國立臺東大學生命科學系 碩士論文
指導教授：黃祥恩博士
台東地區荖葉伺機性感染土棲細菌分離 鑑定與防治策略開發
The identification and control strategies development of the disease on the betel
cause by opportunistic infecting soil bacteria in Taitung
研究生：林俊成 撰
中華民國一百零二年一月
國立臺東大學生命科學系 碩士論文
台東地區荖葉伺機性感染土棲細菌分離 鑑定與防治策略開發
The identification and control strategies development of the disease on the betel
cause by opportunistic infecting soil bacteria in Taitung
研究生：林俊成 撰 指導教授：黃祥恩 博士
中華民國一百零二年一月
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致謝
一本論文的完成，需要很多人的幫助。從無到有，從懵懂到專業，這是一條
艱辛但是值得的路程。一路上走來的我，跌跌撞撞，但是在這條路上，我很慶幸 遇到許多幫助我的人。幫助我最多而且最深的人，絕對非指導教授黃祥恩老師莫 屬，我就像一顆頑石，俗話說：『玉不琢，不成器』，老師總是不厭其煩並且很有 耐心的磨練我這顆頑石，從他身上我學到了很多東西，並且老師也會教導我做人 的道理以及社會上經驗的分享，很感謝老師對我的付出，真的讓我受益良多。另 外也要感謝葛孟杰老師以及李俊霖老師對於這本論文的建議及指導，讓我知道自 己還有許多需要加強的地方。感謝系辦美麗的助理莊惠菁小姐，總是在我分身乏 術、對於學校行政流程有疑惑的時候，總是不厭其煩的幫忙、提醒我，讓我能夠 順利完成學校交代的事，感謝之情，難以言喻。感謝曾經一起在實驗室奮戰的佳 燕、耀文、兒倩、佩穎、姿縈，有了你們的歡笑，讓我的實驗生活增添了許多色 彩。感謝目前也一樣為了學業努力的弦育，沒有你的跑腿，沒有今天的論文，希 望你也要努力加油。感謝實驗室的郭老師、詩雅、阿賴、妤瑄、世禾、豆腐、敬 原、玉君、冠孙、郁雯、育仁、少宣、志暄、亭采，各位不論是對於我個人還是 我的實驗，都給予莫大的幫助，在實驗室輕鬆的閒話家常，讓我緊繃的神經總是 能夠紓解不少。感謝遠在外縣市的慧錡及宜涵，即使在不同的地方，仍然常常關 心我的近況，並且當我的垃圾桶。感謝在同一時期一起奮鬥的軒丞及昆奇，一個 人奮戰總是孤單的，有你們的陪伴，彼此互相打氣，才讓我能夠順利度過這一關。
最後要感謝我的父母，總是無條件的支持我，並且不讓我有壓力的順利念完碩 士。當然，不免最後要說一句，『要謝的人太多了，不如就謝天吧』。謝謝所有曾 經幫助過我的人，因為有你們，這本論文才得以完成，在此將這本論文獻給幫助 過我以及教導過我的所有人。
i
台東地區荖葉伺機性感染土棲細菌分離 鑑定與防治策略開發
學生：林俊成
國立臺東大學生命科學系
中文摘要
荖葉為高產值經濟作物，年產值可達到 40 至 80 億元。但台灣
氣候多雨潮濕，導致病害相當嚴重，常見的病害有炭疽病、疫病、白
絹病、白粉病及細菌性角斑病，除了上述病害外，尚有少數土壤細菌
可以在特定狀況下造成植物感染，我們稱這些細菌為伺機性感染病原
菌 (opportunist pathogens)，在荖葉裡面，伺機性感染病原菌的研究很
少，所以本研究的主要目的在針對台東荖葉伺機性感染病原菌進行分
離、鑑定及防治策略的開發。在初步研究結果顯示，2011 年 1 月到
2 月，荖葉病害指數明顯高於 2010 年其它月份。在病害田中，分離
了 4 株伺機性感染病原菌，分別為 Acinetobacter baumannii
(Xan3-L1S1)、Cellulosimicrobium cellulans (Q1-L1S2)、Sphingomonas
sp. (3-2a-L2S1) 及未鑑定分離株 (J3-L2S2)，上述 4 株分離株均不具
有分解界面活性劑 (tween) 的能力。分離株 Xan3-L1S1 及 J3-L2S2
可被 estA 基因專一性引子經 PCR 增幅產生 DNA 片段。在病原性
測試方面，分離株 Xan3-L1S1 能對荖葉幼年性葉片及莖部引起強烈
ii
病徵，但在成熟葉片並無感染能力，分離株 Q1-L1S2 僅在幼年性葉 片引起嚴重病徵，分離株 3-2a-L2S1 僅在莖部引起嚴重病徵，而分 離株 J3-L2S2 只在幼年性葉片及莖部引起輕微病徵。其中，分離株 Xan3-L1S1 可在 40 ℃高溫環境下生存，高濃度的葡萄糖及木糖則會 抑制分離株 Xan3-L1S1及 Q1-L1S2 生長，但對分離株 J3-L2S2 則 無明顯影響。2 %奈米鈣及碳酸鈣分別可以抑制分離株 Xan3-L1S1 在荖葉產生病害的能力，即使處理人工傷口，奈米鈣仍然具有抑制分 離株 Xan3-L1S1 的致病能力，但是奈米鈣並不會直接影響分離株 Xan3-L1S1 生長。綜合以上實驗結果，我們認為分離株 Xan3-L1S1、
Q1-L1S2 及 3-2a-L2S1 為伺機性感染病原菌，並且藉由奈米鈣的添 加，可以防治上述兩株伺機性感染病原菌 Xan3-L1S1 及 Q1L-L1S2 在荖葉造成的病害，在未來耕作方面可以做為應用的參考。
關鍵字：荖葉、伺機性感染病原菌、碳酸鈣
iii
The identification and control of the disease on the betel cause by opportunistic infecting soil bacteria in Taitung
Author：Jiunn-Cheng Lin Abstract
Piper betle is a high production crop with value of about 4-8 billions
annually. Due to high rainfall and humidity weather in Taiwan, diseases
such as anthracnose, phytophthora disease, southern blight, powdery
mildew and angular spot disease are highly-rated and common. In
addition to these diseases, there are few microbe that can cause symptom
in uncertain condition, name as opportunist pathogens that in Piper betle
is unclearly. Thus the main purpose of this study is to identifity and
control of the disease on the Piper betle cause by opportunistic infecting
soil bacteria in Taitung. The result shown that disease index of Piper betle
in the period of January 2011 to February was significantly higher than in
other months of 2010. There are 4 independent opportunistic pathogens
have been identified in this investigation, such as Acinetobacter
baumannii (Xan3-L1S1), Cellulosimicrobium cellulans (Q1-L1S2),
Sphingomonassp. (3-2a-L2S1) and unknown (J3-L2S2) that were unable
to hydrolysis tween activity. PCR amplification with estA primer from
DNA template of Xan3-L1S1 and J3-L2S2 got amplificated in the predict
size. The isolated Xan3-L1S1 caused serious disease symptoms in young
leaves and stems, but it did not in matured leaves. The isolated Q1-L1S2
caused serious symptoms in the young leaves, but did not in the stem. By
contrast, isolated 3-2a-L2S1 only caused serious symptoms in the stem,
iv
but did not in the leave. The isolated J3-L2S2 caused minute symptoms in both young leaves and stems. Xan3-L1S1 could survive under heat stress environment at 40 ℃. High concentrations of glucose and xylose inhibited growth of Xan3-L1S1 and Q1-L1S2 growth, but did not the J3-L2S2 in the Xan-D medium. Both nanolevel and in general calcium carbonate could inhibit symptom caused by Xan3-L1S1 in all tissue of Piper betle. The artificial wound did not affect the resistance caused by nanolevel-calcium carbonate in Piper betle leave. These calcium carbonate did not inhibit growth of Xan3-L1S1 directly. Based on those results, we suppose that isolatesd Xan3-L1S1, Q1-L1S2 and 3-2a-L2S1 might be one of opportunistic infection pathogens that would cause symptoms in young leaf tissue. Addition of nanolevel-calcium carbonate, prevented the disease from Xan3-L1S1 and Q1-L1S2 on Piper betle. This strategy In the future, this findings could also be used as reference for other agriculture of piper betel in the future.
Keywords：Piper betle、opportunist pathogens、calcium carbonate
v
目次
致謝 ... i
中文摘要 ... ii
英文摘要 ... iv
目次... vi
附錄... viii
表目次 ... xi
圖目次 ... x
第一章、前言 ..………...………..……...1
第一節、荖葉特性....………...2
第二節、荖葉病害 ..………..………...2
一、真菌性病害 ...………..…………..……...…..2
二、細菌性病害 …………..………...……...3
三、伺機性感染病原菌 ..…………...………...3
第三節、Acinetobacter 屬細菌...5
第四節、Cellulosimicrobium 屬細菌...6
第五節、Sphingomonas 屬細菌 ...…………...7
第六節、植物誘導抗性與鈣離子關係 ………..……...8
第七節、研究目的 ………..………...10
第二章、 材料與方法 ……….………..………...….11
第一節、調查樣區 ………..………...11
第二節、實驗材料 ...11
一、植株材料 ……….…....……...11
二、菌株材料 ……….……....…...12
三、PCR 使用之引子 ...12
第三節、實驗方法 ………...13
一、田間調查 ……...………..…………...…...13
二、病原株分離及保存 ………...………..………...13
三、培養基鑑定 ………..……..…...13
第四節、分離株鑑定 ...14
一、分離株 DNA 抽取 ...14
二、聚合酶連鎖反應 (PCR) 鑑定分離株 ...15
三、PCR 產物純化 (PCR clean up) ...15
四、DNA 電泳 ...16
五、勝任細胞製備 (Competent cell preparation) ...16
六、TA-Cloning ...16
(一) 接合作用 (Ligation) ...16
(二) 轉形作用 (Transformation) ...17
柒、質體 DNA (plasmid DNA) 抽取 ...17
捌、限制酶剪切 ...17
玖、DNA 定序 ...18
第四節、病原性之測定及接種 ...18
一、葉部接種 ...18
vi
二、莖部接種 ...18
第五節、病原菌生長溫度測試 ...19
一、吸光值與菌數相關試驗 ...19
二、測試不同溫度下對分離株生長影響 ...19
三、測試不同碳素源對分離中生長影響 ...19
第六節、防治試驗 ...20
第三章、結果 ...21
第一節、臺東荖葉園病害調查結果 ...21
第二節、接種測試 ...21
一、分離株在荖葉葉片及莖部接種測試 ...21
二、不同年齡荖葉葉片對分離株發病能力測試 ...22
第三節、病原菌鑑定 ...22
一、利用培養基鑑定分離株 ...22
二、利用 estA 專一性引子進行 PCR 來檢測病分離株...23
三、定序與親緣關係 ……….……….……..23
第四節、生長培養特性 ...24
一、病原分離株在不同溫度下生長影響 ...24
二、葡萄糖含量對病原分離株生長影響 ...24
三、不同碳素源對病原分離株生長影響 ...25
第五節、防治試驗 ...26
一、碳酸鈣及奈米鈣對於分離株在葉部引起病徵能力的影響 ………...26
二、碳酸鈣及奈米鈣對於分離株在莖部引起病徵能力的影響 …………...27
三、碳酸鈣及奈米鈣添加對於分離株 Xan3-L1S1 生長影響 ………...28
四、奈米鈣在人工傷口葉片上病害防治能力測試...28
第四章、 討論 ………...30
第一節、台東地區荖葉園病害調查結果 ………...…...30
第二節、不同年齡荖葉葉片對分離株發病能力測試……….. ...……30
第三節、分離株鑑定………..……….…31
第四節、分離株接種 ...……….…..…32
第五節、分離株生長特性 ...………...33
第六節、奈米鈣防治試驗 ………...34
參考文獻 ………....……36
一、中文部分………...36
二、英文部分………...37
vii
附錄
附錄 1、荖葉園調查樣區簡圖………..………….…….84
附錄 2、荖葉園調查示意圖及病害級數判斷依據 ……….………..…….85
附錄 3、調查樣區及特性 ………..…..……….……...……86
附錄 4、實驗菌株來源及用途………..……87
附錄 5、培養基配方表 …..………..……88
附錄 6、PCR 使用引子條件 .………...……...…….89
viii
表目次
表一、臺東地區荖葉園調查病害結果 ………..………..47 表二、分離株在不同培養基生長情形 ………...49
ix
圖目次
圖一、分離株在荖葉葉片及莖部病害發展測試 ...………...……50
圖二、分離株 Xan3-L1S1 對於不同年齡老葉在葉部引起病徵能力的影響…...52
圖三、利用 estA 專一性引子進行 PCR 來檢測病原分離株 ……..……….54
圖四、分離株 Q1-L1S2 U4+U5 引子 PCR 產物的 16s rRNA 相似序列比對結 果...56
圖五、分離株 Xan3-L1S1 U4+U5 引子 PCR 產物的 16s rRNA 相似序列比對結 果………..58
圖六、分離株 3-2a-L2S1 U3+U4 引子 PCR 產物的 16s rRNA 相似序列比對結 果...60
圖七、分離株在不同溫度下培養情形 ...62
圖八、碳素源濃度改變對分離株生長之影響 ...64
圖九、碳素源來源改變對分離株生長之影響 ...66
圖十、碳酸鈣及奈米鈣對分離株 Xan3-L1S1 在葉部引起病徵能力的影響 ...68
圖十一、碳酸鈣及奈米鈣對於分離株 Xan3-L1S1 在莖部引起病徵能力的影響.70 圖十二、碳酸鈣及奈米鈣對於分離株 Q1-L1S2 在葉部引起病徵能力的影響...72
圖十三、碳酸鈣及奈米鈣對於分離株 Q1-L1S2 在莖部引起病徵能力的影響...74
圖十四、碳酸鈣及奈米鈣對於分離株 J3-L2S2 在葉部引起病徵能力的影響...76
圖十五、碳酸鈣及奈米鈣對於分離株 J3-L2S2 在莖部引起病徵能力的影響...78
圖十六、培養中添加碳酸鈣及奈米鈣對分離株 Xan3-L1S1 生長影響…...80
圖十七、人工傷口對奈米鈣誘發抗性影響………...82
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第一章、前言
第一節、荖葉特性
荖葉屬於植物界 (Plantae)，被子植物門 (Magnoliophyta)，雙子葉植物綱 (Magnoliopsida)，胡椒目(Piperales)，胡椒科 (Piperaceae)，胡椒屬 (Piper)，荖葉 種 (P. betle) (Arambewela et al., 2011)。目前在世界上，荖葉一共有大約一百多種 品種，其中大約有四十種在印度，而有三十種在孟加拉 (Guha, 2006)。荖葉是一 種喜歡生長在陰影處的多年生攀附植物 (Guha, 2006；Lakshmi et al., 2006；Nikhil, 2005) 且雌雄異株，葉片形態為互生，葉呈橢圓狀卵形，長約 7 - 18 公分，寬約 4 - 11 公分，莖部強狀 (用於攀附) 且有節點，植株高度約為 100 - 200 公分 (Lakshmi et al., 2006)。原產於熱帶地區 (印度等地)，故適合生在長氣候溫暖及雨 量充足地區，其中最適年雨量為 2250 - 4750 mm，最適相對濕度為 40 % - 80
%，溫度在 15 - 40 ℃ (Guha, 2006)，最適土壤 pH 值約為 5.6 - 8.2，適宜的栽培 介質為沙質壤土或沙質粘土 (Council for Scientific and Industrial Research, 1969；Guha and Jain, 1997)。荖葉本身也屬於高勞力、營養需求作物，每公頃氮 需求量約為 400 - 600 公斤，磷需求量約為 200 - 300 公斤，鉀需求量約為 200 - 250 公斤 (Bhowmick, 1997；Guha and Jain, 1997；Jana, 1995；1998；Maity, 1 9 8 9 ) 。 荖 葉 的 成 分 因 研 究 文 獻 不 同 而 略 有 不 同 ， 從 國 際 癌 症 研 究 組 織
（International Agency for Research on Cancer, IARC） 1985 年的報告知道荖葉中 含有丁香油酚 (eugenol）、硝酸以及少量的醣類、澱粉、單寧等成分 (IARC, 1985)。近年來報告也指出，荖葉中除了含有丁香油酚及硝酸外，還有黃樟素 (Safrole)、烯丙基兒茶酚二乙酸酯 (allylcatechol diacetate) 及醋酸 (Chavibitol acetate) 等物質 (Arambewela et al., 2005；2011)。至於分析台灣生產的荖葉中之 成分，可發現含約 80 %的水分，3 %的蛋白質，2 %的脂質，11 %的粗纖維及其 他少量成份。另外荖葉中並含有多量的類胡蘿蔔素和維他命 C (Wang and Wu, 1996)。在傳統的治療中，已經知道荖葉對於風濕、擦傷腫脹、口臭、膿腫、結
2
膜炎、便秘、頭痛、白帶和癬等各種疾病的治療是有功效，而荖葉根部則被知道 有避孕藥的效果 (Chopra et al., 1956；Khanra, 1997；Lakshmi et al., 2005)。此外，
荖葉所萃取出來的油，除了可拿來當作牙膏、香水及肥皂等製造原料，還能拿來 當作巧克力等食用原料 (Guha, 2000)。
第二節、荖葉病害 一、真菌性病害
荖 葉 常 見 的 真 菌 性 病 害 有 炭 疽 病 、 疫 病 及 白 絹 病 。 炭 疽 病 病 原 菌 為 Colletotrichum gleosporioides，主要病徵為在葉片上會產生不規則形的淡褐色至 暗褐色病斑。防治主要以化學農藥防治為主，例如：3,000 倍的 24.9 %「待克利」
乳劑、4,000 - 6,000 倍的 50 %「撲克拉錳」可濕性粉劑、400 倍的 74 %貝芬錳 可濕性粉劑。疫病病原菌為 Phytophthora capsici，受感染組織除了會呈現黑褐色 外，也會像是被水浸泡過形成水浸狀，接著會產生腐敗及地上部組織死亡。防治 方法主要有；1. 改善土壤品質使土壤保水功能降低及保持通風。2. 將染病的根、
莖及葉在園區外以火燒毀或者放置於太陽下曝曬。3. 化學農藥：在種植或落藤 前，在種植植物的地點附近施灑 2.5 % 「右滅達樂」粒劑後用土覆蓋，用量大 約 40 公斤/公頃。4. 非化學農藥：將帄時用來洗滌餐具的沙拉脫或洗碗精稀釋 1,000 倍後加入於土壤中，該藥劑有抑制真菌孢囊（Sporangium）的發芽，也可 減少疫病的發生。白絹病病原菌為 Sclerotium rolfsii，可以藉由灌溉水或污染的 農具或種子混雜菌核而傳播。該病原菌主要為害於植物的根部及莖部，通常可看 見受感染組織上方有白色絨毛狀菌絲向四方延伸，接著菌絲會形成菌核。此外，
菌核可長期存活於土壤中，是本病的最重要傳染源。主要防治方法有：1. 物理 防治：選擇水稻進行輪作，因為水稻並非寄主植物，淹水又可以降低菌核數量。
2. 施用土壤添加物：於種植前添加 50 到 80 公斤/每分地的尿素、碳酸氫銨或 碳酸銨，利用透明圕膠布覆蓋，經過 14 天後再種植。3. 化學防治：拔除病株
3
後，可參考選用以 3,000 倍的 50 % 「福多寧」可濕性粉劑、2,000 倍的 25 % 「賓 克隆」可濕性粉劑等藥劑，噴灌罹病株附近植株地際部及土壤，以預防病害蔓延 (黃，2010) 。
二、細菌性病害
細菌性角斑病的病原菌為 Xanthomonas campestris pv. betlicola，主要病徵 出現在葉脈，若病菌病原性強，則會跨過葉脈而蔓延至整片葉片甚至整棵植株，
導致整片葉片呈現褐色枯萎狀，最後使得整棵植株死亡；若病原性弱，則會無法 跨越葉脈，於葉脈間呈現不規則的黑褐色角型病斑，外圍還會有一層黃暈色病 斑。除此之外，病菌也會經由植物的氣孔進入，導致葉緣或者葉尖受到感染，並 產生黑褐色病徵，由外圍往內部逐漸蔓延，受感染葉片前端也會產生黃暈，接著 會看見葉脈受到感染而轉變成黑色。病原菌除了能感染葉部外，也能夠感染莖 部，莖部受到感染時，整個組織會呈現黑色，由於莖部外型像骨頭狀，所以農民 通常將此病稱之為「黑骨」。目前防治方法主要是以：1. 剪除受感染病葉及病莖 部分，集中燒毀處理，切勿留在植株上及田間而成為感染源。2. 化學農藥防治：
含 10 %「鏈四環黴素」可溶性粉劑 1,000 倍的抗生素劑及含 81.3 %「嘉賜銅」
可濕性粉劑 1,000 倍的銅製劑等。為了預防病菌產生抗藥性，盡量避免長時間 同時使用同一種藥劑。銅劑則應避免與有機磷劑混合，以避免造成新葉藥害 (黃，
2010)。
三、伺機性感染病原菌
宿主表面、體內的消化道和呼吸道等，都生存著許多菌叢微生物，在宿主免 疫力正常時，這些菌叢會受到其它正常的菌叢壓抑和宿主共存，並不會對宿主造 成危險，但是當宿主的免疫力減弱 (例如白血病或愛滋病等) 或著正常菌叢遭到 破壞 (抗生素等原因)，這些原本無害的正常菌叢就會伺機造成宿主的感染與生
4
病，我們將之稱為伺機性病原菌 (Opportunistic pathogens)。伺機性感染病原菌的 案例不論是在人體還是植物或者動物都有被報導，在人體方面像是由念珠菌造成 的口腔念珠菌病 (Oral Candidiasis)，念珠菌是屬於一種酵母菌，通常存在宿主消 化道、皮膚黏膜或口腔中，念珠菌並不會造成疾病，但是當宿主免疫力受損時 (接 受化療或得到愛滋病)，才會繁殖及致病 (Yuvraj et al., 2010)；造成隱球菌病 (cryptococcosis) 的病原菌新型隱球菌 (Cryptococcus neoformans)，也是一種人體 常見的伺機性感染病原菌，在免疫力功能低下的病患都可發現其蹤跡 (Majid et al., 2010)；Acinetobacter 屬細菌通常與人類共生存在，通常存在於皮膚、腋下、
口腔、及下腸胃道等，但在重症病患體內分離出的 Acinetobacter，常扮演一個 伺機性感染的病原菌，並且造成敗血症。通常造成人體疾病的為 A. baumannii，
而其他的 Acinetobacter 屬細菌則較少發生感染人體情形 (Elizabeth et al., 1996)。在植物方面，引起馬拉巴栗根腐病的黑腐菌 (Lasiodiplodia theobromae)，
主要也是存在土壤表面和空氣中，當馬拉巴栗苗經過切根與修剪造成傷口時，黑 腐菌就會趁機入侵，是一種伺機性病原菌 (蘇等，2012)；另外有研究指出，將 阿拉伯芥於水耕培養 10 天後，實驗室用的革蘭氏陰性菌的 Escherichia coli (DH5α) 和革蘭氏陽性菌 Bacillus subtilis 也能夠對阿拉伯芥造成感染，但是如果 是種植於土壤中阿拉伯芥，10 天後同樣進行同樣接種，發現 E. coli DH5α 和 B.
subtilis 就無法對阿拉伯芥造成感染 (Gopalan and Frederick, 2008)，此外也發現 多半生存在泥土中，或是植物內生菌並且曾被用來作生物防治和誘導植物抗性的 B. pumilus，先後都發現分別能夠在桃樹、芒果及山藥上引起細菌性斑點病、葉 枯病和葉斑病 (許等，2010)。在動物方面，造成魚類水黴菌感染症的水黴菌，
主要為 Saprolegnia 屬細菌，也是一種伺機性病原菌，通常在氣溫下降、魚類免 疫力低下和體表受到創傷時而容易造成感染，除了魚類以外，Saprolegnia 屬細 菌對於兩棲類及水生無脊椎動物也具有致病能力 (杜，2012)。除了上述伺機性 病原菌分別能對特定物種造成感染外，也有能夠感染多個物種的伺機性病原菌，
5
目前有被報導出來的像是綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa)，在人體方面，綠 膿桿菌在人體免疫功能低下時，會對肺部造成感染及纖維化 (Govan and Deretic, 1996)，除了人體以外，綠膿桿菌也會對昆蟲 (Jander et al., 2000 )、線蟲 (Mahajan-Miklos et al., 1999) 以及像是番茄、萵苣、洋蔥和馬鈴薯 (Mahajan et al., 1999) 等植物造成感染。
第三節、Acinetobacter 屬細菌
Acinetobacter 屬細菌在分類上是屬於變型菌門 (Proteobateria)，變型菌綱 (Gammaproteobateria)，假單胞目 (Pseudomonadales)，莫拉菌科 (Moraxellaceae)，
不動桿菌屬 (Acinetobacter)。Acinetobacter 屬細菌是一種革蘭氏陰性菌，在土壤 及水中廣泛的存在，此外，它偶而也會在人類的皮膚黏膜及分泌物的培養中發 現，Acinetobacter 最早由 Brisou 及 Prevot 在 1954 年發現，並且將 Acinetobacter分類為 A. calcoaceticus 及 A.lwoffii；根據文獻記載，Acinetobacter 已被分離出十九個不同菌株，但是只有七個菌株被命名 (A. calcoaceticus、A.
lwoffii、A. baumannii、A.haemolyticus、A. junii、A. johnsonii、A. radioresistens) (Bouvet et al., 1986)；Acinetobacter 屬細菌除了在人體中有發現記錄外，在植物 當中也有發現其存在的蹤影，像是有研究人員在分離早豐紅茄莖部的病原菌時，
分別分離出了A. pasteurianus、A. baumannii、Bradyrhizobium japonicum、
Enterobacter cancerogenus、Microbacterium barkeri、Yersinia aldovae 和 Salmonella typhimurium，除了莖部以外，也在根部分別分離出了 A. haemolyticus 和 P. chlororaphis (藍等，2009)；除了早豐紅茄，還有馬鈴薯中，也發現了 Acinetobacter 屬細菌寄生在其體內成為內生菌，並且能促進植物生長發育等功 能 (Heuer and Smalla, 1999; Sturz et al., 1999)；除了上述報告植物有分離出 Acinetobacter 屬細菌外，另外報告證明，在蘋果、西瓜、豆類、甘藍菜、花椰 菜、土豆、蘿蔔、蘑菇及甜玉米等，總共也分離出了 30 株屬於 Acinetobacter 屬
6
的細菌 (Beralu et al., 1999)；促進生長發育的功能，在其它研究中也有提到，像 是若將珍珠栗 (Pennisetum glaucum) 的種子播種前先處理過 Acinetobacter 屬 細菌的菌液，生長第 21 天後發現，處理過 Acinetobacter 屬細菌的菌液的珍珠 栗，其地上部及地下部的長度明顯比未處理的珍珠栗長許多，而乾重也有明顯的 差異，此外該研究中也發現將 Acinetobacter 屬細菌與 Fusarium oxysporum 一 起培養時，發現大部分的 Acinetobacter 屬細菌皆能夠抑制 F. oxysporum 生長約 20 % - 30 %，根據這篇文獻也指出，過去研究也報導過 Acinetobacter 屬細菌因 為會產生抗菌物質因而能抑制 Cryphonectria parasitica 、P. capsici 和 Rhizoctonia solani 等真菌以及具有致病能力的細菌像是造成蕃茄青枯病的青枯 病菌 (Ralstonia solanacearum) 等的生長能力 (Farokh et al., 2011)；另外有研究指 出，如果環境中含有低量的酒精，A. baumannii 的抗鹽能力及毒性就會提高，若 將 A. baumannii 培養於含有不同酒精含量的 Luria Bertani 培養基 (LB medium) 並接種於蠟螟，發現隨著培養 A. baumannii 的培養基中酒精含量越高，蠟螟的 存活率會越低，此外，隨著培養基當中酒精含量的提升，A. baumannii 產生 i ndol e -3 -acet i c aci d ( IAA) 的量也會顯 著提高 (C hi ka et al ., 2012 )。
第四節、Cellulosimicrobium屬細菌
Cellulosimicrobium 屬細菌在分類上是屬於放線菌綱 (Actinobacteria)，放線 菌目 (Actinobacteria)，其特性為屬於非抗酸性 (non-acid-fast)、過氧化氫酶呈現 陽性 (catalase-positive)、革蘭氏染色呈現陽性 (gram-positive) 的細菌 (Rowlinson et al., 2006；Schumann et al., 2001)，並且廣泛存在於土壤中 (Lechevalier et al., 1972；Stackebrandt et al., 1997)。Cellulomonas 屬細菌是在 2001 年 時 由 S c h u m a n n 等 人 將 C e l l u l o m o n a s c e l l u l a n s 重 新 定 義 成 Cellulosimicrobium cellulans 所提出的。目前 Cellulosimicrobium 屬中一共包括 了三個種的細菌，分別為 C. cellulans (Schumann et al., 2001)、C. funkei (Brown et
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al., 2006) 和 C. terreum (Yoon et al., 2007)。這類的細菌在土壤中主要特色為能夠 分解有機質、轉化化學物質或有用的物質、可以產生抗生素及細胞壁分解酵素，
而所分泌的分解酵素與抗生素，能夠殺死土壤中的病原菌或著抑制病原菌的活 性，也能藉此達到保護植物的目的 (Bailey and Coffey, 1986)。有文獻指出，在營 養培養基上，菌落會呈現黃色且會長出營養菌絲 (vegetative hyphae) 的 C.
cellulans (Funke et al., 2007)，是一種罕見可以感染人體的病原菌 (Jorge et al., 1999)；此外，C. cellulans 也被發現具有移除鉻和促進辣椒生長的能力，研究指 出，在培養基當中若添加了鉻，隨著 C. cellulans 的菌數量越高，鉻的移除率也 會隨之提高，另外，由於 C. cellulans 具有產生 IAA 的能力，因此在種植辣椒 試驗中也發現，在土壤裡添加 C. cellulans，辣椒生長會比未添加還來的好，而 且若土壤中含有鉻的話，辣椒種植在含有 C. cellulans 的土壤中，其生長情形一 樣比未添加 C. cellulans 還來的好 (Swagata et al., 2009)；除了抑菌、促進植物生 長的功能外，Cellulosimicrobium 屬細菌也具產生酵素的能力，像是木聚糖酶 (xylanase) 和纖維素酶 (cellulase)，因此有學者利用固態發酵，分別找出木聚糖 酶產量最高的最適條件，以及利用產生的纖維素酶應用於原生質體的形成 (Rajashri and Anandrao, 2012；Shailesh et al., 2011)，除了木聚糖酶和纖維素酶，
有研究也首次發現 C. cellulans 具有產生耐高溫的幾丁質酶 (chitinases) 的能 力，其溫度在 30 ℃ 到 90 ℃都能穩定產生具有活性的幾丁質酶，並且在 50 ℃ 到 55 ℃有最大的活性 (Shailesh and Jai, 2010)。
第五節、Sphingomonas 屬細菌
Sphingomonas 在分類上屬於細菌界 (Bacteria)，變型菌門 (Poteobacteria)，α- 變型菌綱 (Alpha Poteobacteria)，鞘氨醇單胞菌目 (Sphingomonadales)，鞘氨醇單 胞菌科 (Sphingomonadaceae)，是一種好氧的革蘭式陰性菌，含有一個極性鞭毛，
其本身主要生理特徵有可降解多環芳烴類化合物以及產生黃色色素，所以之前
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Sphingomonas 屬的菌都被歸類在假單胞菌屬 (Pseudomonas) 或黄桿菌属
(Flavobacterium) 中。直到 1990 年 Yabuuchi 等人的研究中發現，Sphingomonas 屬的菌雖然屬於革蘭氏陰性菌，其細胞膜組成不同於革蘭氏陰性菌特有的脂多 醣，而是鞘多醣及輔酶 Q，因此將它分類出一個新的菌屬 (Yabuuchi et al., 1990)。Sphingomonas 屬細菌廣泛存在土壤、大氣環境中等，此外，Sphingomonas 屬細菌的細胞膜是鞘脂糖而非脂多糖，而鞘脂糖只存在於植物和動物細胞膜內，
因此含有鞘脂糖的 Sphingomonas 屬細菌能夠與植物有效的結合，也能使哺乳動 物的 T 細胞能夠辨識。有研究報告指出，在土壤中生存的 Sphingomonas 屬細 菌除了會在植物根部分泌營養物質供植物吸收外，也會藉由引起植物根部感染方 式入侵植物體內 (胡等，2007；Takeuchi et al., 1995)；另外也有實驗發現，將阿 拉伯芥種子處理 Sphingomonas 屬細菌後，播種並生長第十九天後接種 P.
syringae pv. tomato DC3000，發現與控制組 (阿拉伯芥種子未處理 Sphingomonas 屬細菌) 相比，處理過 Sphingomonas 屬細菌的阿拉伯芥，病徵有顯著的抑制而 菌數量也有明顯的下降 (Gerd et al., 2011)。
第六節、植物誘導抗性與鈣離子關係
環境中充滿了各式各樣的病原菌，常常伺機攻擊植物，而植物為了在環境中 生存下來，除了靠著本身所擁有的天然屏障外，植物也進化產生了不同的誘導性 防禦機制來保護自己免受病原菌的入侵。當植物受到病原菌或著水楊酸的刺激 後，可以提高植物本身對抗病原菌的能力，我們稱為系統獲得抗性 (systemic acquired resistance, SAR) (Sticher et al., 2007)，SAR 主要是透過水楊酸 (salicylic acid, SA) 的累積及防禦調節蛋白 NPR1 (nonexpresser of PR genes) (Dong et al., 2004) 表現病程相關蛋白質 (pathogenesis-related proteins, PRs) 來產生抗病機制 (Ton et al., 2002) 。除了 SAR 以外，有些生長於土壤中的根圈細菌或著非致病 的微生物等，除了能夠促進植物生長發育外，並且同時也能夠誘發植物的免疫
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力，但是不會在根部或著葉部產生明顯的病徵，這樣的誘導產生抗性反應，稱為 誘導系統抗病(induced systemic resistance, ISR) (Pitesre et al., 2002)；此外，植物 的生長，需要許多的營養元素，而鈣就是其中一個重要的營養元素來源，植物主 要藉由根部去吸收土壤中的鈣離子，並經由木質部運輸到體內。鈣離子在植物體 內，除了是細胞壁和細胞膜的組成成分之一外，並且在細胞質內負責傳遞訊息的 訊號分子之一 (Marschner, 1995)。當植物不論是受到生物性逆境或非生物性逆境 時，細胞內的鈣離子濃度增加是最初始的反應之一 (Lecourieux et al., 2006 ; Ma and Berkowitz, 2007)。另外當植物受到病原體入侵時，鈣離子的湧入會活化植物 的防禦反應，其中包括氧化爆發和過敏性細胞死亡 (Scheed, 1998 ; Grant et al., 2000)。目前在研究中也有指出，阿拉伯芥體內也找出了兩個類似鈣結合蛋白 (Calmodulin-binding proteins, CBPs) 的蛋白，分別為 SAR Deficient 1 和 CBP60g，屬於一個新的家族，並且會觸發水楊酸的合成，在該篇研究中指出，
增量表現阿拉伯芥體內的 CBP60g，會使體內的 SA 累積的量會增加，並且對 於 P. syringae 的抗性有提升趨勢 (Wang et al., 2012)。過去有研究指出使豇豆感 染銹病，則在感染部位胞內鈣離子濃度提高的時間有延長的現象 (Xu and Heath, 1998)。除此之外，對植物細胞施用 Ca2+ 螫合劑，或著 Ca2+ 通道阻斷劑或 CaM 拮抗劑，都緩解了氧化爆發和過敏性細胞死亡的程度 (Blume et al., 2000; Grant et al., 2000; Ma et al., 2008)。藉由上述原因我們可以知道引發此防禦機制的其中一 種方式為調控植物細胞內的鈣離子濃度，當植物細胞的鈣離子濃度升高時，負責 偵測鈣離子濃度變化的蛋白質將引發一連串反應來啟動防禦機制，因此也有學者 以番茄為模式植物進行研究，因為作者之前的研究指出，當具抗性的番茄植株引 起 過 敏 性 反 應 時 ， 發 現 其 基 因 產 物 為 調 鈣 素 ( c a l m o d u l i n ) 的 A P R 1 3 4 基因表現有上升的趨勢，由於鈣又與抗病相關，因此作者進一步去進行研究，將 APR134 基因沉默後並進行接種，發現 P. syringae pv. tomato 的菌數量有明顯的 提高 (Chiasson et al., 2005)。
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第七節、研究目的
前人研究指出荖葉的病害主要以角斑病、炭疽病、疫病等為主，然而有少數 伺機性感染病原菌可以在特定狀況下感染荖葉並且尚未被報導出來，因此本實驗 目的為針對台東地區荖葉伺機性感染病原菌進行分離及鑑定，並觀察致病能力及 生長特性；另外研究指出鈣離子在植物體內防禦性系統扮演一個重要角色，故進 一步利用碳酸鈣及奈米鈣作為防治資材，觀察是否能夠增加荖葉對於伺機性感染 病原菌的抗病能力。
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第二章、材料與方法
第一節、調查樣區
本研究針對 2010 年 7 月到 2011 年 2 月 (共 7 個月) 進行荖葉病害調 查，調查一共分成三季，分別為第一季：2010 年 7 月到 9 月，第二季：2010 年 11 月到 12 月，第三季：2011 年 1 月到 2 月。調查地點位於台東地區八個 (A - H) 大樣區荖葉園，每個大樣區裡面含有五個小樣區，總計四十個樣區；樣區 A 位於馬亨亨大道上，以黑森林公園為中心，半徑兩公里內的五個樣區，樣區 B 位 於中華路二段上，以 7 - 11 為中心 (中華路 2 段 279 號)，半徑兩公里內的五 個樣區，樣區 C 位於日光橋，以日光橋為中心，半徑兩公里內五個樣區，樣區 D 位於正氣北路上，以台東專科學校為中心，半徑兩公里內的五個樣區，樣區 E 位於豐原橋，以豐原橋下為中心，半徑兩公里內的五個樣區，樣區 F 位於卑南 堤防，以中華大橋往卑南提防 3 公里處為中心，半徑兩公里內的五個樣區，樣 區 G 位於四川路，以四川路 2 段 451 巷為中心，半徑兩公里內的五個樣區，
樣區 H 位於知本路，以知本路 2 段 571 巷為中心，半徑兩公里內的五個樣區 (附錄 1)。
第二節、實驗材料 一、 植物材料
接種試驗荖葉 (Piper betle ) 採自樣區 C，該園區位於台東市綏遠路二段 147 巷 31 弄 5 號。該樣區帄均生長約十年，總共佔地約五公頃，帄均土溫為 25.0 ℃，帄均氣溫為 27.4 ℃，帄均光照為 4129.4 lux，選用帄均葉長約 5 公分 及葉寬約 3 公分做為接種實驗材料。
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二、 菌株材料
基因選殖使用菌株為 E. coli DH5α (ECOS, Taiwan)。將 E. coli DH5α 培養於 (37 ℃，100 rpm) LB 培養基 (St-Bio Taiwan)。polymerase chain reaction (PCR) 鑑 定使用的對照組菌株為 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (XCV) (由台灣甜 椒葉片分離之病源株)。將 XCV 培養在 (28 ℃，100 rpm) Nutrient Broth 培養基 (NB medium) (St-Bio Taiwan)。接種實驗使用分離株 J3-L2S2 是由樣區 C 分離 而得、Q1-L1S2 是由樣區 D 分離而得、Xan3-L1S1 是由樣區 F 分離而得、
3-2a-L2S1 及 4-2a-L2S2 是由樣區 H 分離而得。將分離株培養在 (28 ℃，100 rpm) NB 培養基 (附錄 4)。
三、 PCR 使用之引子
PCR 鑑定是使用 Xc-lip-F2 (5’-TAT GTG ATG GTG CCG ACC ATT C-3’) 及 Xc-lip-R2 (5’-GGA CTT CGC GGT CCA CGT CGT AGG C-3’) (Blossom, Taiwan)，該組引子可針對 estA 基因擴增出約 777 bp 的核酸片段。細菌 16s rRNA 鑑定是使用 U3 (5’-AGT GCC AGC AGC CGC GGT A-3’)、U4 (5’-AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC-3’) 及 U5 (5-’TCA AAK GAA TTG ACG GGG GC-3) (Blossom, Taiwan) 該組引子可針對細菌 16s rRNA 擴增出約 500 bp (U3+U4) 及 1 k (U4+U5) 的核酸片段。選殖鑑定引子是使用 M13-F (5’-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3’) 及 M13-R (5’- CAG TAT CGA CAA AGG ACA CAC T-3’) (Blossom, Taiwan)，該組引子可針對選殖片段鑑定選殖有無成功 (附錄 6)。
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第三節、 實驗方法 一、田間調查
調查方法為選取園區四個角落及中央共 5 個點做病害調查，每株荖葉約調 查 15 片葉片，每個園區約調查 20 棵荖葉。病害級數分類法：零級病害：植株 沒有任何葉片有病徵；一級病害：植株葉子有 1 % - 20 % 被感染；二級病害：
植株葉子有 21 % - 50 % 被感染；三級病害：植株葉子有 51 % - 80 % 被感染；
四 級 病 害 ： 整 顆 植 株 的 葉 子 有 8 0 % 以 上 被 感 染 或 死 亡 ( 附 錄 2 ) 。
二、 病原株分離及保存
自荖葉園中取得罹病葉片，噴灑 75 % 酒精進行表面消毒 10 秒，置於無菌 培箱烘乾 3 分鐘，利用無菌手術刀切下葉片病斑面積 0.04 (0.2 x 0.2) 帄方公分 (含有 1/3 感染區域及 2/3 未感染區域)，將切下組織塊於 100 μl 無菌水中切碎，
利用無菌玻璃珠 (直徑約 0.3 x 0.3 公分)塗抹在 NB 培養基上，置於 28 ℃培養 箱中，培養 2 - 3 天，待菌落長出後，放至 4 ℃以備後續實驗，另外以無菌牙籤 挑取單一菌落，培養在含有600 μl NB 培養液中，置於 28 ℃，100 rpm 培養箱中 培養，待 O.D600 達到約 0.6 後，加入 300 μl 甘油 (50 %)，移入 -80 ℃之冷凍庫 保存。
三、 培養基鑑定
將分離株培養在 NB (每公升水中含 8 克 NB 粉末 (St-Bio, Taiwan)) 及 YDC ((yeast extract dextrose CaCO3) (每公升水中含 10 克酵母萃取物 (yeast extract) (Conda, Spain)，20 克葡萄糖，20 克碳酸鈣 (calcium carbonate) (聯工化 學廠股份有限公司, Taiwan)) 培養基，放置於 28 ℃培養箱 2 - 3 天，觀察菌落
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色素累積狀況，若分離株菌落呈現黃色，則記"+"，若菌落外觀呈現白色則為"-"；
分離株培養在 Xan-D (將基礎培養基 (每 0.5 公升水中含有 10 克大豆腖 (soytone) (Us-Biology, US)，10 克碳酸鉀 (potassium bromide) (島久藥品株式會社, 日本)， 10 ml 界面活性劑 (tween 80) (和光純藥工業株式會社, 日本 )，15 克 洋菜 (agar) (Bio-Basc, Canda)) 及牛奶培養基 (每 0.5 公升水中含有 10 克脫脂 奶粉 (skim milk) (香港商遠東恆天然乳品有限公司, 台灣) 經由高溫高壓 (121
℃，1.25 大氣壓) 滅菌後均勻混合，待溫度降到約 50 - 60 ℃，加入 24 μg 溴麝 香草酚藍 (bromothymol blue) (Sigma, USA) 均勻混合後倒置於培養皿等待冷卻 凝固) 培養基上，放置於 28 ℃培養箱 5 - 6 天，若菌落外觀呈現藍綠色且周圍 產生透明區(clear zone) 則記"+/+"，若菌落外觀呈現藍綠色，但未產生透明區，
則記"+/-"，若未產生藍綠色菌落，但周圍產生透明區，記為"-/+"，若未產生藍綠 色菌落也未產生透明區，則記為"-/-"，若菌株無法於培養基上生長則記為"ND"。
第四節、分離株鑑定 一、分離株 DNA 抽取
分離株基因組 DNA 的抽取是利用基因組 DNA 純化試劑組 (Genomic DNA Purification Kit) (Bio Kit, Taiwan)。將分離株培養在 NB 培養基，置於 28
℃，100 rpm 培養箱約 16 小時後，待菌量達到 103 - 105 CFU/ml，取 1 ml (103 CFU/ml) 分離株菌液以 4 ℃進行離心 (9,000 g) 2 分鐘，取掉上清液並加入 200 μl 裂解液 (Lysis Buffer) 使細胞裂解，再加入 20 μl 蛋白酶 K (Proteinase K) 均 勻混合，放置於 56 ℃水浴槽 3 小時以上，直到完全裂解，其中每 20 分鐘上 下搖晃，使之均勻混合。加入 200 μl 結合緩衝液 (Binding Buffer) 均勻混合，
移至 70 ℃水浴槽 15 分鐘。後加入 200 μl 酒精均勻混合後，將混合液全部移 至過濾管柱中後以 4 ℃離心 (11,600 g) 1 分鐘。丟過濾管柱廢液再加入 600 μl 清洗緩衝液 (Wash buffer)，此動作重複兩次。濾液倒掉後，再進行 4 ℃離心
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(11,600 g) 1 分鐘，去除多餘酒精。將濾膜移至於新的 1.5 ml 離心管中，加入 50 - 100 μl 洗脫緩衝液 (Elution buffer)，靜置 1 - 2 分鐘後以 4 ℃離心 (11,600 g) 1 分鐘。所收集的濾液即含有細菌基因組 DNA。將所得 DNA 取 5 μl 與 95 μl 無 菌水均勻混合後，測定樣品在O.D260 及O.D280 吸光值，利用O.D260/ O.D280 x 稀釋倍數，計算出 DNA 濃度，後移至 -20 ℃保存備用。
二、 聚合酶連鎖反應 (PCR) 鑑定分離株
PCR 反應條件如下：3 μg 細菌基因組 DNA，1 μl (10 mM) 的脫氧核醣核 酸 (deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 混合液 (Violet bioscience, Taiwan)，3 μl (10 倍) 的 PCR 緩衝溶液 (10x PCR buffer) (Violet bioscience, Taiwan)，1 μl (5 μM) 的 Xc-lip-F2 引子及 1 μl (5 μM) 的 Xc-lip-R2 引子，0.05 μl 的 TaqPlus precisionTM聚合酶酵素 (Violet Bioscience, Taiwan)，最後添加無菌水，使其最終 體積為 30 μl。PCR 反應器的設定如下：預熱反應為 94 ℃加熱 10 分鐘，循環 反應為 94 ℃，30 秒；54 ℃，30 秒；72 ℃，30 秒。此條件循環 30 次，最 後再以 72 ℃反應 10 分鐘，後將產物保存於 -20 ℃備用。
三、 PCR 產物純化 (PCR clean up)
PCR 產物純化使用清洗/膠萃取套件組 (Clean/Gel extraction kit) (Bio Kit, Taiwan)。將 PCR 產物移至新的 1.5 ml 離心管後，加入與產物等體積的結合緩 衝液 (Binding buffer) 均勻混合，將混合液移至過濾管柱中進行4 ℃離心 (11,600 g) 1 分鐘，丟掉廢棄濾液後，加入 600 μl 清洗緩衝液 (Wash buffer) 後以 4 ℃ 離心 (11,600 g) 1 分鐘，丟掉廢棄濾液後，重複此動作一次，再以 4 ℃離心 (11,600 g) 3 分鐘去除多餘酒精，將濾膜移至於新的 1.5 ml 離心管中，加入 50 μl 洗脫緩衝液 (Elution buffer) ，靜置 1-2 分鐘後以 4 ℃離心(11,600 g) 1 分鐘，所收集的濾液即為純化完的 PCR 產物
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四、 DNA 電泳
將所得到 PCR 產物注入於由 0.5 倍的 Tris-acetate-EDTA (TAE) 緩衝溶 液與洋菜凝膠粉 (agarose-LE 1200) (Taiwan Agar-Agar, Taiwan) 配製的 1 % 洋 菜凝膠。以 16.67 v cm-1條件進行電泳分離。待 DNA 電泳分離後，取出膠體並 浸泡於含 0.5 μg mL-1之溴化乙錠 (ethidium bromide, EtBr) (Zymeset Biology, Taiwan) 溶液 10 分鐘，再泡至水中進行脫色 10 分鐘，最後以電泳膠數位影 像系統拍攝 (DGIS-9, Top Bio, Taiwan)。
五、 勝任細胞製備 (Competent cell preparation)
於 LB 培養基上挑取 E. coli DH5α 單一菌落培養在 0.6 ml LB 培養液於 37 ℃，100 rpm 培養約 16 小時。然後將 0.6 ml 菌液放大培養至 50 ml LB 培 養基於 37 ℃，100 rpm 培養，等到菌液 O.D600 約 0 .6 後，將之放置於冰上 15 分鐘。將 50 ml 菌液 (108 CFU/ml) 進行 4 ℃離心 (3,000 g) 10 分鐘，之後利用 無菌的冰氯化鈣 (0.1 M) 懸浮菌液並緩慢均勻混合 (不可劇烈搖盪)。置於冰上 15 分鐘後進行 4 ℃離心 (3,000 g) 10 分鐘，去除上清液後後以無菌的冰氯化鈣 ( 0 . 1 M ) 懸 浮 菌 液 ， 勝 任 細 胞 即 備 製 完 成 ， 後 放 於 - 8 0 ℃ 保 存 備 用 。
六、TA-Cloning
(一) 接合作用 (Ligation)
使用 yT&A cloning kits (Yeastern Biotech Co., Taiwan)，將經純化過後 PCR 產物取 3 μg 與 kits 中之 2 μl (25 ng/μl) yT&A 載體 (yT&A cloning vector)，1 μl 接合緩衝液 A (Ligation buffer A)、1 μl 接合緩衝液 B (Ligation buffer B) 及 1 μl (2 unit/μl) T4 DNA 接合酶 (T4 DNA ligase)，最後添加無菌水，使其最終體積 為 10 μl，於 PCR 反應器中進行接合作用 (22 ℃，15分鐘)。
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(二) 轉形作用 (Transformation)
取勝任細胞 80 μl (108 CFU/ml) 及上述接合完後之樣品 4 μl 均勻混合，置 於冰上 30 分鐘後，於 42 ℃水浴 90 秒，利用熱使細菌細胞膜穿孔而使細菌 DNA 片段得以進入。於冰上冷卻 2 分鐘後，取 100 μl 菌液塗抹於含有 50 ppm 氨苄西林 (ampicillin) (Sigma, USA) 的 LB 培養基上，於 37 ℃培養隔夜。
柒、質體 DNA (plasmid DNA) 抽取
利用微量質體套件組 (GeneluteTM Plasmid Miniprep Kits) 來抽取細菌質體 DNA。將細菌培養在含有 50 ppm Amp 的 50 ml LB 培養液，放置於 37 ℃，100 rpm 培養箱培養中，取 1 ml 菌液 (105 CFU/ml) 以 4 ℃離心 (12,000 g) 1 分鐘 後，取出培養液丟棄，加入 200 μl 懸浮液 (Resuspension solution) 懸浮細菌。
再加入 200 μl 裂解液 (Lysis solution) 緩慢上下搖晃均勻混合。加入 350 μl 結 合溶液 (Neutralization/binding solution) 以 4 ℃離心 (12,000 g) 10 分鐘。將過濾 管柱加入 500 μl 管柱預備溶液 (Column Preparation Solution) 離心 1 分鐘，丟 棄廢液後，將前述離心完的混合液移至過濾管柱中以 4 ℃離心 (12,000 g) 1 分 鐘。丟棄廢液後，加入 500 μl 清洗溶液 (Optional Wash solution) 以 4 ℃離心 (12,000 g) 1 分鐘。丟棄廢液後，加入 750 μl 清洗溶液 (Wash Solution) 以 4 ℃ 離心 (12,000 g) 1 分鐘。丟棄廢液後，以 4 ℃離心 (12,000 g) 2 分鐘，去除多餘 酒精。將濾膜移至新的 1.5 ml 離心管中，加入 50 - 100 μl 洗脫緩衝液 (Elution buffer)，靜置 1 - 2 分鐘後離心 (12,000 g) 1 分鐘。所收集的濾液即含有 細菌質體 DNA，放置於 -20 ℃保存備用。
捌、限制酶剪切
將 1 μg 質體 DNA 以Hind III處理，反應的總體積為 30 μl，將下列試劑加 入 1.5 ml 微量離心管中： 1 μg 的質體 DNA， 3 μl 的 10 倍緩衝液 H (10x
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buffer H)， 1 μl 的 Hind IIІ (10 U / μl)，補水至 30 μl。於 37 ℃水浴槽作用兩小 時後，放置於 -20 ℃保存備用。
玖、DNA定序
將分離株基因體 DNA (Genomic DNA) 經 PCR 放大標的片段確認後，將勝 任細胞帶有插入標的 DNA 與引子 M13F 及引子 M13R 送交基龍米克斯生物 科 技 股 份 有 限 公 司 代 為 定 序 ， 並 將 所 得 之 序 列 至 N a t i o n a l C e n t e r f o r Biotechnology Information (NCBI) 網站，利用 BLAST 系統進行比對並判斷身份
第四節、病原性之測定及接種 一、葉部接種：
從 NB 培養基上挑取單一菌落於 600 μl NB 培養液(28 ℃，100 rpm ) 培養 約 16 小時，待 OD600約 0.6 左右，將 600 μl 菌液放大培養於 50 ml NB 培養液 至 (28 ℃，100 rpm ) OD600 0.6 - 1.0 ，將菌液稀釋至 107 CFU/ml 備用。將 5 - 8 片荖葉葉片 (葉長約 7 公分，葉寬約 4 公分) 浸泡於 1 L 上述細菌培養液置於密 閉空間以馬達進行減壓抽氣 (每 5 分鐘以 700 mmHg 壓力間歇抽氣 3 次並靜 置 20 分鐘，上述處理連續重複 3 次)。抽氣結束後，將葉片取出置於 12 x 12 公分大的方形培養皿中，靜置於 26 ℃並於第二、第五及第八天拍照記錄病徵發 展狀況。病原性強弱定義以第八天為準，在接種第八天時，若病徵佔所有葉片的 50 %以上，以 L1 表示，若病徵佔所有葉片的 50 % 以下，則以 L2 表示。
二、莖部接種：
從 NB 培養基上挑取單一菌落於 600 μl NB 培養液(28 ℃，100 rpm ) 培養 約 16 小時，待 OD600約 0.6 左右，將 600 μl 菌液放大培養於 50 ml NB 培養
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液至 (28 ℃，100 rpm ) OD600 0.6 - 1.0 ，將菌液稀釋至 107 CFU/ml 備用。將荖 葉側生的藤莖部，每三公分切成一小段，將上述切斷荖葉莖部浸泡上述 1 L 菌 液，以上述同樣方式進行接種。抽氣結束後，將荖葉莖部置於 9 x 9 公分大的圓 形培養皿中，靜置於 26 ℃並於第二、第五及第八天拍照記錄病徵發展狀況。病 原性強弱定義以第八天為準，在接種第八天時，若病徵佔所有莖部的 50 % 以 上，以 S1 表示，若病徵佔所有莖部的 50 % 以下，則以 S2 表示。
第五節、病原菌生長溫度測試 一、吸光值與菌數相關試驗
將分離株培養在 50 ml NB 培養液至 (28 ℃，100 rpm ) OD600 0.6 - 1.2，取 菌液以無菌水進行兩倍稀釋，並記錄 OD600 吸光值，直到吸光值趨近於 0，另 外將菌液以無菌水進行十倍系列稀釋並塗盤，於28 ℃培養兩天後，計算細菌菌 落形成單位 (colony forming unit, CFU/ml)，依不同稀釋度之 OD600 吸光值及菌 數，製作標準曲線 (Standard curve)，以定吸光值與菌數之關係，將來測定菌數 時，只需測定其吸光值，再以內插法，即可求出相對應之菌數。
二、測試不同溫度下對分離株生長影響
將分離株培養在 50 ml (28 ℃，100 rpm) NB 培養液至 OD600 0.6 - 1.2，取 20 μl (103 CFU/ml) 菌液加入 50 ml (100 rpm) NB 培養液分別置於 28 ℃培養箱 中，每隔 2 小時取出 1,000 μl 菌液以分光光度計測量 O.D600 吸光值，利用上 述標準曲線換算菌數並繪出生長曲線。
三、測試不同碳素源對分離中生長影響
將分離株培養在 50 ml (28 ℃，100 rpm) NB 培養液至 OD600 0.6 - 1.2，取 20
20
μl (103 CFU/ml) 菌液加入 50 ml 分別含有不同濃度之 0 %、0.4 % 及 1.6 % 葡 萄糖 YPGA (Yeast-Peptone-Glucose-Agar) 培養液，放置 28 ℃，100 rpm 培養箱 進行培養。每隔 2 小時取出 1,000 μl 菌液以分光光度計測量 O.D600 吸光值，
利用上述標準曲線換算菌數並繪出生長曲線；另外分別以蔗糖、果糖、木糖及甘 露糖取代 YPGA 培養基中葡萄糖，放置 28 ℃，100 rpm 培養箱進行培養。每 隔 2 小時取出 1,000 μl 菌液以分光光度計測量 O.D600 吸光值，利用上述標準 曲線換算菌數並繪出生長曲線
第六節、防治試驗
將分離株培養在 50 ml NB 培養液至 (28 ℃, 100 rpm ) O.D 600 0.6 - 1.0 ，將 菌液稀釋至 107 CFU/ml 備用。將荖葉葉片分別浸泡於磷酸鹽緩衝液 (phosphate buffer) (pH=7.0)、碳酸鈣 (pH=7.41) 奈米鈣 (pH=7.44) 溶液 60 分鐘 (每 10 分 鐘均勻攪拌 1 次共 3 次，後 30 鐘靜置)，將處理後葉片接種上述細菌懸浮液 (每 5 分鐘以 700 mmHg 壓力間歇抽氣 3 次並靜置 20 分鐘，上述處理連續重 複 3 次)。接種結束後，將荖葉置於 12 x 12 公分大的方形培養皿中，靜置於 26
℃並於第二、第五及第八天拍照記錄病徵發展狀況。
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第三章、結果
第一節、臺東荖葉園病害調查結果
植物病害在不同的季節會有不同程度的差異，為了想要知道不同季節與病害 發展的相關性，所以本研究針分成三季去進行病害及週遭環境調查。結果顯示，
若以樣區來做區分，樣區 B、C 及 H 在三季帄均發病率皆為最低 (10 % - 15
%)，其帄均土溫分別為 26.3 ℃、24.8 ℃及 27.1℃，帄均氣溫分別為 28.2 ℃、
27.0 ℃ 及 28.8 ℃，帄均光強度為 8,677.2 lux、9,160.5 lux 及 9,979.0 lux；樣區 F 在三季帄均發病率皆為最高 (20 % - 26 %)，帄均土溫、帄均氣溫及帄均光強度 分別為 25.7 ℃、27.4 ℃及 4,129.4 lux；樣區 D 及 G 則只有在第三季帄均發病 率高 (23 % - 26 %)，在第一季及第二季則低 (14 %)，帄均土溫分別 27.0 ℃ 及 25.8 ℃，帄均氣溫分別為 29.0 ℃ 及 28.1 ℃，帄均光強度為 7,947.9 lux 及 7,888.5 lux；樣區 A 及 D 則在第一季及第三季時帄均發病率偏中高 (14 % - 26
%)，在第二季時病害皆低 (12 % - 14 %)，帄均土溫分別 26.0 ℃ 及 27.0 ℃，帄 均氣溫分別為 27.7 ℃ 及 29.0 ℃，帄均光強度為 8,356.5 lux 及 7,947.9 lux。若 以季來做區分，第三季的帄均發病率為最高 (20.6%)，第一季次之 (16.4%)，第 二季最低 (14.6 %) (表一)。
第二節、接種測試 一、分離株在荖葉葉片及莖部接種測試
在本研究中，從病害田分得許多分離株，為了要測試分離株在帅葉及莖部上 造成的致病能力差異，將分離株分別接種於荖葉葉部及莖部，觀察致病能力是否 有差異。結果顯示，葉片方面，分離株 Q1-L1S2 及 Xan3-L1S1 在第五天發病 程度就已經達到 90 %，到了第八天發病程度則達到 100 %；而分離株 3-2a-L2S2 及 J3-L2S2 不論是在第五天還是第八天，發病程度也僅約 10 % (圖一 A)；莖
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部方面，分離株 Xan3-L1S1 及 3-2a-L2S1，在第八天時，發病程度已經達到 100
%，而分離株 Q1-L1S2 及 J3-L2S2 即使到了第八天，發病程度也僅約 30 % (圖 一 B)。根據上述結果，我們把分離株 Xan3 稱 Xan3-L1S1-L1S1，分離株 Q1 稱 為 Q 1 - L 1 S 2 - L 1 S 2 ， 而 分 離 株 3 - 2 a 稱 為 3 - 2 a - L 2 S 1 - L 2 S 1 ， 分 離 株 J3 以 J3-L2S2 命名。
二、不同年齡荖葉葉片對分離株發病能力測試
隨著植物生長及發育，植物的內部及外表結構會有改變，導致感染上會有程 度不同的差異，為了想要知道分離株在荖葉的帅葉 (半徑 5 公分以下) 及老葉 (半徑 7.5 公分以上) 所造成的致病能力是否會有差異，於是將帅葉及老葉分別 進行接種，觀察感染情形是否一致。結果顯示，在第二天時，不論是帅葉及老葉，
均無明顯的病徵產生，第二天過後，分離株開始沿著葉尖及葉緣開始感染，造成 葉緣黑褐色焦枯，逐漸向內擴大，到了第五天，帅葉整片葉子已經全部呈現黑褐 色，感染程度達到 100 %，而老葉仍然沒有任何病徵發展，這樣的情形持續到了 第八天，老葉依舊沒有任何病徵產生。綜合以上結果顯示，分離株 Xan3-L1S1 對於帅葉有較強的感染力，但是對於成熟荖葉則無法感染 (圖二)，而之後進行 接種的葉片都選取年輕的老葉進行實驗。
第三節、病原菌鑑定 一、利用培養基鑑定分離株
在本研究中，分離了許多分離株，為了想了解分離株在培養基上面產生色素 的能力，因此使用了 NB、YDC 及 Xan-D 培養基來當做材料。結果顯示，在 NB 及 YDC 培養基上，Q1-L1S2 及 3-2a-L2S1 能夠產生黃色色素累積，J3-L2S2 及 Xan3-L1S1 能夠產生白色色素累積；接著進一步使用 Xan-D 鑑別性培養基鑑定
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後，分離株 Xan3-L1S1 既不會產生藍綠色菌落，也不具有分解界面活性劑的能 力，另外分離株 J3-L2S2、Q1-L1S2 及 3-2a-L2S1 無法於鑑別性培養基上生長 (表二)。
二、利用 estA 專一性引子進行 PCR 來檢測測分離株
在過去研究顯示，estA 能夠產生脂肪酶 (lipase) 和酯酶 (esterase)，所以與 細胞壁分解有關，故本實驗使用 estA 專一性引子來測試 4 株分離株是否具有 estA 基因。結果顯示，XCV 和分離株 Xan3-L1S1 及 J3-L2S2 在 777 bp 有產 生增幅的反應，但是分離株 Xan3-L1S1 及 J3-L2S2 除了在 777 bp 產生增幅片 段外，在 1 k 位置左右，也有出現增幅的情況，而分離株 3-2a-L1S1 及 Q1-L1S2 則無法利用該引子產生增幅反應 (圖三)。
三、定序與親緣關係
為了想要比對 16s rRNA 相似性，所以利用 U3、U4 及 U5 引子進行 16s rRNA 鑑定，因為該組引子分別可以針對細菌 16s rRNA 在 500 bp (U3+U4) 及 1 k (U4+U5) 片段產生增幅反應，經由 TA-cloning 後，得到 40 個菌落，將其 中 3 個菌落至基龍米克斯生技公司進行解序。將所解出的序列至 NCBI 比對之 結果顯示，送交基龍米克斯定序的 3 個樣品中，分離株 Q1-L1S2 的 16s rRNA 與放線菌中之 C. cellulans (纖維化纖維菌) 16s rRNA中的第 835 到 1315 bp 有 99 % (480/481) 之相似度，並且位於 central domain 和 3’major domain，故推 論 Q1-L1S2 為 C. cellulans；分離株 Xan3-L1S1 的 16s rRNA 與變形菌中之 A.
baumannii 的 16s rRNA 中的第 853 到 1,332 bp 有 100 % (480/480) 之相似 度，並且位於 central domain 和 3’major domain，故推論 Xan3-L1S1 為 A.
baumannii；分離株 3-2a-L2S2 的 16s rRNA 與放線菌中之 Sphingomonas sp. (纖 維化纖維菌) 16s rRNA中的第 485 到 1325 bp 有 99 % (875/876) 之相似度，並
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且位於 5’ domain 和 central domain，故推論 Q1-L1S2 為 Sphingomonas sp.
第四節、生長培養特性 一、病原分離株在不同溫度下生長影響
病原細菌的生長會受到溫度的改變而有所影響，為了想要了解不同溫度對分 離株生長是否會有影響，於是將分離株培養在 28 ℃ (正常溫度) 及 40 ℃ (高溫環 境)，100 rpm 培養箱中，觀察其生長狀況。結果顯示，在 28 ℃環境下，過了 12 小時後，分離株 Xan3-L1S1 及 4-2a-L2S2 OD600 已經達到 0.2，並且都在約 14 - 16 小時後 OD600 已經上升到 0.6，而 4-2a-L2S2 在生長第 28 小時後 OD600 達到 1.7，Xan3-L1S1 則在生長第 34 個小時後 OD600 達到 1.8；若將溫度提升 到 40 ℃，除了分離株 4-2a-L2S2 無法正常生長外，分離株 Xan3-L1S1 仍能正 常生長，此外 Xan3-L1S1 在 40 ℃環境下生長速度較 28 ℃環境下快，
Xan3-L1S1 約在培養 8 - 10 小時 OD600 達到 0.2，並且在培養約第 14 小時 OD600 達到 0.8，在培養約 26 小時 OD600 上升 1.8。綜合以上結果顯示，分離 株 Xan3-L1S1 不論是在 28 ℃或 40 ℃環境下，生長速率並沒有太大差異，我 們推論該分離株為耐高溫菌，分離株 4-2a-L2S2 在 28 ℃環境下能夠正常生長，
但移到 40 ℃環境下則無法長，我們則推論該分離株為不耐高菌 (圖七 ) 。
二、葡萄糖含量對病原分離株生長影響
外源性碳素源的添加，會影響分離株生長，為了瞭解培養基中，不同濃度的 葡萄糖添加，對分離株生長是否會有影響，所以利用 YPGA 當作基礎培養基，
分別添加 0 %、0.4 % (正常濃度)、1.6 % 三種濃度葡萄糖進行測試，觀察是否會 影響分離株生長。結果顯示，分離株 Xan3-L1S1 在培養基中不論是含有上述三 種濃度葡萄糖時，皆都約在培養第 10 小時 OD600 達到 0.2，第 16 小時 OD600
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達到 0.8，第 30 小時 OD600 達到 1.9。菌數量方面則都沒有太大的差異 (圖八 A)。分離株 Q1-L1S2 在培養基中未含有葡萄糖時，約在培養第 66 小時 OD600
達到 0.2，第 72 小時 OD600 達到 0.7，第 94 小時生長 OD600 達到 2.2；而當 培養基含有 0.4 %葡萄糖時，約在培養 68 小時 OD600 達到 0.2，第 72 小時 OD600 達到 0.5，第 94 小時 OD600 達到 1.0；當培養基含有 1.6 %葡萄糖時，
約在培養 70 小時 OD600 達到 0.1，第 76 小時 OD600 達到 0.3，第 86 小時 OD600 達到 0.5。菌數量方面，在培養基中不添加任何葡萄糖時，不管在任何時 間點，菌數量含量皆為最高，而在培養基中添加葡萄糖後，菌數量會隨著葡萄糖 的含量增加而呈現下降趨勢 (圖八 B)。分離株 3-2a-L2S1 在培養基中未含有葡 萄糖時，無法正常生長；而當培養基含有 0.4 %葡萄糖時，約在培養 44 小時 OD600 達到 0.2，第 52 小時 OD600 達到 0.8，第 64 小時 OD600 達到 1.9；當 培養基含有 1.6 %葡萄糖時，約在培養 66 小時 OD600 達到 0.1，第 72 小時 OD600 達到 0.7，第 86 小時 OD600 達到 1.9。菌數量方面，在培養基中不添加 任何葡萄糖時，分離株無法生長，而在培養基中添加 0.4 %葡萄糖時，不管在任 何時間點，菌數的含量皆為最高，當培養基中葡萄糖濃度提高後，菌數量會隨著 葡萄糖的含量增加而呈現下降趨勢 (圖八 C)。綜合以上結果顯示，分離株 Q1-L1S2 在 YPGA 培養基中對於葡萄糖的需求並非是必需，高濃度的葡萄糖反 而會抑制生長，而分離株 Xan3-L1S1 在 YPGA 培養基中不論是添加上述三種 濃度的葡萄糖，對於生長皆無任何影響，分離株 3-2a-L2S1 在 YPGA 培養基中 對於葡萄糖的需求是必需的，環境中若無葡萄糖則無法生長，但若在 YPGA 培 養基中添加高濃度葡萄糖，反而會降低 3-2a-L2S1 生長速度。
三、不同碳素源對病原分離株生長影響
為了想要知道不同的碳素源添加，對分離株生長是否會有影響，所以利用 YPGA 當作基礎培養基，分別利用一種單醣 (葡萄糖) 及四種雙糖 (果糖、蔗
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糖、甘露糖及木糖) 做為碳素源來源，觀察分離株生長狀況。結果顯示，分離株 Xan3-L1S1 在培養基中除了添加木糖會抑制生長外，其餘四種糖類都能正常生 長，皆約在培養第 14 小時 OD600 達到 0.2，第 18 小時 OD600 達到 0.7，第 30 小時 OD600 達到 0.8 (圖九 A)。分離株 Q1-L1S2 在培養基中添加葡萄糖做為碳 素源來源時，在培養第 48 小時 OD600 達到 0.1，第 54 小時 OD600 達到 0.6，
第 62 小時 OD600 達到 1.4；而當碳素源來源改成果糖時，在培養 42 小時 OD600
達到 0.5，第 50 小時 OD600 達到 0.9，第 74 小時 OD600 達到 2.0；當碳素源 來源改成甘露糖時，在培養 60 小時 OD600 達到 0.4，第 62 小時 OD600 達到 0.6，第 74 小時 OD600 達到 1.0；當碳素源來源改成蔗糖時，在培養 26 小時 OD600 達到 0.4，第 30 小時 OD600 達到 0.7，第 58 小時 OD600 達到 2.0；而 當碳素源來源改成木糖時，在培養 72 小時 OD600 達到 0.1，第 74 小時 OD600 達到 0.2，第 99 小時 OD600 達到 0.5 (圖九 B)。分離株 3-2a-L2S1 在培養基 中添加葡萄糖糖做為碳素原來源時，生長速度會較其餘添加四種糖快，在培養第 32 小時 OD600 達到 0.1，第 40 小時 OD600 達到 0.7，第 48 小時 OD600 達到 1.7，而添加其餘四種糖於培養基中，皆約在培養第 42 小時 OD600 達到 0.2，
第 50 小時 OD600 達到 1.0，第 62 小時 OD600 達到 1.8 (圖九 C)。綜合以上結 果顯示，在 YPGA 培養基中，木糖的添加對於葉部強病原性分離株 Q1-L1S2 及 Xan3-L1S1 有抑制的趨勢，分別能讓前者生長速度降低及菌數降低，並且會完 全抑制後者生長；分離株 3-2a-L2S 1 不論是 在 YP GA 培養基中 添加上 述五種碳素源，皆不會影響生長。
第五節、防治試驗
一、碳酸鈣及奈米鈣對於分離株在葉部引起病徵能力的影響
鈣離子在植物中扮演重要訊息傳遞分子，且又可以誘導植物體內抗性基因而 產生抗性反應，為了想要知道鈣離子的添加，對於分離株在葉部的致病能力會不
