疫苗佐劑對於血液細胞分化影響之研究

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國立臺灣大學醫學院藥學研究所碩士論文

School of Pharmacy College of Medicine

National Taiwan University Master Thesis

疫苗佐劑對於血液細胞分化影響之研究 Effects of vaccine adjuvant on hematopoiesis

鄭凱文 Kai-Wen Cheng 指導教授﹕楊雅雯教授 Advisor: Ya-Wun Yang, Ph.D.

中華民國105年1月

January, 2016

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致謝

這本論文能夠完成首先要感謝楊雅雯教授在我碩士三年半生涯中的教導與指點，引領我進入研究的殿堂，提供我一間完善的實驗室與設備能夠讓我自由發揮研究方向，非常感謝楊雅雯教授一路以來的辛苦付出。還要感謝免疫所的三位教授：伍安怡教授、李建國教授以及繆希椿教授能夠在百忙之中撥冗參與我的口試，

提供我非常多寶貴的意見。也要感謝藥學所教授們以及藥學系系辦公室的各位同仁對我的關心與鼓勵，都是支持我完成碩士班研究的動力之一。

感謝在我初進實驗室指導我實驗技術的張志峰學長以及羅文蕙學姊，還有一共流式細胞儀核心的王靜嫻與黃志成博士教導我流式細胞儀的操作、幫助我分選細胞，還有在諸多次機器阻塞時幫我解決危機，以及容許我在奇怪的時間做實驗。

感謝一共顯微影像核心的徐華蔓技師教導我顯微鏡的操作。感謝二共楊凱婷技師幫助我操作流式細胞儀分選細胞。感謝實驗動物中心繁殖組的劉育如以及其他多位獸醫師幫助我繁殖基因轉殖實驗動物。感謝劉振偉學長在我的實驗上提供了很多的想法，以及協助我實驗的進行。感謝我父母這麼多年來的支持，讓我花了這麼久的時間完成碩士班研究，感謝他們的辛苦付出。

感謝楊雅雯教授爭取到的國科會計畫經費，讓我能夠做這麼多的實驗，以及在我手下犧牲的數百隻實驗小鼠，沒有他們的犧牲我無法進行研究。還要感謝的人太多了，諸多不及備載，謝謝各位，我終於寫完論文了。

鄭凱文 2016/02/04

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圖表目錄

示意圖一、簡化之血液幹細胞分化階層模型圖(hierarchy model) ... 6 示意圖二、簡化之 B 細胞分化理論模型圖 ... 7 示意圖三、簡化之 T 細胞分化理論模型圖 ... 8

圖一、注射 L121-adj.以及 OVA 抗原能有效抑制 B16F10-OVA 黑色素細胞腫瘤的增生以及增加動物存活率 ... 68 圖二、注射 L121-adj.以及 OVA 抗原能有效在六天之內產生抗原專一性之細胞毒

殺反應 ... 70 圖三、注射 L121-adj.影響骨髓中顆粒性白血球與單核細胞的發育 ... 72 圖四、注射 L121-adj.使脾臟中顆粒性白血球增加，並且使顆粒性白血球表現出

F4/80 表面抗原 ... 77 圖五、注射 L121-adj.使淋巴結中顆粒性白血球表現出 F4/80 表面抗原 ... 79 圖六、注射 L121-adj.增加樹突細胞以及顆粒細胞輸送抗原至淋巴結中 ... 81 圖七、注射 L121-adj.使該局部注射位置吸引更多的樹突細胞以及顆粒性白血球

浸潤，並且使樹突細胞表現出MHC-I-SIINFEKL 抗原呈現機制 ... 83 圖八、注射 L121-adj.使該局部注射位置發炎腫脹，並且吸引樹突細胞以及顆粒

性白血球至組織中 ... 86 圖九、注射 L121-adj.使樹突細胞獲得抗原呈現的能力 ... 89 圖 十、 In vivo 去除顆粒性白血球後，再注射 L121-adj.使專一性毒殺性 T 細胞毒

殺能力增加 ... 91 圖十一、注射 L121-adj.影響骨髓中 B 細胞的發育，並且減少骨髓中 B 細胞之數

量 ... 94 圖十二、注射 L121-adj.影響脾臟中 B 細胞的分化，增加 germinal center B 細胞

以及plasma B 細胞 ... 99

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圖十三、注射 L121-adj.使骨髓中前驅 B 細胞轉移到脾臟中，成為 transitional B

細胞 ... 104

圖十四、注射 L121-adj.影響胸線中 T 細胞的發育，並且減少 T 細胞的數量 . 106 圖十五、注射 L121-adj.影響胸線中 T 細胞的發育，加速 T 細胞的成熟 ... 111

圖十六、注射 L121-adj.影響骨髓中血液幹細胞以及免疫細胞的分化 ... 114

圖十七、注射 L121-adj.使骨髓中 CLP 細胞表現高量 Sca-1 表面抗原 ... 119

圖十八、注射 L121-adj.抑制 CLP 細胞分化，減少 B 細胞產生 ... 121

圖十九、注射 L121-adj.在血液中產生立即性的 G-CSF 濃度提升 ... 124

圖二十、注射 L121-adj.後小鼠血液中可使血液細胞分化成顆粒性白血球以及巨噬細胞 ... 126

附錄圖一、注射 L121-adj.後使脾臟中 CD8⁺T 細胞產生 IFN-γ 以及 granzyme B ... 129

附錄圖二、C57BL/6 小鼠骨髓中的 CD11b⁺Gr-1^intLy6C^int細胞的外觀型態以及經過體外培養成熟後可發育成顆粒性白血球 ... 130

附錄圖三、注射 L121-adj.後，C57BL/6 小鼠骨髓中 CD11b⁺Gr-1^‒細胞以及 CD11b⁺Gr-1^intLy6C^‒細胞數量隨時間的變化 ... 131

附錄圖四、注射 L121-adj.後脾臟中 Ly6G⁺CD11b⁺顆粒性白血球不會抑制CD8⁺ T 細胞的活化增生 ... 133

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中文摘要

L121-adjuvant (L121-adj.)為一含有 Pluronic L121 block copolymer、Tween 80 與squalane 等成分之疫苗佐劑。本論文研究目的為探討此 L121-adj.所引發之免疫反應，包含毒殺T 細胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL)反應、對抗腫瘤增生，與其所造成之發炎反應對於顆粒性白血球、B 細胞、T 細胞、血液幹細胞、前驅細胞 [hematopoietic stem/progenitor cell (HSPC)]等免疫細胞分化的影響。

在第一部分的研究中，我們證實皮下注射L121-adj.與抗原能夠有效產生抗原專一性CTL 反應，與可以做為治療性疫苗，抑制 B16F10 黑色素細胞腫瘤的增生。

為了瞭解L121-adj.產生 CTL 的機制，我們以流式細胞儀分析了不同組織中的抗原呈現細胞，發現注射L121-adj.會導致局部注射皮下位置產生發炎反應，吸引顆粒性白血球與樹突細胞至注射部位，並且促進顆粒性白血球與樹突細胞吞噬攜帶抗原至淋巴結中，同時導致骨髓中的顆粒性白血球釋放減少，增加脾臟中的顆粒性白血球。除此之外，我們發現注射位置中的樹突細胞能夠透過MHC-I 呈現抗原，

使CD8⁺ T 細胞活化。為了瞭解顆粒性白血球是否能夠活化 CD8⁺ T 細胞，我們以抗體去除體內顆粒性白血球後，然而卻不會降低L121-adj.所產生的 CTL 反應。以

上實驗結果證明注射部位中的抗原呈現細胞是活化CTL 之重要機制。

第二部分的研究裡，為了分析L121-adj.對於 T 細胞與 B 細胞發育分化的影響，

我們以流式細胞儀分析骨髓與脾臟中的B 細胞，與胸腺中的 T 細胞的 CD marker 表現型。我們發現注射L121-adj.之後的發炎反應會驅使骨髓中的前驅 B 細胞減少，並轉移至脾臟中分化為transitional B 細胞，以產生更多的 marginal zone B 細胞以及follicular B 細胞，進一步使脾臟中產生 germinal center B 細胞與 plasma B 細胞。L121-adj.亦加速胸腺中 T 細胞之發育成熟，使更高比例的前驅 T 細胞通過 positive selection，成熟為 CD4⁺ T 細胞。

第三部分的研究中，為了分析L121-adj.對於 HSPCs 分化的影響，我們以流式

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細胞儀分析骨髓中的HSPCs，我們發現注射 L121-adj.後會改變血液系統的恆定狀態(homeostasis)，造成血液幹細胞分化為更多顆粒性白血球與巨噬細胞，並且減少 common lymphoid progenitors (CLPs)之分化。表示 L121-adj.所造成之發炎反應能夠調控血液幹細胞的分化。

綜合以上結果，證明注射L121-adj.會造成多層次的影響，包含增加樹突細胞的抗原呈現能力，並且活化毒殺T 細胞，抑制腫瘤增生。與促進 T 細胞、B 細胞的分化成熟。另一方面，透過血液調控骨髓中血液幹細胞分化，以產生更多的顆粒性白血球，補償顆粒性白血球的消耗。

關鍵詞：疫苗佐劑；毒殺T 細胞；免疫細胞分化

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Abstract

The objective of this study was to examine the immunological effect induced by the L121-adjvant (L121-adj.), an emulsion vaccine adjuvant consisting of Pluronic L121, Tween 80, and squalane, including the cytotoxicity T lymphocyte (CTL) response and the differentiation of B cells, T cells, and the hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs).

Vaccination of B16F10 melanoma-bearing mice with L121-adj. containing ovalbumin (OVA) induced an antigen-specific CTL response, resulted in an inhibition of tumor growth with an increased the survival rate. Flow cytometric analysis illustrated both dendritic cells and granulocytes were recruited to the injection sites after

vaccination, and antigens were transported to draining lymph nodes by the antigen presenting cells (APCs). Accelerated production of granulocytes was observed in the bone marrow, in response to inflammation induced by vaccination, followed by moving into the spleen. Dendritic cells were able to effectively cross-present antigen in vivo via MHC-I molecule and activate the CD8⁺ T cells. Depletion of granulocytes prior to immunization resulted in an enhanced CTL response.

Injection of L121-adj. promoted the translocation of B cell precursors from bone marrow to the spleen, resulted in the differentiation of transitional B cells into marginal zone B cells and follicular B cells, followed by the formation of germinal center and

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plasma B cells. Positive selection of developing T cells in the thymus was accelerated by the treatment of L121-adj., resulted in a significant production of mature CD4⁺ T cells. Modification of hematopoietic homeostasis was also noticed after vaccination of animals with L121-adj. Flow cytometric analysis showed marked increase of

Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺ (LSK) hematopoietic stem cells (HSCs) and consequently the

granulocyte-macrophage progenitors (GMPs), presumably at an expense of the common myeloid progenitors (CMPs). Generation of F4/80⁺and Ly6G⁺ cells from LSK, CMPs, and GMPs was profoundly increased due to the presence of granulocyte

colony-stimulating factor (G-CSF) in the serum of immunized mice.

Taken together, injection of mice with L121-adj. exhibited several immunological effects, including the recruitment of dendric cells for the activation of CTL, promoting the differentiation and maturation of progenitors of B and T progenitors into functional lymphocytes. L121-adj. also triggers the differentiation and proliferation of

hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs), giving rise to the generation of granulocytes in the bone marrow of immunized animals.

Key words：

CTL；Development of immune cells；Hematopoiesis；Vaccine adjuvant

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第一章文獻回顧

1.1 疫苗佐劑(vaccine adjuvant)之概要

疫苗最早源自Edward Jenner 於 1796 年成功接種牛痘來預防天花，致使天花於1970 年絕跡。疫苗可將疾病抗原事先使生物體產生後天性免疫(adaptive immunity)，以作為預防疾病之手段。疫苗之抗原可來自：減毒(attenuated)活病原體、去活化(inactivated)病原體、細菌毒素，與純化蛋白質抗原。然而並非所有抗原都能夠成功活化免疫反應產生後天性免疫反應，因此發展出疫苗佐劑來輔助免疫系統產生免疫力。疫苗佐劑本身不具抗原性，用於增強疫苗的效用，使免疫系統產生對施打之抗原產生更好的免疫力。目前所開發出之疫苗佐劑的種類有相當多種，包括：礦物鹽類、微生物製劑、乳劑、saponin、細胞激素(cytokines)、聚合物、微粒子(microparticles)與脂質體(liposomes)等(1)，然而疫苗佐劑的機制卻未完全了解，目前被認為之機制包含：一、產生depot effect，使抗原能夠停留在注射部位不易清除，達到緩釋效果。二、產生cytokines 與 chemokines 吸引免疫細胞至局部注射部位。三、促進抗原呈現細胞(antigen presenting cells, APCs)之抗原呈現能力等機制(2)。疫苗佐劑由於機制不明而發展不易，與安全性問題發展緩慢，許多疾病仍然無法有效研發出疫苗，發展出除了產生抗體之外，能夠產生有效細胞免疫(cell-mediated immunity)與安全的疫苗佐劑為迫切需要(3)。

1.2 含有 Pluronic L121 block co-polymer 之疫苗佐劑介紹

為了研究疫苗佐劑之機制，我們以一種含有Pluronic L121, Tween 80,與

squalane 成分，經過微流化(microfluidize)製成之 o/w 乳劑之疫苗佐劑，L121-adjuvant (L121-adj.)(4)，作為研究材料。此疫苗佐劑在過去曾被證實可以引起抗體免疫 (humoral response)，同時也可以產生細胞免疫，與抗原專一性毒殺 T 細胞反應

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(cytotoxic T lymphocyte, CTL)(5)。此疫苗佐劑劑型最早可追朔至 Syntex adjuvant formulation (SAF)，以取代常用的 complete Freund’s adjuvant (CFA)疫苗佐劑，當時發現此種疫苗佐劑能夠有效產生抗體免疫與細胞免疫(6)，引發 Th1-type 免疫反應與產生IgG2a 抗體(7)，隨後證實此疫苗佐劑與純化蛋白質抗原能夠有效引發 CTL 反應(8)，之後於人體臨床實驗亦被證實能夠治療 B-cell lymphoma (9)。關於此疫苗佐劑之成分，Squalane 由於具有生物可分解性，適合作為乳劑型疫苗佐劑之油相，

以取代CFA 中的礦物油(10)，並且以 Tween 80 作為介面活性劑幫助乳化，此外加入具有介面活性之共聚合物Pluronic L121 被發現能夠進一步增加疫苗佐劑的功效 (11, 12)。由於 L121-adj.具有良好的佐劑效果，因此我們想深入探討瞭解其效果機制，作為開發安全有效疫苗佐劑之踏腳石。

1.3 血液幹細胞及前驅細胞(hematopietic stem/progenitor cells, HSPCs)的分化 關於疫苗佐劑之機制，除了目前前面所述幾種公認可能機制之外，我們認為疫苗佐劑所引發之發炎反應，會改變血液細胞的分化，作為先天性免疫的一種，

以調控後天性免疫反應，因此在本論文中，我們將分析觀察L121-adj.對於 HSPCs 分化之影響。體內之免疫細胞乃分化自骨髓中的HSPCs，本論文採用目前較廣為接受之分化階層理論(hierarchy model) (13-15)。如示意圖(一)所示，簡述如下，最上游之血液幹細胞為多功能性(multipotent)幹細胞，一般稱為 LSK 細胞

(Lineage^–CD117⁺Sca-1⁺) (16, 17)，具有良好自我新生 self-renewal 能力與分化為下游前驅細胞，可依據分化及self-renewal 特性分成 long-term HSC (LT-HSC)，

short-term HSC(ST-HSC)，以及 multipotent progenitor (MPP) (13)，可往下分化為單功能(oligopotent)前驅細胞，包含 common lymphoid progenitor (CLP)細胞(18, 19)，

與common myeloid progenitors (CMP)細胞(20-22)。CLP 細胞可分化為 T 細胞、B 細胞與NK 細胞等淋巴球(lymphocyte)，而不會產生顆粒性白血球、巨噬細胞、單核細胞、紅血球等髓細胞(myeloid cell)(18)，反之 CMP 細胞則可分化為

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granulocyte-macrophage progenitor (GMP)細胞，與 megakaryocyte/erythroid

progenitor (MEP)細胞而不會分化為淋巴球(20-22)。GMP 細胞可進一步分化為顆粒性白血球、單核細胞、巨噬細胞，而MEP 細胞則分化為紅血球與血小板(20)。另外，樹突細胞則來自骨髓中表現有CD135 的前驅細胞(23, 24)，包括 CMP 細胞、

CLP 細胞，與 common dendritic progenitor (CDP)細胞(22, 25, 26)。

1.4 發炎反應影響血液幹細胞及前驅細胞的分化

一般狀況下，血液幹細胞會維持穩定的分化與self-renewal，以維持血液系統的穩定。然而，感染所導致之發炎反應會影響血液幹細胞與前驅細胞的分化，以補償免疫細胞的消耗(27)。舉例來說，細菌(Ehrlichia muris)感染會透過 IFN-γ 使骨 髓中的CMP 與 GMP 細胞消耗以產生更多成熟顆粒性白血球，以維持衡平(28)；

注射lipopolysaccharide (LPS)會增加 LSK 細胞的 self-renewal 與分化速度(29)；疫苗佐劑alum 亦會使顆粒性白血球消耗，而使骨髓快速產生大量顆粒性白血球(30)；

血液幹細胞甚至能夠轉移至發炎部位分化為顆粒性白血球(31, 32)；血液幹細胞亦與成熟的免疫細胞一樣表現出toll like receptor (TLR)，以調控分化(33)；顯示血液幹細胞亦可直接或是間接的參與調控免疫反應(34)。因此在本論文中，我們將分析觀察血液細胞的分化在注射疫苗佐劑後所受到的影響。

1.5 B 細胞的發育及分化

如示意圖(二)所示，B 細胞來由骨髓中的 CLP 細胞的分化而來，骨髓中的前驅 B 細胞為 B220⁺IgM^–(35)，利用 CD43，BP-1 與 CD24 可將前驅 B 細胞分為四群細胞，其中pre-pro B 細胞(Fr. A)，為最上游之前驅 B 細胞(35, 36)，可分化為 pro B 細胞，包括early pro B 細胞(Fr. B)與 late pro B 細胞(Fr. C)，後續再分化為 pre B 細胞(Fr. D)，接著分化為 immature B 細胞(Fr. E)與 mature B 細胞(Fr. F) (35-38)。骨髓中的immature B 細胞會離開骨髓轉移至脾臟中繼續分化為 transitional B 細胞，

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transitional B 細胞可至少再分為兩群，分別為 T1 以及 T2 B 細胞 (39-41)，一部分的transitional B細胞可分化成marginal zone (MZ) B細胞，或是分化成follicular (FO) B 細胞(42, 43)。MZ B 細胞位於脾臟 marginal zone 中，受到血液中抗原刺激時可以快速且大量的產生IgM(44, 45)，並且表現出 costimulatory molecules 如 CD80 與 CD86 等，可做為抗原呈現細胞活化 CD4⁺ T 細胞(46, 47)，因此被認為是第一線參與早期免疫反應之細胞(48)，對抗血液中病原體的感染(49, 50)，亦可分化為

germinal center (GC) B 細胞，產生 somatic hypermutation 成為 memory B 細胞(51)。

FO B 細胞位於脾臟 follicles 中，為脾臟中主要的 B 細胞，且會在骨髓、淋巴器官中循環(42, 52)，可由 follicular helper T 細胞活化，而產生抗體(53)。

1.6 胸腺中 T 細胞的發育及分化

T 細胞之發育成熟如示意圖(三)，簡述如下：T 細胞於胸腺中發育成熟，骨髓

中的前驅細胞經由血液循環移動到胸腺中，此細胞由於還沒表現出CD4 或是

CD8，稱為 double negative (DN)細胞，依分化順序可區分為四群，首先為 DN1 細胞，依序分化成DN2 細胞，DN3 細胞，與 DN4 細胞，之後才分化成同時具有表現CD4 及 CD8，稱為 double positive 細胞(DP)，此時細胞會分化成熟為只有表現 CD4 或是 CD8 之一的 single positive (SP)細胞，分別為 CD4⁺ SP 細胞或是 CD8⁺ SP 細胞，之後進入血液循環移動至周邊淋巴器官(54-56)。CD4⁺ T 細胞受到抗原刺激可再化成熟為helper T 細胞或是 regulatory T 細胞，而 CD8⁺ T 細胞則分化成熟為毒殺T 細胞(CTL) (55)。

1.7 毒殺 T 細胞(CTL)與 MHC-I cross presentation

毒殺T 細胞可釋放出 perforin、gramzyme B 來毒殺目標細胞(57)，或是透過表現Fas ligand 來引發目標細胞凋亡(58)，Cytotoxicity T 細胞的目標細胞可為受病毒感染的細胞，或是癌細胞，因此被發展作為免疫療法來治療癌症(59)。毒殺 T 細胞

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需要抗原呈現細胞將細胞外的抗原吞噬後，經由MHC-I 呈現給 CD8⁺ T 細胞，稱為cross presentation (60)。目前已知具有 cross presentation 能力之抗原呈現細胞主要為樹突細胞(61)。嗜中性顆粒性白血球(neutrophil)亦被發現具有 cross presentation 的能力(62)，然而在其他研究中利用抗體去除體內顆粒性白血球或是利用 G-CSF^–/–

neutropenic 小鼠測試顆粒性白血球對於 CD8⁺ T 細胞活性的影響卻未見降低(63)，

顯示顆粒性白血球活化CD8⁺ T 細胞的能力仍有待研究與討論。

目前對於疫苗佐劑對於血液細胞分化的影響並未完全明瞭，因此本論文以 L121-adj.作為研究材料，探討其對血液細胞分化的影響，以了解血液細胞分化與疫苗佐劑所引發的免疫反應之間的關聯性，以提供一個疫苗佐劑機制研究的新觀點。我們的研究呈現了L121-adj.能夠造成多方面的影響，包括增加樹突細胞的抗原呈現能力，以活化毒殺T 細胞，以及促進 T 細胞、B 細胞的分化成熟。另一方面，透過血液調控骨髓中血液幹細胞分化，以產生更多的顆粒性白血球，補償顆粒性白血球的消耗。

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示意圖一、簡化之血液幹細胞分化階層模型圖(hierarchy model)

本圖主要參考自Weissman IL 等人於 2011 年之著作(13)，並且加入 CDP 細胞的發現(25)。CMP、GMP 以及 CDP 之 CD marker 表現進一步參考自其他文獻(22)，

以之作為本論文之分析方式。

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示意圖二、簡化之 B 細胞分化理論模型圖

圖(A)為 antigen-independent 之 B 細胞分化理論模型圖，骨髓中 B 細胞的分化主要參考自Hardy 等人之研究(64)，以及其他回顧文獻(65)。脾臟中 B 細胞的分化則參考自數篇文獻(43, 66)。圖(B)為 antigen-dependent 之 B 細胞分化理論模型圖，

plasma B 細胞以及 GC B 細胞之 CD marker 表現過去研究文獻(51, 67, 68)。

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示意圖三、簡化之 T 細胞分化理論模型圖

本圖為胸腺中T 細胞分化成熟之理論模型圖，主要參考自過去數篇回顧文獻，經

簡化後呈現(54-56)。

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第二章研究目的與實驗設計

由於疫苗佐劑之機制未完全明瞭仍有待更深入探討，導致疫苗無法有效產生 CTL與Th1 response是目前開發疫苗佐劑所遇到的難題之一(3)。含有 Pluronic L121, Tween 80,與 squalane 之 L121-adjuvant 能夠有效產生 Th1 response (7)，在過去曾被證實可以引起抗體免疫(humoral response)，同時也可以產生細胞免疫，與抗原專一性毒殺T 細胞反應(cytotoxic T lymphocyte, CTL) (5)。由於近年來發現發炎反應會調影響血液細胞的分化(30, 69)，與血液幹細胞透過改變分化行為以調控、參與免疫反應(27, 34)，然而關於疫苗佐劑對於血液細胞分化的影響目前並沒有太多研究，因此我們欲探討L121-adj.對於血液細胞的分化之影響。

L121-adj.為乳劑型疫苗佐劑，與抗原混和後以皮下注射至 C57BL/6 實驗小鼠，

我們以常被使用於免疫研究之ovalbumin (OVA)作為模式抗原以研究抗原專一性之免疫反應。為了證實L121-adj.能夠有效產生 CTL 以及抑制腫瘤的增生，我們在注射L121-adj.與 OVA 之後，以標記有螢光 CFSE 並且帶有 OVA 部分胜肽片段 SIINFEKL 之 CD45.1 小鼠之脾臟細胞做為毒殺 T 細胞之目標細胞，於不同時間點分析體內CTL 的反應。

我們選用適合接種於皮下以利於觀察腫瘤增生，以及帶有OVA 抗原之

B16F10-OVA 黑色素細胞瘤作為腫瘤模式的研究，並且使用 L121-adj.作為治療性疫苗，於腫瘤成功生長出來後再注射L121-adj.與抗原 OVA，並且觀察腫瘤是否能夠因為L121-adj.所引發之免疫反應而減緩增生，以證實 L121-adj.是有效之疫苗佐劑。

由於皮下部位有豐富的淋巴組織與免疫細胞，再加上疫苗佐劑在局部注射部位能夠引起發炎反應，我們將以流式細胞儀分析皮下組織中的抗原呈現細胞，以及其他免疫器官包括脾臟、骨髓中的抗原呈現細胞受到疫苗佐劑刺激的影響。

為了瞭解疫苗佐劑之注射是否會改變抗原於體內分布的改變，我們以螢光物

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質FITC 與抗原 OVA 進行反應將兩者連結在一起，之後使用流式細胞儀追蹤分析抗原於體內的分布。

為了瞭解皮下注射部位中的免疫細胞是否能夠活化CD8⁺ T 細胞以產生 CTL 反應，我們將皮下部位中的免疫細胞以流式細胞儀分選出來，並且與來自OT-I 小鼠具有OVA 專一性之 CD8⁺ T 細胞混和後，再以尾靜脈注射至未經處理的 CD45.1 小鼠，於三天後分析體內CD8⁺ T 細胞是否有活化，以證明 L121-adj.皮下注射部位中的抗原呈現細胞能夠活化CD8⁺ T 細胞以產生 CTL。

由於顆粒性白血球曾被指出具有抗原呈現的能力，我們為了測試L121-adj.是否能夠使顆粒性白血球產生抗原呈現能力以活化CTL，於注射 L121-adj.之前先以 anti-Ly6G 專一性抗體去除體內顆粒性白血球，再測量之後的 CTL 反應，以瞭解顆粒性白血球在產生CTL 機制中的功能。

為了探討L121-adj.對於 B 細胞分化的影響，我們借鏡過去研究所發現 B 細胞分化的成果，於注射L121-adj.後不同時間點，以流式細胞儀分析骨髓與脾臟中 B 細胞分化的改變。同樣的，我們也利用流式細胞儀分析胸腺中T 細胞分化的改變。

為了證明L121-adj.能夠使骨髓中前驅 B 細胞轉移到脾臟中，導致骨髓中前驅 B 細胞的減少，我們將 CD45.1 小鼠骨髓中的前驅 B 細胞以流式細胞分選儀分選出來後，經由骨髓腔注射，將前驅B 細胞移植至 C57BL/6 小鼠骨髓中，並且於注射 L121-adj.後分析脾臟中是否有來自骨髓的前驅 B 細胞。

為了分析骨髓中血液幹細胞受到L121-adj.刺激所產生的改變，我們同樣引用過去研究所使用之分析方式，以流式細胞儀分析骨髓中的血液幹細胞分化的改變。

為了證明L121-adj.是透過何種方式使血液幹細胞產生大量顆粒性白血球，我們將注射過L121-adj.之小鼠血清於體外培養經由流式細胞分選儀所分選出的 LSK、CMP、GMP 細胞，之後再以流式細胞儀分析其分化情形。

為了瞭解CLP 細胞的分化受到 L121-adj.的影響，我們將 C57BL/6 小鼠骨髓中的CLP 細胞經由流式細胞分選儀分選出來後，以尾靜脈注射至 CD45.1 小鼠體內，

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並且於不同時間點觀察血液中由CLP 細胞分化而來的 B 細胞以及 T 細胞的變化。

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第三章材料與方法

3.1 藥品試劑 (依照字母排序)

7-amino-actinomycin D (7-AAD) viability staining solution 購自 eBioscience (00-6993-50)；albumin from bovine serum (BSA)購自 Sigma-Aldrich (A7906)；albumin from chicken egg white (Ovalbumin, 簡稱 OVA) 購自 Sigma-Aldrich (A5503)；boric acid 購自 BioRad (161-0751)；Biomag® magnetic microbeads conjugated goat anti-rat IgG 購自 Qiagen (310107)；Brilliant Violet 650™ conjugated streptavidin 購自

Biolegend (405231)；calf serum 購自 Gibco (16440-034)；carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)購自 Molecular Probes (C1157)；collagenase type IV 購自 Worthington (4188)； DNase I 購自 Roche (10104159001)；DMEM/HIGH Medium 購自Hyclone (SH30003.02)；dimethyl sulfoxide (DMSO)購自 Sigma-Aldrich (D5879)；eosin Y Solution (Alcoholic)購自 ScyTek (EYA500)；

ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA-Na2)購自 Amresco (P0024519)；

fixable viability dye eFluor® 506 購自 eBioscience (65-0866-14)；fluorescein

isothiocyanate isomer I (FITC)購自 Sigma-Aldrich (F-7250)；fetal bovine serum (FBS) 購自Gibco (10437)；4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)購自 Research Organics (6003H-4)；hematoxylin, Mayer's (Lillie's Modification)購自 ScyTek (HMM500)；isoflurane 購自 Baxter；2-mercaptoethanol 購自 Fluka (63690)；MEM non-essential amino acid s (NEAA)購自 Gibco (11140-050)；NeA-Blue

tetramethylbenzidine substrate 購自 Clinical Science Products (01016-1-500)；

ovalbumin (257-264), chicken (胺基酸序列：SIINFEKL)購自 PolyPeptide (SC1302)；

Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS)購自 Hyclone (SH30013.04)；

polyoxyethelene (20) sorbitan monolaurat 購自 Wako (167-11515)；Polybead®

microspheres 15.00µm 購自 Polyscience (18328)；penicillin-streptomycin solution 購自

(25)

13

Biological Industries (1425127)；RPMI 1640 medium 購自 Gibco (31800-022)；sodium bicarbonate 購自 Wako (191-01305)；sodium pyruvate 購自 Gibco (11360)；sodium tetraborate 購自 J.T.Baker (3574)；Tissue-Tek® O.C.T. Compound 購自 SAKURA FINETEK (4583)；Wright-Giemsa Stain, Modified 購自 Sigma-Aldrich (WG16)。

3.2 培養基與緩衝液配方

RPMI 1640 培養基含有 2 g/l sodium bicarbonate，25 mM HEPES，50 μM 2-mercaptoethanol，100 units/ml penicillin 與 100 μg/ml streptomycin，再以 HCl 與 NaOH 調整至 pH=7.2 (70)；DMEM 培養基含有 3.7 g/l sodium bicarbonate，再以 HCl 與NaOH 調整至 pH=7.2；red blood cell (RBC) lysis buffer 含有 8.34 g/l NH4Cl，37.22 mg/l EDTA，1 g/l NaHCO3；Borate buffer 含有 6.18 g/l boric acid，9.54 g/l sodium tetraborate，4.38 g/l sodium chloride，再以 HCl 與 NaOH 調整至 pH=9.0。

3.3 用於流式細胞儀分析之螢光抗體與純化 CD8⁺細胞所用的抗體

以下抗體購自Biolegend：APC-anti-CD115 (AFS98)，APC-anti-Ly6G (1A8)，

APC-anti-CD138 (281-2)，APC-anti-CD24 (M1/69)，APC-Cy7-anti-CD16/32 (93)，

APC-Cy7-anti-CD11b (M1/70)，APC-Cy7-anti-IgD (11-26c.2a)，Brilliant Violet 605™-anti-B220 (RA3-6B2)，Brilliant Violet 711™-anti-CD45.1 (A20)，

biotin-anti-CD34 (HM34)， FITC-anti-Sca-1 (D7)，FITC-anti-CD8 (53-6.7)，

PE-anti-Ly6C (HK1.4)，PE-anti-F4/80 (BM8)，PE-anti-Gr-1 (RB6-8C5)，PE-anti-CD3 (145-2C11)，PE-anti-CD19 (6D5)，PE-anti-B220 (RA3-6B2)，PE-anti-CD11b

(M1/70)，PE-anti-NK1.1 (PK136)，PE-anti-erythroid cells (Ter119)，PE-anti-CD11c (N418)， PE-anti-CD21/35 (7E9)，PE/Dazzle™ 594-anti-CD45.2 (104)，

PerCP-Cy5.5-anti-CD11b (M1/70)， PE-Cy7-anti-IgM (RMM-1)，PE-Cy7-anti-CD25 (PC61)，PE-Cy7-anti-CD127 (A7R34)，PE-Cy7-anti-IFN-γ (XMG1.2)，purified

(26)

14

rat-anti-MHC-II (M5/114.15.2)。

以下抗體購自eBioscience：APC-anti-MHC-I-SIINFEKL (eBio25-D1.16)，

APC-eFluor® 780-anti-CD11b (M1/70)，APC-eFluor® 780-anti-CD8 (53-6.7)，

biotin-anti-CD5 (53-7.3)，eFluor® 450-anti-Ly6C (HK1.4)，eFluor® 450-anti-TCRVα2 (B20.1)，eFluor® 450-anti-TCRβ chain (H57-597)，eFluor® 450-anti-CD117 (2B8)，

eFluor® 450-anti-GL7 (GL-7)，FITC-anti-Gr-1 (RB6-8C5)，FITC-anti-CD11b (M1/70)，FITC-anti-CD19 (eBio1D3)，PE-anti-granzyme B (16G6)PE-anti-CD44 (IM7)，PerCP-eFluor® 710-anti-IgD (11-26c)，PerCP-eFluor® 710-anti-CD4 (GK1.5)，PerCP-eFluor® 710-anti-CD135 (A2F10)，PE-Cy7-anti-CD11b (M1/70)，

PE-Cy7-anti-CD11c (N418)，PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)。

以下抗體購自UCSF antibody core：rat anti-CD11b (M1/70)，rat anti-F4/80 (BM8)，rat anti-CD4 (GK1.5)，rat anti-Gr-1 (RB6-8C5)，rat anti-erythroid cell (Ter119)，

rat anti-B220 (RA3-6B2)，rat anti-CD19 (6D5)，rat anti-CD16/32 (93)。

以下抗體購自Biolegend用於作為isotype control：

APC-Mouse IgG1,κ

(MOPC-21)，APC-Rat IgG 2a,κ (RTK2758)，APC-Rat IgG2b,κ (RTK4530)，APC-Cy7-Rat IgG 2a,κ (RTK2758)，APC-Cy7-Rat IgG2b,κ (RTK4530)，FITC-Rat IgG2b,κ (RTK4530)，

PE-Rat IgG 2a,κ (RTK2758)，PE-Rat IgG1,κ (RTK2071)，PerCP-Cy5.5- Rat IgG2b,κ (RTK4530)。或是購自eBioscience作為isotype control：APC-Armenian Hamster IgG (eBio299Arm)，FITC-Armenian Hamster IgG (eBio299Arm)，FITC-Rat IgG 2a,κ (eBM2a)，PE-Armenian Hamster IgG (eBio299Arm)，PE-Cy7-Armenian Hamster IgG (eBio299Arm)，PE-Cy7-Rat IgG 2a,κ (eBR2a)，PerCP-Cy5.5-Rat IgG 2a,κ (eBR2a)。

Anti-Gr-1(RB6-8C5)抗體會同時辨認 Ly6G 及 Ly6C(71)，一般會用於在流式細胞儀分析中區分顆粒性白血球(72)，但是專一性較差，單核細胞以及部分樹突細胞也會表現出較低量Gr-1(73)，故在部分實驗中會以 anti-Ly6G (1A8)作為專一性較高之抗體來區分脾臟與淋巴結中的顆粒性白血球(74)。

(27)

15

3.4 用於免疫螢光染色所使用之抗體

Anti-chicken egg albumin antibody produced in rabbit whole antiserum 購自 Sigma-Aldrich (C6534)；anti-rat IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat affinity isolated antibody, buffered aqueous solution 購自 Sigma-Aldrich (F6258)；

anti-rabbit IgG (whole molecule)–TRITC antibody produced in goat

IgG fraction of antiserum, buffered aqueous solution 購自 Sigma-Aldrich (F5268)，

DyLight™ 405 AffiniPure goat anti-armenian hamster IgG (H+L)購自 Jackson ImmunoResearch Inc. (127-475-099)；purified anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)

antibody 購自 Biolegend (RB6-8C5，108401)，purified anti-mouse CD11c antibody 購自Biolegend (N418，117301)。

3.5 小鼠品系

雄性C57BL/6 (CD45.2⁺)小鼠、雄性或雌性 B6.SJL-Ptprc^a

Pepc

^b/BoyJ 小鼠(簡稱 CD45.1⁺)、與雄性或雌性 C57BL/6-Tg (TcraTcrb)1100Mjb/J 小鼠(簡稱 OT-I)皆由台灣大學醫學院實驗動物中心提供。本實驗中所使用的小鼠年齡皆為6-12 週。實驗中動物之使用均已經國立臺灣大學醫學院實驗動物照護及使用委員會審查核准。

3.6 疫苗佐劑與注射方式

L121-adjuvant(簡稱 L121-adj.)是一種劑型為水包油（oil-in-water）乳劑的疫苗佐劑，製作方式如前所述 (5, 8)。成分包含 3.75 % Pluronic L121、0.6% Tween 80 與15% squalane 於 PBS 內混合。L121-adj.在使用前先以 PBS 稀釋三倍。將 90 μl 稀釋後之L121-adj.與 10 μl OVA 溶液(10 μg/μl，溶於 PBS 中)混和後，以 31 gauge 針頭打入小鼠體側(hind flanks)皮下，左右兩邊各打入 50 μl，總共 100 μl (4)。

(28)

16

3.7 流式細胞儀與小鼠組織細胞的處理方式

注射疫苗佐劑後的小鼠於指定天數使用約0.4 % (v/v)吸入性 isoflurane 麻醉後，以頸椎脫臼方式犧牲。從脛骨與股骨（tibias and femurs）中以 26G 針頭與不含血清之RPMI 1640 培養液沖出骨髓細胞(75)。脾臟(spleen)、腹股溝淋巴結 (inguinal lymph nodes)、與胸腺(thymus)細胞則使用玻璃玻片之磨砂部分磨碎(76, 77)，並經 200 目(74 μm)尼龍篩網過濾成細胞懸浮液。皮下注射部位的皮膚，先以剪刀切成小塊，再浸泡於37 ℃含有 6 mg/ml collagenase type IV, 0.1 mg/ml DNase I 與10 % FBS 的 RPMI 1640 培養液內 1 小時進行分解反應。分解完成後，使用含 2 mM EDTA-Na2的PBS 清洗細胞，並以 200 目(74 μm)尼龍篩網過濾成細胞懸浮液。

血液之採取使用採血針自小鼠頜下靜脈(submandibular vein)取得(78)，每次採取約 100 μl 之血量，並加入 14.3 USP units sodium heparin 避免血液凝固。使用 RBC lysis buffer溶解紅血球。將細胞均勻分散在 cold FACS staining buffer，為PBS 含有 1% calf serum 與 2 mM EDTA-Na2 (79)，細胞濃度約為 10⁷/ml，與 10 μg/ml 之 purified anti-CD16/32 抗體作為 FcR blocking 後(部分實驗未加入)，再加入根據經驗適量之 fluorochrome-conjugated antibodies 於 4℃培養 30 分鐘。將細胞清洗後，加入 fluorochrome-conjugated streptavidin 培養 30 分鐘，並加入 7-aminoactinomycin D 或 fixable viability dye eFluor® 506 區分死細胞與活細胞。然後加入 1.35×10⁵顆直徑 15 μm 的 polystyrene microspheres 作為計算絕對細胞數的 internal control 加至各組細胞內。細胞的分析是使用配備有405，488，561，640 nm 雷射的 LSRFortessa (BD Bioscience)，或是配備有 488 nm、640 nm 雷射的 FACSVerse 流式細胞儀分析 (BD Biosciecne)。細胞的分選是使用國立台灣大學醫學院第一共同研究室流式細胞分析與分選中心提供的FACSAria II 或 FACSAria III (BD Bioscience)細胞分選服務。流式細胞儀的數據是使用FlowJo (Treestar)第十版軟體進行分析。

(29)

17

3.8 腫瘤的植入與測量

B16F10-OVA 為表現 OVA 的黑色素細胞瘤(80)，此細胞株是培養在含 10% FBS 之DMEM 內。首先將 2×10⁶個B16F10-OVA 細胞均勻分佈至 100 μl PBS 內，再以皮下注射方式注射至C57BL/6 小鼠背部，每兩天以游標尺記錄一次腫瘤大小與小鼠的存活率。腫瘤大小的計算方式如下(81)：( volume = larger diameter × smaller diameter² × 0.4)。腫瘤植入兩週後，當腫瘤的成長已進入指數期（腫瘤體積每兩天增加兩倍），將100 μL 含 100 μg OVA 之 L121-adjuvant 或 PBS 注射至小鼠皮下。

兩組實驗組各使用五隻小鼠。此實驗中小鼠身上的腫瘤體積超過4,000 mm³時則視為實驗終點(5)。

3.9 體內專一性殺手型 T 細胞(Cytotoxicity T Lymphocytes, CTL)的細胞毒殺能力 試驗

將100 μl 含 100 μg OVA 之 L121-adjuvant 於第 0 天與第 7 天注射至 C57BL/6 皮下，之後每2 天測量一次細胞毒殺率直到第 14 天。細胞毒殺率的決定方式是參考自過去文獻建立的方法(82)。將公 CD45.1 小鼠脾臟細胞分成兩份，一部分經 5 μM CFSE 標記，再於含 10% FBS 之 RPMI 1640 培養基加入 2 μM SIINFEKL 培養 1 小時 (CFSE^high)，另一部分則標記 0.5 μM CFSE 未加入 SIINFEKL 處理 (CFSE^low)，

之後用PBS 清洗細胞，將 CFSE^high細胞與CFSE^low細胞以1:1 比例(共 5×10⁶個細胞)混合於 100 μl PBS 中，以尾靜脈注射方式注射至已打過疫苗佐劑的 C57BL/6 小鼠體內，20 小時後將小鼠犧牲，並收集脾臟細胞，以 PE/Dazzle™ 594-anti-CD45.2 與Brilliant Violet 711™-anti- CD45.1 染色後，使用 LSRFortessa 流式細胞儀分析，

然後將CD45.1⁺，CD45.2^–細胞群落圈選出來並計算出CFSE^high細胞與CFSE^low細胞的數目，細胞毒殺率的計算公式如下(83)：specific cytotoxicity=[1- (number of CFSE^high/number of CFSE^low)] ×100%

(30)

18

3.10 分析 L121-adj.對於骨髓內髓細胞(myeloid cells)以及脾臟與淋巴結中顆粒性 白血球、樹突細胞分化的影響

將100 μl 含 100 μg OVA 之 L121-adjuvant 於第 0 天與第 7 天注射至 C57BL/6 小鼠皮下。分析骨髓的部分，分別於第2, 4, 6, 8, 10 天將小鼠犧牲取出骨髓細胞，

以未經處理之小鼠做為第0 天控制組。將骨髓細胞均勻分散至 staining buffer 內，

以FITC-anti-Gr-1，PE-anti-Ly6C，PE-Cy7-anti-B220，APC-anti-CD115，APC-eFluor®

780-anti-CD11b 染色, 最後加入 7-AAD 區分死細胞，並使用 LSRFortessa 流式細胞

儀進行分析。另外，分析脾臟與淋巴結的部分，於第2、3 天將小鼠犧牲，取出脾

臟與腹股溝淋巴結細胞。將細胞均勻分散至staining buffer 內，以 PE-anti-F4/80，

PE-Cy7-anti-CD11c，APC-anti-Ly6G，APC-eFluor® 780-anti-CD11b 染色，再加入 7-AAD 區分死細胞，並使用 LSRFortessa 流式細胞儀進行分析。

3.11 在 OVA 上標記 FITC 的方法

為了追蹤注射L121-adj.後對於體內 OVA 抗原吞噬的影響，我們利用 FITC 螢光標記OVA 以利於流式細胞儀分析。將 FITC 標記 OVA 的方法參考修改自其他文獻(84)。將 OVA 溶解在 pH 9 的 borate buffer 內，製成濃度 10 mg/mL 的溶液。FITC 溶於DMSO 內成 10 mg/mL 的溶液。100 μl 的 FITC 溶液緩慢加入 1 ml 的 OVA 溶液內於4℃持續攪拌 10 小時，過程保持避光。使用可過濾分子量 10,000 蛋白質之 Amicon® centrifugal filter (Millipore)移除過量的 FITC 數次，直到未接在 OVA 上的 FITC 全部被過濾乾淨，即濾液經 492 nm 測量無螢光吸光值。之後將 OVA-FITC 溶液調整至濃度10 mg/ml，並且於黑暗與 4℃環境中儲存。經 280 nm 以及 492 nm 測量吸光值，依據參考文獻之公式(84)，所計算出之 fluorescence/protein 比例為 1.46。

(31)

19

3.12 分析 L121-adj.對於淋巴結中顆粒性白血球與樹突細胞吞噬抗原能力的影響 將 100 μl 含 200 μg FITC-conjugated OVA 之 L121-adjuvant 或 PBS 注射入 C57BL/6 小鼠皮下，在過了 48 與 72 小時後，將小鼠犧牲並取出腹股溝淋巴結細胞，再將細胞均勻分散於staining buffer 並且使用 PE-anti-F4/80，PE-Cy7-

anti-CD11c，APC-anti-Ly6G，APC-eFluor® 780-anti-CD11b，Brilliant Violet 605™- anti-B220 染色，再加入 7-AAD 區分死細胞，並使用 LSRFortessa 流式細胞儀進行分析。

3.13 分析 L121-adj.對於局部皮下注射部位中顆粒性白血球與樹突細胞抗原呈現 的影響

將100 μl 含 100 μg OVA 之 L121-adjuvant 或 PBS 注射入 C57BL/6 小鼠皮下，

注射部位先以電動除毛刀去除毛髮，於經過24, 48, 72 小時之後，將小鼠犧牲取出注射部位。將細胞均勻分散至staining buffer，並以 FITC-anti-Gr-1，

PE-Cy7-anti-CD11c，APC-anti-MHC-I-SIINFEKL complex 染色，再加入 7-AAD 區分死細胞，並使用LSRFortessa 流式細胞儀進行分析。

3.14 測試局部皮下注射部位中顆粒性白血球與樹突細胞的交叉呈現能力

將100 μl 含 100 μg OVA 之 L121-adj.或 PBS 注射入 C57BL/6 小鼠經過以電動

除毛刀除毛後之皮下，經過48 小時之後，取出注射部位細胞。將細胞均勻分散至

staining buffer，並以 PE/Dazzle™ 594- anti-CD45.2，PE-anti-CD11c，APC-anti-Ly6G 染色，加入7-AAD 區分死細胞，再使用 FACSAriaII 流式細胞儀進行分析與分選，

分選出CD11c⁺Ly6G^–樹突細胞與CD11c^–Ly6G⁺顆粒性白血球。注射L121-adj.小鼠之皮下注射部位可收得4.2×10⁵±1×10⁵個Ly6G⁺顆粒性白血球，以及

2.9×10⁵±0.2×10⁵個CD11c⁺樹突細胞；注射PBS 小鼠之皮下注射部位可收得 1.6×10⁴±0.4×10⁴個Ly6G⁺顆粒性白血球，以及1.2×10⁵±0.1×10⁵個CD11c⁺樹突細

(32)

20

胞。另外，OVA-specific CD8⁺T cells 是由 OT-I 小鼠而來。將 OT-I 小鼠的脾臟細胞加入rat anti- CD11b，rat anti-F4/80，rat anti-CD4，rat anti-Gr-1，rat anti-erythroid cell，

rat anti-MHC-II，rat anti-B220，rat anti-CD19 等抗體於 4 ℃標記 30 分鐘，清洗細胞，再加入Biomag® magnetic microbeads conjugated goat anti-rat IgG 抗體與之前加入的rat 抗體於 4 ℃結合 30 分鐘，之後使用磁座吸附非 CD8⁺ T 細胞之其他細胞，

以negatively selection 方式將 CD8⁺ T 細胞分離出來。將純化後之 CD8⁺ T 細胞使用 5 μM CFSE 於 37℃標記 10 分鐘(85)。之後將從注射 L121-adj.或 PBS 小鼠的注射部位分選出來的樹突細胞或顆粒性白血球，與5×10⁶個經CFSE 標記 OT-I CD8⁺T 細胞於PBS 內混合，以尾靜脈注射方式注射至CD45.1小鼠體內，經過3天後將 CD45.1 小鼠犧牲以分析OT-I CD8⁺T 細胞增生的情形。將脾臟細胞均勻分散於 staining buffer 內，並使用 PE/Dazzle™ 594-anti-CD45.2，Brilliant Violet 711™- anti-CD45.1，

APC-eFluor® 780-anti-CD8，eFluor® 450-anti-TCRVα2 染色，再加入 7-AAD 區分死細胞，並使用LSRFortessa 流式細胞儀進行分析。Division index 由 Flowjo 軟體分析計算。

3.15 體內去除顆粒性白血球後測量專一性細胞毒殺 T 細胞活性

為了測試顆粒性白血球對於L121-adj.產生毒殺 T 細胞活性的影響，此實驗中使用anti-mouse Ly6G (1A8)單株抗體來去除體內顆粒性白血球(73)。將 500 μg 之 1A8 抗體(調整至 500 μg/500 μl 溶於 PBS 中)從腹腔注射入 C57BL/6 小鼠體內，24 小時後，於第0 天與第 7 天皮下注射 100 μl 含 100 μg OVA 之 L121-adjuvant 或 PBS 於小鼠皮下。為了分析體內顆粒性白血球是否已經完全去除，於第1 天(注射 1A8 抗體48 小時之後)從小鼠頜下靜脈採血，以 APC-anti-Ly6G，PE-anti-Ly6C，

FITC-anti-CD11b 染色，並使用 LSRFortessa 流式細胞儀分析血液中的顆粒性白血球。為了測量細胞毒殺T 細胞活性，將標記 SIINFEKL 的 CFSE^high與未標記 SIINFEKL 的 CFSE^low之CD45.1 脾臟細胞經尾靜脈注射至注射過佐劑之小鼠體

(33)

21

內，20 小時後將小鼠犧牲取出脾臟以分析專一性細胞毒殺反應。另外，將脾臟細

胞用PE-anti-Gr-1，PerCP-Cy5.5-anti- CD11b，eFluor® 450-anti-Ly6C 染色，並使用 LSRFortessa 流式細胞儀分析脾臟中的顆粒性白血球。

3.16 分析 L121-adj.對骨髓、脾臟中 B 細胞與胸腺 T 細胞分化的影響

將100 μl 含 100 μg OVA 之 L121-adjuvant 於第 0 天與第 7 天注射至 C57BL/6 小鼠皮下，分別於第2, 4, 6, 8,10 天犧牲小鼠取出骨髓、脾臟與胸腺，以未經處理之小鼠做為第0 天控制組。

關於骨髓的分析，將骨髓細胞均勻分散至staining buffer 內，以 FITC-anti-CD43，Dump (包含 PE-anti-CD3，PE-anti-CD8，PE-anti-Gr-1，

PE-anti-F4/80)，PE-Cy7-anti-IgM，APC-anti-CD93，APC-Cy7-anti-IgD，Pacific Blue-anti-CD24，Brilliant Violet 605™-anti-B220，biotin-anti-BP-1 等抗體染色，再加入Brilliant Violet 650™-streptavidin，與 7-AAD 以區分死細胞，並使用

LSRFortessa 流式細胞儀分析。

關於脾臟的分析，將脾臟細胞均勻分散至staining buffer 內，以

PE-anti-CD21/35，PE-Cy7-anti-IgM，APC-anti-CD138，APC-Cy7-anti-IgD，eFluor®

450-anti-GL7，Brilliant Violet 605™-anti-B220 等抗體染色，再加入 7-AAD 區分死細胞，並使用LSRFortessa 流式細胞儀進行分析。

關於胸腺的分析，將胸腺細胞均勻分散至staining buffer 內，以

FITC-anti-CD8，PE-anti-CD44，PerCP-eFluor® 710-anti-CD4，PE-Cy7-anti-CD25，

APC-anti-CD24，eFluor® 450-anti-TCRβ chain，biotin-anti-CD5 等抗體染色，再加入Brilliant Violet 650™-streptavidin，與 fixable viability dye eFluor® 506 以區分死細胞，再以2 % paraformaldehyde 固定細胞，並使用 LSRFortessa 流式細胞儀分析。

(34)

22

3.17 骨髓腔內注射前驅 B 細胞後分析 L121-adj.對於前驅 B 細胞的分化的影響 取CD45.1 小鼠之骨髓細胞，以 Brilliant Violet 605™-anti-B220，

PE-Cy7-anti-IgM，PerCP-eFluor® 710-anti-IgD 等抗體染色，再以 FACSAria III 流式細胞分選儀分選出骨髓中B220^－IgM^－IgD^－之B 細胞前驅細胞(35)，以 PBS 清洗過後，以31G 針頭將 CD45.1 小鼠之 B 細胞前驅細胞注射至 CD45.2 小鼠之脛骨骨髓腔內，而CD45.2 小鼠則於骨髓腔注射前以 240 mg/kg 之 tribromoethanol 以腹腔注射麻醉。在骨髓腔注射後，再以100 μl 含有 100 μg OVA 之 L121-adj 或是 PBS 皮下注射，兩天後犧牲CD45.2 小鼠取出脾臟細胞，將脾臟細胞均勻分散至 staining buffer 內，以 FITC-anti-CD19，PE-anti-CD21/35，PE-Cy7-anti-IgM，Brilliant Violet 605™-anti-B220，PE/Dazzle™ 594-anti-CD45.2 與 Brilliant Violet 711™ -anti- CD45.1 染色後，再以LSRFortessa 流式細胞儀進行分析。

3.18 分析 L121-adj.對骨髓中血液幹細胞分化的影響

將100 μl 含 100 μg OVA 之 L121-adjuvant 於第 0 天與第 7 天注射至 C57BL/6 小鼠皮下，分別於第2, 4, 6, 8,10 天犧牲小鼠取出骨髓細胞，以未經處理之小鼠做為第0 天控制組。將骨髓細胞均勻分散至 staining buffer 內，以 FITC-anti-Sca-1，

PE-anti-lineage (lin) 包括以下抗體：(PE-anti-CD3，PE-anti-CD19，PE-anti-B220，

PE-anti-CD11b，PE-anti-Gr-1，PE-anti-NK1.1，PE-anti-CD11c，以及 PE-anti-Ter119)。

PerCP-eFluor® 710-anti-CD135，PE-Cy7-anti-CD127，APC-Cy7-anti-CD16/32，

eFluor® 450-anti-CD117 等抗體染色等抗體染色，再加入 fixable viability dye eFluor® 506 以區分死細胞，再以 2 % paraformaldehyde 固定細胞，並使用 LSRFortessa 流式細胞儀分析。

3.19 分析 L121-adj.對於 CLP 細胞分化能力的影響

為了測量CLP 細胞受到 L121-adj.刺激後分化的改變，將 C57BL/6 小鼠的骨髓

(35)

23

細胞取出，以FITC-anti-CD90.2，PE-anti-CD3，PE-anti-CD19，PE-anti-B220，

PE-anti-CD11b，PE-anti-Gr-1，PE-anti-NK1.1，PE-anti-CD11c，PE-anti-Ter119，

PerCP-Cy5.5-anti-Sca-1，APC-anti-CD127，APC-Cy7-anti-CD117 染色後，以 FACSAriaII 流式細胞分選儀分析，並分選出 Lin^－CD127+CD117^intSca-1^intCD90.2^－之CLP 細胞(18)，以尾靜脈注射至 CD45.1 小鼠，CD45.1 小鼠預先經過¹³⁷Cs 放射儀器 (IBL 637, CIS bio international)以 600 rad γ-放射線照射，再於皮下注射 100 μl 含有100 μg OVA 之 L121-adj.或是 PBS。之後於第二週開始每週由頷下靜脈採血以流式細胞儀分析。紅血球以RBC lysis buffer 去除後，以 FITC-anti-CD45.1，

PE-anti-B220，PE-Cy7-anti-CD3，PerCP-Cy5.5-anti-CD11b，APC-anti-CD45.2，

APC-Cy7-anti-CD8 染色，再以流式細胞儀 FACSVerse 分析。

3.20 以 ELISA 測量注射 L121-adj.後小鼠血液中 G-CSF 濃度

為了分析血液中G-CSF 受到 L121-adj.之影響，將 100 μl 含 100 μg OVA 之 L121-adjuvant 於第 0 天與第 7 天注射至 C57BL/6 小鼠皮下，分別於第 2, 4, 6, 8,10 天犧牲小鼠，以心臟採血，並且以未經處理之小鼠做為第0 天控制組，血液於 37

℃待凝血完成後，以2,000 g 離心一小時以去除血塊，取出血清後保存於 -80 ℃ (86)。血清中的 G-CSF 濃度以 G-CSF ELISA kit (Peprotech, 900-K103)測量，為 sandwich ELISA。方法依照廠商建議，簡述如下：將 capture antibody (polyclonal rabbit anti-mouse G-CSF)以 PBS 稀釋至 0.5 μg/ml，加入 ELISA 專用 96 孔盤(Nunc)，

於4 ℃吸附隔夜，以 wash buffer 清洗過後，加入 blocking buffer 於室溫放置一小時後再洗去，加入經過assay diluent 倍數稀釋的 G-CSF standard 與小鼠血清樣本，

經室溫吸附兩小時後以wash buffer 洗去，再加入以 assay diluent 稀釋至 0.25 μg/ml 之detection antibody (biotinylated polyclonal rabbit anti-mouse G-CSF)於室溫吸附兩小時後以wash buffer 洗去，再加入 avidin conjugated horseradish peroxidase (HRP)，

於室溫吸附30 分鐘後以 wash buffer 洗去，最後加入 tetramethylbenzidine substrate

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24

室溫反應10 分鐘後加入 1M H3PO4終止反應，以450 nm 讀取吸收值，並依 standards 計算血清中之G-CSF濃度。ELISA wash buffer 為 0.05% polyoxyethelene (20) sorbitan monolaurate 溶於 PBS 中。ELISA blocking buffer 為 1% BSA 溶於 PBS 中。ELISA assay diluent 為 0.1% BSA 與 0.05% polyoxyethelene (20) sorbitan monolaurate 溶於 PBS 中。

3.21 以小鼠血清體外培養 LSK、CMP、GMP 細胞與分析其分化 為了證明L121-adj.可透過血液調控影響血液幹細胞分化的影響，將 LSK(Lin^–CD127^–CD117⁺Sca-1⁺)、CMP(Lin^–CD127^–CD117⁺Sca-1^–

CD34⁺CD16/32^–)、GMP (Lin^–CD127^–CD117⁺Sca-1^–CD34⁺CD16/32⁺)細胞自 C57BL/6 小鼠以FACSAriaII 或是 FACSAriaIII 流式細胞分選儀分選出(20)，以含有 10% 注射過L121-adj.後第 2、4、6、8、10 天小鼠之血清與未經處理的小鼠血清的 RPMI 1640 培養基(另外加入 MEM NEAA 與 1 mM sodium pyruvate)培養 4 天後，以 stainging buffer 清洗，將細胞均勻分散至 staining buffer 內，加入 APC-anti- Ly6G，

PE-anti-F4/80，APC-Cy7-anti-CD11b，最後加入 7-AAD 去除死細胞，再以 LSRFortessa 流式細胞儀分析。

3.22 皮下注射部位切片組織免疫螢光染色以及細胞型態之顯微鏡觀察

為了觀察皮下注射部位中樹突細胞以及顆粒性白血球的細胞型態，將100 μlL121-adj.注射至 C57BL/6 小鼠皮下後第 2 天，取出皮下注射部位，以

PE-anti-CD11c 以及 APC-anti-Ly6G 抗體染色後，再加入 7-AAD 以區別死細胞，再以FACSAriaII 流式細胞分選儀分選出 Ly6G⁺CD11c^‐以及Ly6G^‐CD11c⁺細胞後，以 cytospin 4 離心機(Thermo Scientific)將細胞貼附於玻片上，並且以 Wright-Giemsa 染色，封片後以顯微鏡(Zeiss AxioImager. A1)觀察。

為了觀察皮下注射部位中樹突細胞以及顆粒性白血球的位置，將100 μl

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L121-adj.注射至 C57BL/6 小鼠皮下後第 2 天，取出皮下注射部位，以 OCT compound 包覆，冷凍保存，之後以冷凍切片機(LEICA, CM1900)切成厚度 10 μm 之薄片，貼附於玻片上後以4 % paraformaldehyde 固定三十分鐘，再以 10% goat serum 作為 blocking reagent 一小時，以 PBS 洗去之後加入一抗[包含 1:20 之 anti-chicken egg albumin antibody，1:100 之 armenian hamster anti-mouse CD11c 與 1:100 之 rat anti mouse Gr-1)於 4 ℃保存一夜，洗去之後再加入二抗(包含 1:100 之 Dylight 405 goat anti-armenian hamster IgG，1:20 之 TRITC goat anti-rabbit IgG 與 1:20 之 FITC goat anti-rat IgG)於室溫染色一小時後洗去，封片後以顯微鏡(Zeiss AxioImager. A1)觀察。

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26

第四章結果

4.1 注射含 L121-adj.與抗原 OVA 之疫苗能夠抑制 B16F10-OVA 黑色素細胞瘤之 生長，與延長小鼠存活時間

為了研究L121-adj.對於腫瘤細胞生長的影響，我們於 C57BL/6 小鼠背部皮下注射表現有OVA 抗原之 B16F10 黑色素細胞瘤，於 20 天後腫瘤生長期到達指數期 (約每兩天體積增長兩倍)，於腹側之皮下注射 100 μL 含有 100 μg OVA 抗原之 L121-adj.或是 PBS 作為控制組，一組各 5 隻小鼠。圖一(A)為小鼠腫瘤體積在 6 天之內的變化。於第0 天剛注射疫苗時，兩組之間的腫瘤大小並沒有差異，於第 2

天之後開始產生差異。注射PBS 之控制組小鼠未能產生對抗腫瘤之免疫能力，故

腫瘤以指數型生長；而注射L121-adj.之小鼠可以顯著性的延緩腫瘤細胞的生長，

證明與過去文獻所指出的有相同的抑制腫瘤細胞生長功效(5)。圖一(B)為小鼠存活率之變化，注射含有L121-adj.之組別在 6 天之內並無任何小鼠死亡;而注射 PBS 之組別在第4 天出現小鼠死亡的情形，進一步在第 6 天因為小鼠腫瘤體積過大(超過 4,000 mm³實驗終點基準值)，視為實驗終結點(5)。證明 L121-adj.可以讓小鼠產生對抗腫瘤之免疫反應。

4.2 注射含 L121-adj.與抗原 OVA 之疫苗能夠於一周之內產生抗原專一性之 T 細 胞毒殺免疫反應(CTL)

如圖一(A)所示，注射 L121-adj.與抗原 OVA 可在短時間內產生抑制腫瘤細胞

生長的效果，為了進一步證實此疫苗佐劑能夠產生抗原專一性之T 細胞毒殺免疫

反應，我們利用過去文獻所建立的測量方式(82)，使用帶有 SIINFEKL 且標定以 CFSE^high與不帶有抗原且標定以CFSE^low之CD45.1 脾臟細胞測量專一性細胞毒殺反應。於第0 天與第 7 天於 C57BL/6 小鼠皮下注射 100 μL 含有 100 μg OVA 抗原之L121-adj.，分別於第 2、4、6、8、10、12、14 天犧牲小鼠分析脾臟中 T 細胞毒

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27

殺的能力，以未經處理之小鼠作為第0 天控制組。結果表示於圖二(A)中，以曲線直方圖(histogram)呈現，其中 CFSE^high之細胞為帶有SIINFEKL 之細胞，可被抗原專一性毒殺T 細胞所辨認而殺死，數目減少越多代表毒殺能力越強，而標定 CFSE^low 之細胞則未經SIINFEKL 處理，不會被毒殺 T 細胞所殺，作為相對數量基準，以計算T 細胞毒殺能力。其中以第 6 天及第 12 天 CFSE^high細胞數目減少的最多，顯示有較好的細胞毒殺反應。

圖二(B)為四次獨立試驗計算統計之後的結果，含有 L121-adj.在注射後的第 0 天與第2 天無法測得任何 T 細胞毒殺反應，於第 4 天可測得 T 細胞毒殺比例至 10%

之微量反應(p=0.08)，於第 6 天達到 75%之尖峰值。然而在經過第 7 天注射第二針之疫苗佐劑，第8 天與第 10 天所測得之 T 細胞毒殺反應下降至 24%與 31%，可能為過度活化，導致細胞活性下降之暫時現象。然而在第12 天所測得之 T 細胞毒殺反應再度上升至75%之尖峰值，於第 14 天所測得之 T 細胞毒殺反應再度下降至 36%。以上結果與腫瘤生長實驗中的結果相符，顯示含有 L121-adj.之疫苗可在短

時間內產生抗原專一性毒殺T 細胞之免疫反應，並且抑制腫瘤細胞的生長。另一

方面，由以上結果我們發現，只要給予一劑L121-adj.與 OVA，就能於第 6 天產生高量的抗原專一性毒殺T 細胞反應，且毒殺性 T 細胞反應高峰期皆在注射疫苗後之第5 至第 6 天。

此外，為了進一步證明CD8⁺ T 細胞受到 L121-adj.的刺激而活化，我們取出注射100 μl 含有 100 μg OVA 之 L121-adj.或是 PBS 後第 10 天 C57BL/6 小鼠之脾臟，

加入SIINFEKL 於體外再活化，以及加入 brefeldin A 抑制細胞激素的分泌，之後以流式細胞儀偵測分析CD8⁺T 細胞之 IFN-γ，IL-2，granzyme B 以及 TCR-β，以證明CD8⁺T 細胞之活化，結果呈現於附錄圖一中。

(40)

28

4.3 注射 L121-adj.促使顆粒性白血球與單核細胞離開骨髓

為了分析L121-adj.對骨髓中細胞分化的影響。我們於第 0 天與第 7 天注射 L121-adj.與 OVA 於 C57BL/6 小鼠皮下，然後在第 2、4、6、8、10 天犧牲小鼠，

以未經處理之小鼠作為第0 天控制組，以流式細胞儀分析。圖三(A)為流式細胞儀分析骨髓中髓細胞之pre-gating 分析方法。首先以 FSC-A 及 SSC-A 選出主要細胞群，再以FSC-A 及 FSC-H 選出單顆細胞(single cells)，選出 7-AAD^－之活細胞以去除死細胞，再選出B220^－CD11b⁺髓細胞(myeloid cells)後，以 Gr-1 及 CD115 為軸，

分為三群細胞，分別為CD115^－Gr-1^high，CD115^lowGr-1înt，CD115^－Gr-1^－，其中 CD11b⁺Gr-1^highCD115^－為Ly6Cînt顆粒性白血球(granulocytes)。另外，Gr-1înt圈選出後，以Ly6C 及 CD115 為軸，可再分為三群細胞，分別為 CD11b⁺Gr-1întLy6C^high CD115^low，CD11b⁺Gr-1întLy6CîntCD115^－，CD11b⁺Gr-1întLy6C^－CD115^－等三群細胞，

其中CD11b⁺Gr-1^intLy6C^high CD115^low為單核細胞(monocytes) (87)。

圖三(B)為以 Gr-1 及 CD115 分析骨髓中 7-AAD^－B220^－CD11b⁺髓細胞。注射 L121-adj.後第 2 天 CD115^－Gr-1^high顆粒性白血球大量減少，在第4 及第 6 天回復正常值，經過第7 天第二次注射 L121-adj.後，於第 8 天顆粒性白血球再度大量減少，

於第10 天再度回升。

圖三(C)為以 Ly6C 及 CD115 分析骨髓中 7-AAD^－B220^－CD11b⁺Gr-1^int細胞。

注射L121-adj.後，Ly6C^high CD115^low單核細胞與顆粒性白血球有類似的變化，於第 2 天及第 8 天暫時性減少。

圖三(D)為加入 microbeads 作為 internal control，計算細胞絕對數量，經統計分析呈現骨髓中CD11b⁺CD115^－Gr-1^high顆粒性白血球在注射L121-adj.後，隨時間的細胞數量變化。顯示在第2 天及第 8 天顆粒性白血球暫時性減少後，於第 4、6、

10 天會產生代償性的增加。

圖三(E)為 CD11b⁺Gr-1^intLy6C^high CD115^low-neg單核細胞細胞數目隨時間的變化，與顆粒性白血球相似，於第2、8 天注射 L121-adj.後暫時減少。

(41)

29

圖三(F)為 CD11b⁺Gr-1întLy6Cînt細胞數目隨時間的變化，與顆粒性白血球與單核細胞受到L121-adj.刺激於第 2、8 天減少不同，CD11b⁺Gr-1întLy6Cînt細胞反而在注射L121-adj.後短期內於第 2、8 天增加，於 4、6 天減少，恰好與顆粒性白血球與單核細胞之變化相反。此外，於附錄圖二中，我們將CD11b⁺Gr-1întLy6Cînt細胞自骨髓中以流式細胞分選儀分選出來後以Wright-Giemsa染色後以顯微鏡觀察細胞型態外觀，發現CD11b⁺Gr-1întLy6Cînt細胞為meta-myelocyte 為顆粒性白血球的前驅細胞(88)。此外，以含有 10 ng/ml GM-CSF 以及 10% FBS 之 RPMI 培養基培養 CD11b⁺Gr-1întLy6Cînt細胞後四天，再次以Wright-Giemsa 染色觀察細胞型態外觀，

證實可以分化為顆粒性白血球。顆粒性白血球於注射L121-adj.後第二天的減少，

與meta-myelocyte 的增加相關，顯示 meta-myelocyte 之增加為代償性反應，導致注射L121-adj.後第 4、6 天顆粒性白血球的增加。

CD11b⁺CD115^－Gr-1^－以及CD11b⁺Gr-1^intLy6C^－CD115^－兩群細胞的數目則沒有受到L121-adj.刺激的影響而有明顯改變，故呈現於附錄圖三中。

4.4 注射 L121-adj.促使脾臟中顆粒性白血球增加，並且表現出 F4/80 表面抗原 為了證明骨髓中的顆粒性白血球受到L121-adj.刺激後，會離開骨髓移動到脾臟中，除了分析骨髓中的顆粒性白血球之外，我們亦分析脾臟中的顆粒性白血球。

圖四(A)為以 Ly6G 及 CD11c 分析注射 L121-adj.後第 2 天及第 3 天脾臟中顆粒性白血球(Ly6G⁺)與樹突細胞(CD11c⁺)，注射 L121-adj.使脾臟中顆粒性白血球大量增加，與注射PBS 及 OVA 之控制組相比，第 2 天的顆粒性白血球由 1.79%上升至 5.11%，第 3 天則略降至 3.87%，脾臟中顆粒性白血球的增加與骨髓中顆粒性白血球的減少相符，證明注射L121-adj.會使顆粒性白血球快速的由骨髓轉移至脾臟中。L121-adj.除了使脾臟中的顆粒性白血球增加之外，亦改變顆粒性白血球分化的改變。

圖四(B)為以 CD11b 及 F4/80 分析脾臟中 Ly6G⁺CD11c^－顆粒性白血球之代表

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圖，顆粒性白血球皆為CD11b⁺，注射PBS 與 OVA 之控制組顆粒性白血球表現少量F4/80 表面抗原，然而在注射 L121-adj.與 OVA 之後的第 2 天及第三天，顆粒性白血球開始提升表現F4/80 表面抗原。

圖五(A)為以 Ly6G 及 CD11c 分析離疫苗注射部位最近的腹股溝淋巴結 (draining lymph node)中的顆粒性白血球與樹突細胞，顆粒性白血球在淋巴結中相當稀少，即使注射L121-adj.後第 2 天及第 3 天也未見增加。

圖五(B)中為以 CD11b 及 F4/80 分析淋巴結中顆粒性白血球的分化改變，與脾臟中的顆粒性白血球有相同的變化，注射PBS 與 OVA 之控制組當中的顆粒性白血球不表現F4/80 表面抗原，然而在注射 L121-adj.後第 2 天及第 3 天，顆粒性白血球表現出F4/80 表面抗原。證明 L121 疫苗佐劑除了影響顆粒性白血球使之轉移到脾臟及局部注射位置之外，並使之分化改變。

4.5 注射 L121-adj.增加顆粒性白血球與樹突細胞的輸送抗原至淋巴結中

為了瞭解L121-adj.對於抗原於體內分布的影響，將標定有 FITC 螢光之 OVA 抗原，與L121-adj.或是 PBS 混和，皮下注射至 C57BL/6 小鼠，並且於第 2 天與第 3 天分析腹股溝淋巴結中的樹突細胞與顆粒性白血球是否有吞噬帶有 FITC 螢光的 OVA。圖六(A)為淋巴結中顆粒性白血球注射含有 FITC 標定之 OVA 後第 2 天與第 3 天，分析帶有 FITC 螢光之顆粒性白血球的比例，以未經處理不帶螢光之小鼠細胞作為FITC 螢光判斷基準。注射 L121-adj.後的顆粒性白血球帶有較高比例的 FITC 螢光，證明L121-adj.會增加顆粒性白血球吞噬抗原的能力。而注射 PBS 的組別，

則幾乎沒有顆粒性白血球帶有FITC 螢光。

圖六(B)為淋巴結中樹突細胞帶有 FITC 螢光的比例，以未經處理不帶螢光之小鼠細胞作為FITC 螢光判斷基準。注射 L121-adj.會增加樹突細胞帶有 FITC 螢光的比例，證明L121-adj.會增加樹突細胞吞噬抗原的能力。顆粒性白血球與樹突細胞相比，注射L121-adj.後顆粒性白血球有較高的抗原吞噬能力，於第 2 天達到