究中，我們發現 在單核球被 PMA 刺激為巨噬細胞的過程中，CD93 的表現量隨著時間越長逐漸 減少，在活化到第二天時減少約百分之五十；同時，我們亦觀察到巨噬細胞的吞 噬能力會隨著活化的天數而增加，在活化後第二天的細胞其吞噬能力比未刺激的 對照組促進約八倍。此結果顯示CD93 蛋白的表現可能與單核球的分化有關，因 此更進一步將CD93、CD93∆L 或 CD93∆C 蛋白暫時性的表現至 THP-1 細胞來探 討其與單核球分化及吞噬作用的相關性。實驗結果顯示，轉染入CD93 的細胞在 PMA 活化後的黏著能力比轉染入空載體的對照組降低約百分之六十，而轉染入 CD93∆L 的細胞則沒有差異，轉染入 CD93∆C 的細胞會促進約百分之六十。在研 究 THP-1 細胞吞噬作用的實驗中，我們發現轉染 CD93 的細胞其吞噬乳膠顆粒 的能力較送入空載體的對照組降低約百分之四十，而轉染入CD93∆L 和 CD93∆C 則沒有明顯差異。最後，將轉染CD93 的 THP-1 加入活化後的 HUVEC，也發現 轉染入CD93 的細胞對活化後的 HUVEC 的黏著能力比轉染入空載體的對照組降 低約百分之三十三，而轉染入 CD93∆C 則和對照組沒有差異。因此人類 CD93 蛋白可能與抑制巨噬細胞的細胞黏著與吞噬作用有關，並且 CD93 蛋白的 CRD 片段與細胞質內尾端可能在CD93 的不同細胞功能中扮演不同角色。
人類的巨噬細胞被定義為穿過內皮細胞層後的單核球所轉變而成，主要執 行吞噬作用(phagocytosis)，也經由細胞上的 MHC class II 呈現外來物質的片段給 helper T 細胞進而活化 B 細胞產生抗體，巨噬細胞再經由抗體的吸引參與吞噬外 來物質的機制。目前已知低濃度的PMA (phorbol myristate acetate)可以促使 THP-1 細胞由單核球分化為巨噬細胞，並由懸浮狀態的細胞轉變為附著性細胞。分化後 的細胞會表現許多巨噬細胞所具有的功能，其中包括了吞噬作用、免疫相關細胞 激素的釋放以及 PKC 訊息傳導路徑的活化，並且在沒有活化因子的刺激下，能
夠提高MHC class I 和 II 的表現，適合用以研究巨噬細胞的免疫相關機制13。我 們將THP-1 細胞經過 10 nM PMA 的處理後，可以發現刺激後的 THP-1 細胞其細 胞核質比(N/C ratio)下降，細胞質所佔的比率上升，細胞邊緣開始有不規則的型 態或有拉長狀的偽足產生，我們分別在24 小時與 48 小時收取附著到培養皿底部 的細胞，以流式細胞分析儀偵測CD93 在細胞上的表現。由圖二可以看到，隨著 PMA 的刺激時間增長，THP-1 在趨向分化為巨噬細胞時，人類 CD93 的表現量 是逐漸降低，這也印證了在人類的巨噬細胞並沒有CD93 蛋白的表現1。
由於活化的吞噬細胞具有良好的吞噬能力，我們也利用PMA 刺激 THP-1 24 小時與48 小時後的細胞，進行乳膠顆粒的吞噬實驗，同樣以流式細胞分析儀偵 測細胞的螢光表現，當螢光表現越強時，表示被吞噬的乳膠顆粒越多。在這個實 驗中，我們發現PMA 刺激後的 THP-1 是具有吞噬能力的，而且隨著刺激時間越 久，吞噬能力越強。綜合兩個實驗結果來探討，隨著PMA 刺激時間越長，吞噬 能力增加，但CD93 的量卻是下降的，倘若以往所提出 CD93 調控促進吞噬作用 是真實的，在我們實驗中所看到的應該會是隨著刺激時間越長，吞噬能力會因為 CD93 量的下降而趨緩。因此我們認為人類 CD93 在 PMA 刺激活化 THP-1 轉變 的過程中，對於巨噬細胞吞噬作用是負向的調控，在單核球未受到免疫刺激時，
穩定表現的CD93 可以抑制單核球往免疫活化的方向走，相反地當單核球受到刺 激需要進行免疫活化時，CD93 的量減少與單核球受到調控往免疫活化轉變為巨 噬細胞有關。
由於 PMA 刺激後 THP-1 的 CD93 量下降，但是吞噬作用增加，我們想進一 步探討 CD93 與吞噬作用之間的關連性，因此將 CD93-pEGFPN1 轉染入 THP-1 細胞中，等待六小時後其蛋白穩定表現，經由PMA 刺激細胞分化為巨噬細胞，
進行吞噬作用試驗，挑選讓細胞吞噬乳膠顆粒來廣泛定義所吞噬的對象，藉由流 式細胞分析儀圈選有表現標的質體的細胞，並偵測其吞噬乳膠顆粒的比例。由圖 三可見，在轉染CD93-pEGFPN1 的 THP-1，經 PMA 活化後其轉變為巨噬細胞時 吞噬乳膠顆粒的能力相較於轉染入空載體的對照組低，顯示其吞噬能力在表現
CD93 蛋白之後受到抑制，而轉染入 CD93∆L-pEGFPN1 與 CD93∆C-pEGFPN1 細 胞吞噬能力與對照組沒有明顯差異。此結果推測不論是醣蛋白辨識區域或是細胞 內尾端，對於人類CD93 抑制細胞吞噬作用的調控都有扮演重要角色。
單核球活化為巨噬細胞的過程中，要先經過單核球在內皮細胞表面滾動 (rolling) ， 活 化 (activation) 後 進 行 細 胞 黏 著 (adherence) ， 再 穿 越 內 皮 細 胞 層 (extravasation)進而成為一個活化的巨噬細胞執行各項任務。因此我們想要了解在 轉染CD93-pEGFPN1 的 THP-1 活化後，吞噬作用受到抑制，是否與更前期的細 胞黏著有相關聯。我們將CD93-pEGFPN1 轉染入 THP-1 細胞中，等待六小時後 其蛋白穩定表現，經由PMA 刺激細胞分化為巨噬細胞，讓細胞黏貼到培養皿的 底部，24 小時後進行有黏附的細胞計數。由圖五中可見，轉染 CD93-pEGFPN1 的 THP-1 活化後黏附到培養皿底部的細胞量會減少，證明 CD93 的表現與單核 球 活 化 為 巨 噬 細 胞 中 黏 著 的 這 個 步 驟 有 負 向 的 調 控 ， 而 轉 染 入 CD93∆L- pEGFPN1 的細胞黏附能力與對照組一樣，推測醣類辨識區域對於細胞黏著的步 驟有其重要的角色，以至於當刪除掉這個區域時就無法抑制細胞黏著。而轉染入 CD93∆C-pEGFPN1 的細胞有促進細胞黏著的現象，推測與蛋白質構型的改變或 外送位置不正確有關。
由上面的討論和實驗知道CD93 的表現會負向調控 THP-1 經由 PMA 活化黏 著到細胞培養皿底部的能力。我們進一步模擬生物體內的真實情況，直接將轉染 後的THP-1 細胞與 TNF-α活化的 HUVEC 接觸，探討 THP-1 活化與 CD93 的關 係。由圖六可見，轉染入CD93-pEGFPN1 的 THP-1 黏著到活化的 HUVEC 的能 力低於轉染入空載體的對照組，而轉染入CD93∆C-pEGFPN1 的細胞黏著的能力 則沒有受到抑制，顯示 CD93 蛋白的細胞質內尾端對於調控抑制 THP-1 細胞黏 著到HUVEC 的能力是有重要影響。
這些研究成果，使我們有更大的思考空間來全面探討CD93 蛋白質對吞噬作 用的影響，而不僅侷限在CD93 與 C1q 之交互作用的分析。同時，利用調控單核 球THP-1 細胞之 CD93 蛋白表現，亦能對 CD93 作用的機轉做更深入的研究。而
利用CD93 片段的重組蛋白，更可以研究這些蛋白質的生理功能。這將提供我們 更多關於CD93 蛋白功能的資訊，讓我們有更大的機會可以利用這些成果來研發 出可改善生理健康功能的相關醫藥應用。
參考文獻
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表一、PCR 引子核苷酸鏈的序列
引子 序列
C1qRp 3’
(stop deletion)
5’-CGC GGA TCC CAG TCT GTC CCA GGT GT-3’
BamH I C1qRp 1129
antisense
5’-GGG GTA CCC TTG GGG GCA GC-3’
C1qRp 1129
sense
5’-GGG GTA CCA GCT GGA CTC GA-3’
Kpn I
C1qRp 5’ 5’-GGA ATT CCG ATG GCC ACC TCC ATG GGC CTG-3’
EcoR I
C1qRp Signal 5’ 5’-CCC AAG CTT ATG GCC ACC TCC ATG GGC-3’
Hind III
C1qRp Signal 3’ 5’-GGA ATT CCC CCG CCC CGG GCT GGG TCA G-3’
EcoR I
C1qRp TM 3’ 5’-CGG GAT CCC CCA GAC CCA GGG CCA GCA G-3’
BamH I
C1qRp 2Ds 5’-TTG GAA TTC CCC AAG TAT GGC TGC AAC TTC-3’
EcoR I
表二、人類CD93 蛋白的基因及各結構序列
區域 結構 基因序列
Domain I CRD region 186－644
Domain II EGF-like domain 900－1526
Domain III Mucin-like domain 1527－1862
Domain IV Transmembrane domain 1863－1925
Domain V Cytoplasmic tail 1926－2075
圖一、分別將 CD93、CD93- ∆L 及 CD93- ∆C 基因構築到螢光蛋白(GFP)表現載 體 pEGFP-N1 (A) 。 以 限 制 酶 檢 視 構 築 在 載 體 上 基 因 之 正 確 性 (B) 。 CD93-pEGFPN1 和 CD93-∆C-pEGFPN1 以限制酶 EcoR I and BamH I 切割；CD93-
∆L-pEGFPN1 以限制酶 BamH I and Hind III 切割。
M
CD93 ∆L CD93 ∆C CD93
A B
Negative control 2 Ab control PMA active Day 1 PMA active Day 2 THP-1 control Negative control 2 Ab control PMA active Day 1 PMA active Day 2 THP-1 control
Ne gat ive
c ont ro l
2A b con tro l
THP -1
10 nM PM
A Da y 1
10 nM
P M A Da y 2 0
25 50 75 100
C D 9 3 expr essi on
圖二、利用流式細胞分析儀偵測THP-1 細胞經 PMA 刺激後的人類 CD93 表現。
在Histogram 圖中，定義 THP-1control 與 2Ab control 間約 101到104螢光表現為 M1/R1 區域，圈選此區域定義為有表現 CD93 蛋白的細胞，每個組別都偵測 104 顆細胞 (此為五次實驗中的代表)。
Ne gati
ve cont rol
10nMP
MA day 1
10nMP MA Da
y 2 0
10 20 30 40
% Tot al
圖三、利用流式細胞分析儀偵測 THP-1 細胞經 PMA 刺激後吞噬乳膠顆粒的 百分比 (此為四次實驗中的代表)。在 Histogram 圖中，定義 2x102到 104螢光表
現為M1/R1 區域，圈選此區域定義為有吞噬乳膠顆粒的細胞。% Total ：有吞噬 乳膠顆粒的細胞佔所有偵測細胞的百分比。每個組別都偵測104顆細胞。
pEGFP-N1 CD93∆L CD93
∆C CD93
Normal control
PMA control
Normal control PMA control pEGFP-N1 CD93∆L CD93
∆C D93
A B
pEGFP-N1 CD93∆L CD93
∆C CD93
C D
pEGF P-N1
CD 93
L CD9 3
∆ C CD
93
∆ 0
10 20 30 40 50 60
%Total
pEGFP-N1 CD93∆L CD93
∆C CD93
Normal control
PMA control
Normal control PMA control pEGFP-N1 CD93∆L CD93
∆C D93
A B
pEGFP-N1 CD93∆L CD93
∆C CD93
C
pEGFP-N1 CD93∆L CD93
∆C CD93
C D
pEGF P-N1
CD 93
L CD9 3
∆ C CD
93
∆ 0
10 20 30 40 50 60
%Total
圖四、利用流式細胞分析儀偵測轉染CD93、CD93∆L、CD93∆C 之 THP-1 細胞 經PMA 刺激後吞噬乳膠顆粒的百分比 (此為四次實驗中的代表)
A. THP-1 細胞吞入的乳膠顆粒螢光表現量 (紅光)
B. THP-1 細胞轉染入 CD93 不同片段表現螢光表現量 (綠光) C. 轉染後 THP-1 細胞有吞入乳膠顆粒的細胞數與螢光表現量
藉由定義 B.圖中 101到104的螢光表現區域為轉染陽性區M1/R1，
圈選此區域的細胞偵測其乳膠螢光量，每個組別偵測 104顆細胞。
D. 轉染後 THP-1 細胞有吞噬乳膠顆粒的細胞數百分比
將圈選出的 C.圖的細胞除以所有偵測細胞，每個組別都偵測 104顆 細胞。% Total ：有吞噬乳膠顆粒的細胞佔所有偵測細胞的百分比。
pE GFP -N 1
CD 93
L CD 93
∆ C CD
93
∆ 0
10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000
C e ll num be r
圖五、 轉染 CD93、CD93∆L、CD93∆C 之 THP-1 細胞經 PMA 刺激後細 胞分化黏著的分析圖 (此結果為三次實驗的代表)
HUVEC on
ly
inact ive H
UVEC control
TH P-1 c
ontrol pEGFP
-N1 CD
93
C CD9 3
∆ 0
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Fl u o rescen ce
圖六、轉染CD93、CD93∆C 之 THP-1 細胞黏著於 TNF-α 活化的 HUVEC 細胞 分析圖 (此為四次實驗中的代表)
HUVEC cell TNF-α activation Labled THP-1 cell
HUVEC only + － －
Inactive HUVEC control ＋ － +
THP-1 control + + +
附錄一、pEGFP-N1 質體的圖譜與選殖限制酶切點 ( BD Biosciences Clontech)
AJ295142 Homo sapiens mRNA for C1q receptor protein (CD93 gene)
1 ctgcgccgga gtggctgcag ctcacccctc agctcccctt ggggcccagc tgggagccga 61 gatagaagct cctgtcgccg ctgggcttct cgcctcccgc agagggccac acagagaccg 121 ggatggccac ctccatgggc ctgctgctgc tgctgctgct gctcctgacc cagcccgggg 181 cggggacggg agctgacacg gaggcggtgg tctgcgtggg gaccgcctgc tacacggccc 241 actcgggcaa gctgagcgct gccgaggccc agaaccactg caaccagaac gggggcaacc 301 tggccactgt gaagagcaag gaggaggccc agcacgtcca gcgagtactg gcccagctcc 361 tgaggcggga ggcagccctg acggcgagga tgagcaagtt ctggattggg ctccagcgag 421 agaagggcaa gtgcctggac cctagtctgc cgctgaaggg cttcagctgg gtgggcgggg 481 gggaggacac gccttactct aactggcaca aggagctccg gaactcgtgc atctccaagc 541 gctgtgtgtc tctgctgctg gacctgtccc agccgctcct tcccagccgc ctccccaagt 601 ggtctgaggg cccctgtggg agcccaggct cccccggaag taacattgag ggcttcgtgt 661 gcaagttcag cttcaaaggc atgtgccggc ctctggccct ggggggccca ggtcaggtga 721 cctacaccac ccccttccag accaccagtt cctccttgga ggctgtgccc tttgcctctg 781 cggccaatgt agcctgtggg gaaggtgaca aggacgagac tcagagtcat tatttcctgt 841 gcaaggagaa ggcccccgat gtgttcgact ggggcagctc gggccccctc tgtgtcagcc 901 ccaagtatgg ctgcaacttc aacaatgggg gctgccacca ggactgcttt gaaggggggg 961 atggctcctt cctctgcggc tgccgaccag gattccggct gctggatgac ctggtgacct 1021 gtgcctctcg aaacccttgc agctccagcc catgtcgtgg gggggccacg tgcgccctgg 1081 gaccccatgg gaaaaactac acgtgccgct gcccccaagg gtaccagctg gactcgagtc 1141 agctggactg tgtggacgtg gatgaatgcc aggactcccc ctgtgcccag gagtgtgtca 1201 acacccctgg gggcttccgc tgcgaatgct gggttggcta tgagccgggc ggtcctggag 1261 agggggcctg tcaggatgtg gatgagtgtg ctctgggtcg ctcgccttgc gcccagggct 1321 gcaccaacac agatggctca tttcactgct cctgtgagga gggctacgtc ctggccgggg 1381 aggacgggac tcagtgccag gacgtggatg agtgtgtggg cccggggggc cccctctgcg 1441 acagcttgtg cttcaacaca caagggtcct tccactgtgg ctgcctgcca ggctgggtgc 1501 tggccccaaa tggggtctct tgcaccatgg ggcctgtgtc tctgggacca ccatctgggc 1561 cccccgatga ggaggacaaa ggagagaaag aagggagcac cgtgccccgc gctgcaacag 1621 ccagtcccac aaggggcccc gagggcaccc ccaaggctac acccaccaca agtagacctt 1681 cgctgtcatc tgacgccccc atcacatctg ccccactcaa gatgctggcc cccagtgggt 1741 cctcaggcgt ctggagggag cccagcatcc atcacgccac agctgcctct ggcccccagg 1801 agcctgcagg tggggactcc tccgtggcca cacaaaacaa cgatggcact gacgggcaaa 1861 agctgctttt attctacatc ctaggcaccg tggtggccat cctactcctg ctggccctgg 1921 ctctggggct actggtctat cgcaagcgga gagcgaagag ggaggagaag aaggagaaga 1981 agccccagaa tgcggcagac agttactcct gggttccaga gcgagctgag agcagggcca 2041 tggagaacca gtacagtccg acacctggga cagactgctg aaagtgaggt ggccctagag
2101 acactagagt caccagccac catcctcaga gctttgaact ccccattcca aaggggcacc 2161 cacatttttt tgaaagactg gactggaatc ttagcaaaca attgtaagtc tcctccttaa 2221 aggccccttg gaacatgcag gtattttcta cgggtgtttg atgttcctga agtggaagct 2281 gtgtgttggc gtgccacggt ggggatttcg tgactctata atgattgtta ctccccctcc 2341 cttttcaaat tccaatgtga ccaattccgg atcagggtgt gaggaggctg gggctaaggg 2401 gctcccctga atatcttctc tgctcacttc caccatctaa gaggaaaagg tgagttgctc 2461 atgctgatta ggattgaaat gatttgtttc tcttcctagg atgaaaacta aatcaattaa 2521 ttattcaatt aggtaagaag atctggtttt ttggtcaaag ggaacatgtt cggactggaa 2581 acatttcttt acatttgcat tcctccattt cgccagcaca agtcttgcta aatgtgatac 2641 tgttgacatc ctccagaatg gccagaagtg caattaacct cttaggtggc aaggaggcag 2701 gaagtgcctc tttagttctt acatttctaa tagccttggg tttatttgca aaggaagctt 2761 gaaaaatatg agaaaagttg cttgaagtgc attacaggtg tttgtgaagt cacataatct 2821 acggggctag ggcgagagag gccagggatt tgttcacaga tacttgaatt aattcatcca 2881 aatgtactga ggttaccaca cacttgacta cggatgtgat caacactaac aaggaaacaa 2941 attcaaggac aacctgtctt tgagccaggg caggcctcag acaccctgcc tgtggccccg 3001 cctccacttc atcctgcccg gaatgccagt gctccgagct cagacagagg aagccctgca 3061 gaaagttcca tcaggctgtt tcctaaagga tgtgtgaacg ggagatgatg cactgtgttt 3121 tgaaagttgt cattttaaag cattttagca cagttcatag tccacagttg atgcagcatc 3181 ctgagatttt aaatcctgaa gtgtgggtgg cgcacacacc aagtagggag ctagtcaggc 3241 agtttgctta aggaactttt gttctctgtc tcttttcctt aaaattgggg gtaaggaggg 3301 aaggaagagg gaaagagatg actaactaaa atcattt
附錄二、人類CD93 蛋白之 cDNA 序列
