I
國 立 臺 灣 科 技 大 學 化 學 工 程 系
專題報告
學號︰B9906037
多功能磁性奈米微粒製備與生物應用
專 題 生 : 陳佳宏
指 導 教 授 : 張家耀 博士
民國 一百零二年 十月
II
摘要
此研究依醫學影像分析顯影科技發展方向，主要來作為開發雙功能顯影劑上 的材料開發及結合核磁影像與光學造影技術的生物應用。以氧化鐵磁性微粒為主 軸利用進行多功能顯影劑的合成、鑑定與應用
以簡單的熱分裂法合成出10nm±1nm 粒徑大小的氧化鐵(Fe3O4)為顯影劑中 心，利用兩性高分子(PMAO)包覆形成水相氧化鐵，接著利用 EDC/NHS 系統與 1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷進行表面官能化，最後再利用 EDC/NHS 系統螯合 DTPA-Gd 以及簡單的 NH2與NCS 鍵結關係鍵結異硫氰酸鹽羅丹明，成功開發多 功能顯影劑，並且針對此顯影劑進行光學、磁性鑑定，確認此構想能夠符合預期。
在應用研究上，為了符合多功能的顯影劑目的，我們分別利用此顯影劑進行細胞 光學造影實驗及核磁共振造影MRI 的 T1、T2 影像測試，並且在細胞光學造影 的實驗中，發現了部分的顯影劑能夠被細胞吞噬並且發出紅光，達到細胞顯影的 功能；而在核磁共振造影的部分上，能夠得到了正向顯影結果與負向顯影結果，
以上實驗結果證實了這一串實驗的可行性。
III
總目錄
第一章、 緒論...1
1-1 前言...1
1-2 研究動機與內容...2
第二章、 理論基礎與文獻回顧...4
2-1 奈米材料之基本性質...4
2-1-1 小尺寸效應(Small Size Effect) ...4
2-2 磁性基本特性...5
2-2-1 順磁性(Paramagnetic)物質...5
2-2-2 反磁性(Diamagnetic)物質...5
2-2-3 鐵磁性(Ferromagnetic)物質...6
2-2-4 反鐵磁(Anti-ferromagnetic)物質...6
2-2-5 陶鐵磁性(Ferrimagnetic)物質...6
2-2-6 超順磁性(superparamagnetic)物質...7
2-3 磁性奈米微粒之合成方法...7
2-3-1 化學共沉澱法...7
2-3-2 水熱法...8
2-3-3 微胞法與溶膠凝膠法...8
2-3-4 熱分解法...8
2-4 磁性顆粒的表面改質及功能化...9
2-4-1 表面改質及功能化在奈米顆粒上之必要性...9
2-4-2 兩性高分子包覆法(Encapsulation amphiphilic polymer) ...14
2-5 奈米顆粒在生物影像的應用與文獻回顧...17
第三章、 實驗方法...20
3-1 實驗藥品與氣體...20
3-2 實驗儀器...22
3-3 實驗步驟...23
3-3-1 Fe3O4磁性奈米微粒合成...23
3-3-2 Fe3O4磁性奈米微粒與聚 1-十八烯馬來酸酐(PMAO)之表面改質...23
3-3-3 Fe3O4/PMAO 磁性奈米微粒之表面官能基化...23
3-3-4 Fe3O4/PMAO-NH2磁性奈米微粒螯合 DTPA-Gd...24
3-3-5 Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA-Gd/RBITC 磁性奈米微粒之合成...25
3-3-6 核磁共振光譜儀 MRI 測定參數...25
第四章、 結果與討論...26
IV
4-1 實驗設計...26
4-1-1 氧化鐵磁性微粒特性分析...27
4-1-2 兩性高分子包覆氧化鐵表面改質分析...28
4-1-3 雙功能超順磁性氧 4-1-3 雙功能超順磁性氧化鐵顯影劑光學與磁性分析...29
4-2 雙功能顯影劑在生物上的應用....30
4-2-1 核磁共振 MRI 顯影效果...30
4-2-2 在生物影像的應用...32
第五章、 結論...34
第六章、 文獻參考...35
V
圖目錄
Figure 2.1. 在生醫應用方面多種量子點的表面改質方法...10
Figure 2.2. 奈米材料功能化意示圖...12
Figure 2.3. 一般常見奈米材料與生物分子生物鍵結示意圖...13
Figure 2.4. 嵌段式共聚高分子包覆法示意圖...14
Figure2.5 (A)磷脂質高分子；(B)三酸甘油脂高分子。...15
Figure 2.6. (A)PMAO-PEG 之兩性高分子；(B)水溶性量子點示意圖...17
Figure 2.7. 核磁共振成像原理圖及顯影劑功能示意圖...19
Figure4.1 光學及核磁共振雙功能磁性奈米微粒顯影劑組裝示意圖...26
Figure4.2 氧化鐵合成示意圖...27
Figure4.3 磁性奈米微粒...27
Figure4.4(a)氧化鐵包覆 PMAO 示意圖和(b)PMAO 利用 NaOH 進行開環反應..29
Figure4.5 PMAO 改質結果...29
Figure4.6(a)氧化鐵顯影劑的吸收光譜與螢光光譜圖(b)照射紫外光燈前後對照示 意圖...29
Figure4.7 氧化鐵經表面改質後的磁力性質...30
Figure4.8a)T1影像與(b)T2影像，(c)T1倒數與濃度座標圖，(d)T2倒數與濃度座 標圖...32
Fiugre4.9Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA-Gd/RBITC 於 Hela 癌細胞經共軛焦雷射顯 微鏡擷取之影像...33
VI
表目錄
Table4.1 核磁共振光譜儀在不同濃度下所測得弛緩時間...31
1
第一章、緒論 1-1 前言
在二十世紀末由於掃描隧道顯微鏡(STM)的發明，開啟科學另一個新的世 代，使得奈米科學與技術在二十世紀末至今進入一個迅速發展的科技。在二十一 世紀的今天，奈米科學與奈米技術將不再只活躍於學術研究的領域中，而會密切 的與人們的生活息息相關，被廣泛應用於電子產業以及生物科技產業上。
奈米生物科技是一整合性的新興學門，須結合生物醫學、材料科學、化學工 程之技術，以奈米技術製造出奈米材料，利用奈米材料作為運輸載體，使得易進 入生物系統，方便正確到達標的物，再利用生物醫學技術搭配生物高分子、藥物，
使得材料具有生物相容性或治療性，而可藉由此材料之複合特性進行疾病治療、
病理追蹤、藥物釋放、基因篩選、釐清目標，再藉由微機電系統、光電判斷、神 經分析、磁性感測，來達到醫療診斷、療效追蹤、生物偵測、分子造影。因此透 過奈米生物材料的治療，不僅改善因尺寸侷限的醫療技術，也在醫學臨床上多了 新的選擇，而造成奈米科技在生物醫學上被熱烈的關注。奈米生物科技的應用，
依功能大概可分為三大類：(1)仿生物材料；(2)診察分析；(3)治療。
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1-2 研究動機與內容
在 奈 米 醫 學 診 療 中 ， 其 診 療 科 技 發 展 有 核 磁 共 振 造 影(MRI，Magnetic resonance imaging) 、 正 子 放 射 顯 微 斷 層 掃 描 儀 (positron emission tomography,PET)、電腦斷層掃描儀(computed tomography，CT)、螢光標記…等，
以上診療方式皆伴隨著顯影劑存在，經由靜脈血管注射顯影劑，透過血液循環到 達欲檢查的組織，經由影像的呈現達到診斷目的，顯影劑在人體攝取的過程中，
必造成身體上的負擔、後遺症及副作用，所以如何降低人體負擔及副作用為顯影 劑一大重點，且顯影劑在不同檢測的方法所產生的性質也有所不同，例如：MRI 利用顯影劑的順磁性質改變生物水分子的弛緩時間(Relaxation Time)的差異性達 到顯影；PET 偵測顯影劑所放射出的加馬射線(gamma-ray)來形成 3D 的影像等，
其每種檢測方式皆有其優約點及檢測限制，藉由不同醫學診療分析儀器的相互搭 配，能夠快速及正確的診療。但患者如果需要兩種以上診療時，在經過一診療後，
通常需要一段時間來讓身體代謝排出顯影劑，而無法進行下一階度的診療，造成 患者的病情拖延，因此發展多功能性顯影劑的重要性不可言喻。
核磁共振造影(MRI)是一種非侵入式的技術，能將人體的精細結構呈現出來 的一種技術[1]。為了得到較清晰的MRI顯影，通常使用能影響縱向(T1)或橫向(T2) 弛緩時間的物質來當顯影劑，例如順磁性的金屬釓離子(Gd3+)能影響附近水分子 中質子和誘導局部弛緩現象，能夠降低T1的弛緩時間得到正向顯影(影像較亮)，
但缺點在於其在血管系統中存在一個相對較短的停留時間[2]；而擁有超順磁性的 奈米磁性微粒由於擁有強大縮短T2弛緩時間，進而得到超靈敏性的負向顯影(影 像較暗)能力，能夠在體內停留較長時間，已被廣泛使用作為追蹤幹細胞、腫瘤 和早期發現癌症的造影劑[3-5]，但缺點在於其負向顯影容易與原本暗色的區域作 混淆，造成顯影上的障礙。以上兩種技術各有其獨特的優勢與缺點，若能將兩者 合而為一，則釓離子的停留時間能夠獲得改善，而奈米磁性微粒的T2影像混淆能 夠利用T1影像上的對照而獲得解決，那麼就能獲得一種同時擁有T1、T2的雙功能 顯影劑。
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此研究主要以發展多功能超順磁性氧化鐵顯影劑作為主軸，利用四氧化三鐵 (Fe3O4)磁性奈米微粒作為顯影劑核心，利用兩性高分子 PMAO 包覆 Fe3O4，使其 表面擁有大量的親水性羧基以達到水溶性磁性奈米微粒之目的，並利 1,2-雙(2‐
氨基乙氧基)乙烷作為交聯劑對水溶性磁性奈米微粒進行表面官能化，再利用 EDC/NHS 交聯系統作為基礎，將磁性奈米微粒同時與釓離子錯合物及螢光染料 進行結合；其釓離子錯合物為順磁性物質，可與四氧化三鐵同時應用於核磁共振 造影中，使得顯影功能更加顯著。而螢光染料可使得磁性奈米微粒運用於生物螢 光顯影上。
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第二章、理論基礎與文獻回顧 2-1 奈米材料之基本性質
隨著時代的進步，人們所使用的材料也從微米(μm)進入了奈米(nm)的世代，
而奈米材料主要定義是三維空間中，其中一為須小於奈米尺寸稱之，然而，奈米 材料依緯度主要可分成零維結構(X,Y,Z 軸皆小於 100nm)、一維結構(X,Z 軸小於 100nm，Y 軸大於 100nm)、二維結構(Z 軸小於 100nm，X,Y 軸大於 100nm)和三 維結構(X,Y,Z 軸皆大於 100nm)。然而，當粒子小至奈米尺度時，會產生特殊的 物理及化學效應，其光學、電學、磁學、力學、熱學也有顯著的變化，因而具備 了一般材料所沒有之性質，因而能夠廣泛運用於醫學、光電、電子等眾多領域之 中。
2-1-1 小尺寸效應(Small Size Effect)
奈米材料具備極小之特性，而隨著材料尺寸量變，在特定條件下(當材料粒 徑小至和光波波長、德布羅衣波長(De broglie wavelength)、超導態的相位相干長 度(Phase coherent length)會產生性質的質變，造成晶體週期性之邊界條件被破 壞，使非晶態奈米粒子的顆粒表面原子密度產生變化，因而改變了奈米材料的 光、電、磁、熱、聲及化學特性，而此效應就稱之為小尺寸效應。
光學特性：
當尺寸小於光波波長尺寸時，因反射率變低，導致材料無法反射光波，因而 失去原有色澤，呈現黑色。利用此特性，可做為高效率光電轉換材料。
磁學特性：
奈米粒子因小尺寸效應，因而磁性和一般磁性塊材相比擁有較優越性能，當 粒子大小小至20nm，磁區由多磁區轉變成單磁區，矯頑力(coercive force)明顯增 加，這一類的材料可用來當作高密度的磁紀錄磁粉，當粒子大小進一步減到奈米
5
等級，因矯頑力降至0，因而呈現超順磁性，而此材料可作為良好的軟磁材料。
熱學性質：
因為小尺寸效應，導致奈米級之材料溶點比一般塊材溶點還低，且隨著尺寸 越小，其材料熔點越低，利用這些性質，可以將材料進行低溫燒結，可降低成本，
並且用於不耐高溫之材料、玻璃基材。且奈米微粒在低溫時，其熱阻很小，熱導 性極佳，可作為低溫導熱材料。
2-2 磁性基本特性[6]
將物質置於外加磁場H 時，其磁化強度 M 將產生變化，兩者之關係可表示為：
M = χH ；χ 為物質磁化率(magnetic susceptibility)，其表示物質被磁化之難易程 度，物質依磁化率大小可分為五類。
2-2-1 順磁性(Paramagnetic)物質
順磁性物質在未受磁場影響下，每原子內部磁矩為散亂分佈，其淨磁矩為 零。所以對外無法顯示出巨觀的磁性；但當有外加磁場時，每個各別的磁偶極矩 受到一力矩作用，而使其朝磁場方向轉動排列。順磁性物質多與溫度T有密切關 係，遵守χ= C/T (Curie Law) C:居禮常數，T為絕對溫度。當升高溫度，熱擾動之 動能會增加，導致原子磁矩的方向不易轉成與外加磁場同方向，因此在固定磁場 下，磁化率與溫度成反比。常見顯現順磁性的導電金屬如銅(Cu)，銀(Ag)，金(Au) 等材料。
2-2-2 反磁性(Diamagnetic)物質
反磁性物質的淨磁偶極矩為零，電子軌道和自旋運動所造成的磁偶極矩的平 均總和為零。當材料受到外來磁場作用，外加磁場使得物質電子軌道運動產生改 變的連帶效應，因而會感應出與磁場一反向的淨磁偶極矩。反磁性一般都非常微 弱，其磁化率< 0，且磁化率與磁場、溫度皆無關係。所有材料都具有反磁特性，
常見之導電金屬如銅(Cu)，銀(Ag)，金(Au)等材料。
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2-2-3 鐵磁性(Ferromagnetic)物質
鐵磁性材料在未受外加磁場影響之下，內部之原子磁矩排列整齊且方向一 致，但各單一磁區內原子磁矩雖排列一致，可是每個磁區的排列方向卻不一定同 向，所以總磁矩仍然為零；但此類物質受到外加磁場時，只需在很小的磁場作用 下，鐵磁物質之特性就能夠表現出來了。物質的磁性現象存在一個臨界溫度，在 此溫度之上，鐵磁性會消失而變成順磁性，在此溫度之下鐵磁性才會保持。具有 鐵磁性的元素不多(Fe、Co、Ni)，但具有鐵磁性的合金(如Nb-Fe-B)和化合物(如 龐磁阻化合物)卻各式各樣。
2-2-4 反鐵磁(Anti-ferromagnetic)物質
反鐵磁性也屬弱磁性，與順磁性同樣顯示一小正磁化率，但溫度對磁化率的 影響有明顯特徵，反鐵磁性物質有一臨界溫度T，T稱為Neel溫度，當溫度大於 Neel溫度時，其磁化率與溫度的關係與順磁性物質相似，溫度高於TN 磁矩會因 受熱擺脫晶格排列與磁矩間作用力之限制，磁矩則成散亂排列，滿足Curie-Weiss Law；當溫度小於Neel溫度時，磁矩成逆平行排列，正向與反向磁矩彼此相抵消，
磁化率隨溫度下降而變小，並逐漸趨於穩定值，所以反鐵磁性物質在溫度剛好等 於Neel溫度時，磁化率為最大值。
2-2-5 陶鐵磁性(Ferrimagnetic)物質
陶鐵磁性物質在受外加磁場影響下，所表現出的巨觀磁性與鐵磁性物質相 當，只是磁化率的數量級低於鐵磁性物質的磁化率，但其內部的磁矩結構則與反 鐵磁性物質相同，只是反相排列的磁矩大小並不相等，所以陶鐵磁性兩相反之磁 矩互相抵消後僅剩鐵磁性。陶鐵磁性物質當溫度升高時磁矩排列逐漸變亂，使得 自發磁化減少，當達Curie溫度時磁矩的排列完全散亂，自發磁化隨之消失。溫 度高於Curie溫度則呈現順磁性關係，磁化率之倒數隨溫度變化曲線在高溫部分 呈現很好的線性關係，直線延長線相交於絕對溫度軸之負值。表陶鐵磁性與反鐵
7
磁性有密切關係。陶鐵磁性物質中常見的有：Fe3O4、FeO、Fe2O3磁鐵礦。
2-2-6 超順磁性(superparamagnetic)物質[7]
有晶粒的鐵磁性的固體的磁性與其晶粒度有關。晶粒度越小，每個晶粒內的 外斯疇的數量就越少。晶粒度小於一個閾值後每個晶粒只有一個外斯疇，因為這 樣晶體內的能量最低。在這種情況一個晶粒內所有的原子的磁矩均指向同一方 向。假如晶粒繼續縮小到一個閾值以下的話在絕對零度以上熱運動會破壞鐵磁 性，一個晶粒中的所有原子無法將其總磁矩指向同一方向。整個固體呈順磁性，
但是這個順磁性有一個特殊點：指向外部磁場的磁矩的數量與外部磁場的強度不 呈正比，其數量塊狀增加。這個不尋常的順磁性被稱為超順磁性。Fe3O4一般呈 鐵磁性，但是顆粒小於20 至 30 奈米的磁鐵礦在室溫下呈超順磁性。在外部磁場 的影響下其所有磁矩均順磁場方向排列。但是在外部磁場消失後熱運動足以使其 粒子的磁化消失為零。
2-3 磁性奈米微粒之合成方法
隨著對於開發功能材料 (functional material) 的需求日漸增加，諸如：磁誘 導分離[8]、磁誘導熱交換[9]及核磁造影等。磁性奈米粒子的合成方法也日漸引起 研究人員的重視。物質的磁性與其晶體尺寸及缺陷分佈有顯著關係，當粒子尺度 與平均磁域相近時，每個磁性粒子可視為僅由單一磁域構成。未受強磁場誘導 時，順磁性材料粒子的磁域方向因隨機分佈。磁性的交互作用僅限於相鄰粒子間 而整體呈現類似軟磁材料，此一特性稱為超順磁性 (superpamagnetism)。[10] 氧 化鐵奈米粒子的另外一個優點是生物相容性，相較於其他磁性材料具有低毒性的 優點。以下簡單介紹幾種合成方法。
2-3-1 化學共沉澱法
共沉澱法為目前最為普遍使用的合成方法，其合成方法是將二價鐵離子或是 三價鐵離子溶於水或鹽酸溶液中，再加入鹼液調整溶液的酸鹼值，使鐵離子產生
8
水解，並同時灌入高純度氮氣以避免四氧化三鐵進一步氧化成三氧化二鐵。其一 般採用化學共沉澱法包括三種模式，第一種是將二價鐵離子以及三價鐵離子以適 當比例一同溶於水溶液當中，一般常用比例為一比二進行混合。第二種方法則是 單純加入二價鐵離子，加入氧化劑形成三價鐵離子。將二價鐵離子水溶液氧化生 成三價鐵離子，在鹼性環境下，二價鐵離子會有自催化反應，在水溶液中形成 Fe(OH)2與Fe(OH)3形式之化合物。第三種為利用還原劑還原三價鐵離子，讓Fe3+
溶液在鹼性環境當中進行水解，形成錯合物FeOOH。
雖方法略有不同，但基本方式仍是靠氧化還原的方式產生氧化鐵奈米微粒。
但由於氧化還原方式，其反應程度受限於氧化、還原劑的能力以及反應時間，因 此鐵氧化物的氧化數也會隨之影響，所以欲合成高純度的四氧化三鐵奈米微粒，
需要有嚴謹的合成條件。
2-3-2 水熱法
水熱法是泛指利用高溫高壓的溶劑促使先驅物熱裂解形成微粒的方法，由於 溫度及壓力於臨界點範圍，水的介電常數、密度及氧化力呈現顯著改變。另一方 面，水具有低毒性且回收處理技術成熟的優點。因此經常用以製備金屬氧化物粉 體。
2-3-3 微胞法與溶膠凝膠法
本方法利用水、油與界面活性劑三元體系形成之混合溶液，其中界面活性劑 做為不相溶的水油間橋樑，而量少的部分會形成微胞，再調整混合溶液當中水相 及油相的比例，可調整微胞的大小與形狀。因微胞即為一小型的反應器，調整微 胞大小，便可調整奈米粒子的大小。
2-3-4 熱裂解法
熱裂解法之合成概念，是將金屬有機前驅物、界面活性劑及具有高沸點的有
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機溶劑於高溫的惰性氣體環境中產生分解還原反應，通常加熱至約300℃以上的 溫度，使有機金屬前驅物分解產生單體，再循序漸進的產生成核反應、長晶反應，
其界面活性劑在反應當中扮演包覆晶體，溶劑的比例有著重要的關係，隨著比例 的不同，能影響粒子粒徑的大小，對反應具有一定影響性。其優點在於生成的粒 徑大小能夠通過溫度以及溶劑的比例而達到有效控制，並且相當均一性。因其多 為非極性製程，不適用於生醫方面。
2-4 磁性顆粒的表面改質及功能化
2-4-1 表面改質及功能化在奈米顆粒上之必要性 一. 表面改質之必要性
由於所選擇製作磁性奈米微粒的方法，屬於非極性製程，使得磁性奈微粒不 溶於水溶液當中，與生物系統不相容，所以當磁性奈米微粒應用於生物系統時，
科學家需在磁性奈米微粒表面創造出極性的物質，現今表面化學的科學領域發展 了許多方法。如下Figure2.1 表示。其中這些方法中，主要可分為三大類。(I)配 位體交換(ligand exchange):主要涉及到原本在粒子表面上的疏水性分子，被置換 成親水端分子，通常利用較強親和力的硫、磷鍵或其他功能性分子去做置換，使 得原本在表面的疏水分子還原出來，含有硫醇鍵分子有mercaptoacetic acid [11]、 dithiothreitol[12]及dihydrolipoic acid [13]，雙功能性的生物分子也能提供水溶性及 辨識性，例如oligomeric phosphines[14]、dendrons[15]和peptides[16]；(II)兩性高分 子包覆(encapsulation amphiphilic polymer):因兩性高分子本身具有疏水性分子及 親水性分子及長碳鏈的延伸，利用高分子間的凡得瓦爾力或化學反應，則高分子 上的非極性與在顆粒表面的非極性分子交互吸引、吸附，使得極性分子裸露表 面，讓顆粒能夠溶解於水溶液中。通常這種有機包覆的方法，皆利用高分子、微 胞(micelle)、硫醇作為與表面分子連接；另一種方法為(III)氧化矽包覆:利用無毒 性氧化矽做為表面介質，塗布於顆粒表面。內部可分為溶膠凝膠法(Stöber method) 以及逆微胞(reverse microemulsion)氧化矽修飾奈米顆粒兩種方法。
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Figure 2.1. 在生醫應用方面多種量子點的表面改質方法[17]
11
二. 功能化必要性
磁性奈米微粒為了能進一步應用在生物體上，除了能夠具有水溶性的的表 面，與生物系統相容之外，通常需要與其他生物分子做特異性的共軛鍵結，這些 生物分子的功能最主要能夠賦予磁性奈米微粒本身之外的性質，例如:標識性、
藥物釋放、貼附性、照相及偵測性，如下Figure2.2.[18]所示，利用不同生物分子 提供顯影劑額外功能，圖中顯影劑B 利用 S.P 做為修飾表面的分子，讓顯影材料 B 可溶解於極性溶劑，當顯影劑 B 修飾 B、R 分子時，使得顯影劑 B 有標記作用，
藉由顯影劑B 散發磁性，顯影特定組織，DNA 序列標示或標靶腫瘤；則當顯影 劑B 嫁接上 Q 分子時，因 Q 分子具有吸收螢光性質，致使抑制顯影劑 B 所散發 的螢光，如果系統中有某些酵素存在，使得Q 分子與顯影劑 B 之間的鍵結斷裂，
此種機制類同於FERT，讓磁性奈米微粒具有偵測酵素或蛋白質的功能；而 D 分 子具有螯合同位素或釓的能力，由於此螯合分子就能提供此顯影劑B 具有放射 性或磁性的性質，就整體而言，可搭配其他醫學檢測方法，例如核磁共振儀(MRI) 或單光子放射顯微電腦度層掃描儀(single photon emission computed
tomography ,SPECT)等儀器偵測螯合分子 D 的磁性或放射性，達到具有雙功能造 影性的顯影劑。
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各種生物分子相一系列的工具一樣，藉由嫁接的技巧，賦予額外的功能在單 調的顯影劑，使得顯影劑更具靈活性。由此可見，表面化學工程在奈米生物科技 扮演一個關鍵的角色，不僅可改變材料表面之性質，提供奈米顆粒在不同環境中 的穩定性，亦協調生物分子與奈米顆粒結合的引導媒介，讓奈米顆粒可以參與生 物反應過程。現今，有幾種方式可以提供顯影劑跟生物分子做特異性鍵結，如下 Figure2.3.所示。
B:磁性材料 S:溶解(極性)分子 solubilization sequence P:聚乙二醇(PEG) B:生物素(biotin)
R:核酸辨識序列(peptide recognition sequence) Q:抑制分子(quencher) X:其他非特異性核酸序列
D: 雙官能基螯合物 ( 1,4,7,10‐tetraazacyclododecane‐1,4,7,10‐tetraacetic acid，DOTA) Figure 2.2. 奈米材料功能化意示圖[18]
13
Figure2.3.A 為常見的特異性鍵結，通常生物分子表面官能基只要具有胺基 端，且欲交聯奈米材料表面官能基有羧酸端，利用NHS 與 EDC 活化羧酸官能基，
在與胺基產生反應，形成胜肽鍵，此形式胺基-羧酸配對，可能讓奈米材料表面 鍵結許多生物分子，甚至產生聚集；另一種型式胺基-硫醇交聯官能基型式，利 用SMCC，去做反應交聯，當胺基-硫醇之間的連結媒介[19]，與Figure2.3.A 不同 處，EDC 與 NHS 在反應之後，並不會存在於鍵結上面，如 Figure2.3.B；除了 A、
Figure 2.3. 一般常見奈米材料與生物分子生物鍵結示意圖
14
B 所提供的在 Figure2.3.C 部分如前面文章表面改質必要性所提及的概念差不 多，利用polyhistidine (HIS)本身硫醇鍵對金屬原子的強親和性，取代掉原本在量 子點的配位體與表面殼層的金屬原子做鍵結；此外還有不需經過化學鍵結的破 壞，利用物理性質的觀念做鍵結，表面的有機殼層提供電荷與適體(adaptor)產生 電荷吸引力而形成鍵結，最後功能化的抗體藉由耦合於適體上，如Figure2.3.D 所示。
2-4-2 兩性高分子包覆法(Encapsulation amphiphilic polymer)
Figure 2.4. 嵌段式共聚高分子包覆法示意圖[20]。
兩性高分子同時具有疏水端及親水端之長鏈狀分子，此雙功能性之高分子與 材料表面做物理吸附或化學鍵結後，使材料被高分子包覆在內而外觀成為親水端 之分子，並不會如表面配體交換而喪失本身材料的性質，且可維持與保護物理及 化學特性的表現；目前對於高分子結構之包覆可分為兩種，一為磷脂質微胞法 (Phospholipid micelles)：如 Figure2.5 所示，磷脂質共聚物以甘油為主支架，帶有 兩個脂肪酸、一個磷酸及一個含氮鹼基所構成，其結構與三酸甘油脂相似，不同
15
之處在於甘油的第三個羥基不是接脂肪酸分子，而是接一磷酸根的極性端，因此 磷脂質一端為具親水性，另一端為脂肪長鏈的非極性尾巴。在水溶液中，透過磷 脂質的疏水端與材料表面配體作用，將材料包覆在核內並聚集在一起，極性端分 子朝向外部形成oil in water 的微胞。
N+ CH3 C H3
CH3 O P O
O O
H H
H O
H O
H
O
O
CH3 CH3
H
H O
O O H H
H O
O O
CH3 CH3
CH3 磷 酸 根
脂 肪 酸 甘油
(A)
(B)
Figure2.5 (A)磷脂質高分子；(B)三酸甘油脂高分子。
另一則為長鏈狀的兩性高分子包覆，將量子點材料同樣包覆在內，形成類微胞 (micelle-like)結構而轉移至水相溶液中，依高分子結構上差異，可細分為(1)以親 水端為主鏈並疏水端為側鏈之多聚疏水性側鏈之兩性高分子(multiple
hydrophobic side chains amphiphilic polymer)，聚丙烯酸(poly(acrylic acid)， PAA) 為常見代表性結構，當PAA 上之羧酸基團與量子點表面的胺基酸反應轉變為醯 胺鍵結，此時PAA 之親水端則環繞著量子點表面，成為水溶性材料；因 PAA 聚 合物含有大量可功能化的羧酸基團，在量子點表面位置上所鍵結的每一個高分子 側鏈都提供高空間密度，使得高分子完全覆蓋在量子點周邊，因此材料不會因束 縛力不足而脫落且提高穩定度，加上本身的多功能性，可用於修飾或鍵結上其他
16
功能性分子[21]。(2)順丁烯二酸酐基團之兩性高分子(maleic anhydride moieties amphiphilic polymer)，顧名思義，含有此基團之高分子，如聚馬來酸酐-十八烯 (Poly(maleic anhydride–alt -1-octadecene)，PMAO)與聚苯乙烯-馬來酸酐
(Poly(styrene-co-maleic anhydride)，PSMA)，當加入
EDC(ethyl(dimethylaminop-ropyl) carbodiimide) 使量子點表面功能化後，並與順 丁烯二酸酐基團的高分子耦合，而形成順丁烯二酸酐在量子點外圍的結構，此時 加入鹼液與順丁烯二酸酐產生反應，將酸酐結構上的環氧基團展開，產生兩個羧 基而能溶解於水相中；順丁烯二酸酐基團的高分子改質具有幾項特點，對於具有 氨基(amino terminal)或胺基酸修飾的側鏈(如烷氧基)有高度的自發性反應，且只 需加入EDC 進行功能化耦合，無需再加額外的交聯劑進行反應[22]。(3)三嵌段兩 性高分子(tri-block amphiphilic polymer)，由兩種或兩種以上不同類型的高分子所 組成，由主鏈區分成兩區塊，一側為具有親水端的高分子基團，另一端則為疏水 性的高分子碳鏈，在經過EDC、NHS 與量子點材料相互交聯反應後，側鏈為疏 水性的高分子包覆在量子點表面碳氫鏈外，親水端側鏈則暴露在外，所形成的量 子點材料表面會同時具有不同官能基的基團，藉此提高於水溶液中的溶解度與穩 定性，並在生物體應用有不錯的生物相容性，同時此官能基能提供修飾化作用，
增加材料功能性。William W. Yu 將聚乙二醇(PEG)與馬來酸酐-1-十八烯(PMAO) 在氯仿中反應結合，如Figure 2.6.所示[23]，一端成為親水性支鏈，另一端則為疏 水性支鏈，同時含有羧基與胺基之自由基，可做為增加功能性修飾之配位端；
Xiaohu Gao 研發一多功能性的量子點半導體材料進行癌細胞活體內的標靶與顯 影，他們在三嵌段兩性高分子的一羧酸端做置換，改接上含有八個碳的疏水性側 鏈，其組成主鏈的一邊分別含有聚丙酸丁酯、聚乙酯與新接上的碳氫鏈疏水端，
另一邊則是高度親水的羧酸基團，此完整結構使得高分子在量子點表面上的疏水 端吸附更加牢固[24]。
17
Figure 2.6. (A)PMAO-PEG 之兩性高分子；(B)水溶性量子點示意圖[25]。 兩性高分子包覆法並沒有直接地在量子點材料表面上反應，因此依然維持量 子點原本之結構特性與量子產率，加上兩性高分子上之疏水端側鏈能加強疏水作 用，使量子點材料的水溶性結構更加穩定堅固，且大部分兩性高分子都已是商業 化販售商品，大量製備所需花費比起胜肽類等分子便宜許多，因此文獻上兩性高 分子包覆法的探討比配位體交換法更為常見[26]。
2-5 奈米顆粒在生物影像的應用與文獻回顧 一. 核磁共振影像(MRI)成像原理及顯影劑的作用
核磁共振影像擷取是經由量測在生物體內水分子上的氫原子鬆弛過程 (relaxation process )，其利用在生物組織或器官的水分或密度不同而形成不同差 異的鬆弛狀態，此差異狀態可由電子儀器偵測產生不同訊號來獲得影像。主要施 加一額外的磁場於生物體上的Z 軸上，此磁場大小為 Bo，則水分子上的氫原子 的磁場方向為了與Bo 的磁場方向相同，以拉莫爾旋進頻率(Larmor precession frequency，ω0)在 Z 軸自旋(spin)，產生 m(淨磁場)，如下 Figure 2.7.(a)所示。當 施加一幅射脈衝(radio frequency，RF puse) 其方向與 Z 軸垂直、本身頻率也具拉
18
莫爾旋進頻率及磁場強度小於Z 軸的 Bo，此幅射脈衝作用主要激發氫原子產生 共振，使氫原子吸收能量及淨磁場偏離Z 軸倒向 X 和 Y 平面，以更大的角度來 自旋，如下Figure 2.7. (b)所示。
當幅射脈衝作用關閉時，被激發氫原子會釋放能量，讓磁場方向重回到 Bo，
而此時可由兩個方向(Z 軸、X-Y 平面)來讀取淨磁場大小(mz、mxy)回復(弛緩)到 起初淨磁場m的時間，此弛緩時間分別為在Z 軸上的 T1(longitudinal)及在 XY 面 的T2(transverse)，如下 Figure 2.7. (c)所示，其下公式 2.1.及 2.2.可表示弛緩時兩 方向淨磁場變化:
mz = m(1 - e-t ⁄ T1) (longitudinal) (2.1.) mxy =m sin(ω0t + φ)e-t ⁄ T2 (transverse) (2.2.)
其顯影劑的功用可由下Figure 2.7. (e、d)所示，以氧化鐵顯影劑為例，當無顯 影劑的存在時，其鬆弛現象較為緩慢，T2 時間較大，造成影像緩慢變黯淡，擷 取影像時還較為明亮；當存在顯影劑時，受在Z 軸上 Bo 磁場的影響，顯影劑因 順磁性，產生與磁場Bo 相同方向的磁場，加快周遭環境的氫原子的弛緩時間，
T2 時間較小，造成影像快速變黯淡，擷取影像時可得較暗色的影像，此顯影劑
為負向顯影劑。反之，當有影響T1 的正向顯影劑存在，縮短 T1 弛緩時間，使 快速增加mz的影像強度，增加影像明亮度。所以，顯影劑的作用存在時，會增 加影像的反差加大，使得不同組織或器官因不同影像強度能更加顯像。
19
二. 磁性顆粒在生物上的應用
除了文章前面提及磁性顆粒主要能夠核磁共振造影之外，大概還可進行: (1) 光熱療法(thermotherapy):施加一額外的交流磁場，以一定頻率改變磁場方向、強 度，藉以提升已標記病變目標的奈米磁性顆粒本身溫度，加熱周遭病變的組織，
讓組織產生死亡，因加熱時也會讓周遭的健康組織受到破壞，所以在使用其應用 也受限制；(2)免疫分析和細胞分離(immunoassay and cell separation):另用特定抗 體或核酸固定化於奈米磁性顆粒，讓奈米磁性顆粒標記特定細胞或蛋白質，藉以 儀器偵測磁場，確認細胞和蛋白質反應機制。如果施加磁場於已被奈米磁性顆粒 標記特定細胞或蛋白質，藉由磁場的作用將特定細胞或蛋白質從不純物系統分 離，來獲得單一細胞或純化物質。
Figure 2.7. 核磁共振成像原理圖及顯影劑功能示意圖[27]
20
第三章、實驗方法 3-1 實驗藥品與氣體
氬氣(Argon) Ar 億峰氣體99.99%
乙醯丙酮酸鐵 (Iron(III) acetylacetonate)
Fe(C5H7O2)3 SIGMA-ALDRICH 97%
二芐醚(Benzyl ether) C14H14O ACROS 99%
油胺(Oleylameine) C18H37N ALDRICH 70%
乙醇(Ethanol) C2H5OH ECHO(Taiwan) 99.9%
聚1-十八烯馬來酸酐(poly(maleic anhydride-alt-1-octadecene)、
PMAO)
C22H38O3 SIGMA-Aldrich
二氯甲烷(Dichloromethane) CH2Cl2 ECHO(Taiwan) , 99.9%
2-嗎啉乙磺酸(MES) C6H13NO4S Aldrich 膠聯劑(ethyl(dimethylaminopropyl)
carbodiimide、EDC)
C6H13N3 Alfa Aesar 99%
羥基丁二醯亞氨
(N-hydroxysuccinimide、NHS)
C4H5NO3 Aldrich
1,2-雙(2‐氨基乙氧基)乙烷 (1,2-Bis(2-aminoethoxy)ethane)
C6H16N2O2 TCI AMERICA 98%
二乙烯三胺五乙酸 (Diethylenetriaminepentaacetic
acid、DTPA)
C14H23N3O10 Alfa Aesar 98%
二甲基甲醯胺(N，
N-Dimethylformamide、DMF)
C3H7NO J.T. Baker 99.9%
21
氯化釓
(Gadolinium(III) chloride)
GdCl3 Acros Organics 99.9%
異硫氰酸鹽羅丹明 (Rhodamine B isothiocyanate)
C29H30Cl3O3S SIGMA-ALDRICH
無水碳酸鈉(Anhydrous Sodium Carbonate)
Na2CO3 SHOWA 99.5%
碳酸氫鈉 (Sodium Bicarbonate)
NaHCO3 SIGMA-ALDRICH 99.5-100%
22
3-2 實驗儀器
1. 紫外光/可見光吸收光譜儀(UV-Vis absorption spectrometry、UV-Vis) 型號:V-670 製造商:JASCO CO. Ltd
2. 光激發螢光分析儀(Photoluminescence spectrometry、PL)
型號:V-670 製造商:JASCO CO. Ltd
3. 感應耦合電漿原子發射光譜儀(Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer、ICP-AES)
型號: JY 2000-2 製造商: Jobin Yvon
4. 超導量子干涉磁量儀(Superconducting Quantum Interference Device、SQUID)
型號: :MPMS5 製造商:Qantum Design
5. 軛焦光譜顯微影像系統(Confocal Spectral Microscope ImagingSystem)
型號:TCSSP2 製造商:Leic
6. 穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy、TEM) 台灣科技大學:Philips Tecnai F20 G2 FEI-TEM
23
3-3 實驗步驟
3-3-1 Fe3O4磁性奈米微粒合成[28]
此合成反應為熱裂解乙醯丙酮酸鐵(Iron(III) acetylacetonate)，得到氧化鐵 Fe3O4磁性顆粒，秤取乙醯丙酮酸鐵(Iron(III) acetylacetonate)1.0591g(3mmol)、加 入二芐醚(Benzyl ether)15mL 及油胺(Oleylameine) 15mL 於 50mL 二頸瓶，進行抽 真空及填充氮氣且重複三次，加熱至110℃保持 1 小時，去除反應溶劑水分，1 小時之後，快速升溫至300℃並用保溫棉覆蓋於裸露空氣的二頸瓶表面，讓晶體 成長1 小時，最後冷卻至室溫，卸下保溫棉，將反應液倒入離心管並加入大量乙 醇離心沉澱產物，離心20 分鐘且轉速設定 6000rpm，得到產物，去除上層液後 置於室溫乾燥，得到粉末狀磁性顆粒。
3-3-2 Fe3O4磁性奈米微粒與聚 1-十八烯馬來酸酐(PMAO)之表面改質 利用兩性高分子包覆法進行Fe3O4磁性顆粒表面改質，首先各秤取5mg Fe3O4磁性顆粒溶於1.2mL 二氯甲烷，及 15mg 聚 1-十八烯馬來酸酐(PMAO)溶 於20mL 二氯甲烷，並放置震盪水槽震盪直至完全溶解後，將兩者溶液混和攪拌 反應1hr，進行高分子表面包覆連結，反應結束後以抽氣幫浦將二氯甲烷溶液移 除抽乾，再加入0.5mL 二氯甲烷與 3mL 氫氧化鈉溶解 Fe3O4磁性顆粒，之後以 超音波震碎機振至深紅褐色，接著再次以抽氣幫浦將溶液中二氯甲烷移除，得到 Fe3O4磁性顆粒溶於氫氧化鈉水溶液中，最後將產物離心得到沉澱物後，加入2- 嗎啉乙磺酸(MES)溶解得到之沉澱物，重複兩次，得到完全純化後之產物。
3-3-3 Fe3O4/PMAO 磁性奈米微粒之表面官能基化
將純化後之產物溶於8.6mL 2-嗎啉乙磺酸(MES)水溶液中，並秤取羥基丁二 醯亞氨(N-hydroxysuccinimide、NHS)、膠聯劑(ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide、EDC)各 65mg，加入 Fe3O4/PMAO 水溶液中並反應攪拌半小時，
接著加入72L 1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷(1,2-Bis(2-aminoethoxy)ethane)均勻攪拌 反應6 小時。最後以超純水當作濾液，利用透析膜(Dialysis Membrances、
24
MWCO:500 kDa)將未反應的 1,2-Bis(2-aminoethoxy)ethane 去除，分別在 30 分鐘、
60 分鐘更換濾液，過濾 24 小時後，即可獲得表面官能基化之Fe3O4/PMAO 磁性 奈米微粒，簡稱Fe3O4/PMAO-NH2。
3-3-4 Fe3O4/PMAO-NH2磁性奈米微粒螯合 DTPA-Gd
此反應分為兩部分。第一部分為DTPA 與 Fe3O4/PMAO-NH2磁性奈米微粒 之鍵結。首先秤取5mg 二乙烯三胺五乙酸(Diethylenetriaminepentaacetic acid、
DTPA)溶於 1mL 二甲基甲醯胺(N，N-Dimethylformamide、DMF)中，並加入 12mg 膠聯劑(EDC)攪拌反應 40 分鐘，再加入 Fe3O4/PMAO-NH2磁性奈米微粒，攪拌 反應12 小時。最後以超純水當作濾液，利用透析膜(Dialysis Membrances、MWCO:
5000 kDa)將未反應的 DTPA 去除，分別在 30 分鐘、60 分鐘更換濾液，過濾 24 小時後，即可獲得純化後之Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA。
第二部分為Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA 與 GdCl3之螯合反應。預先配製66mg 氯化釓(Gadolinium(III) chloride)溶於 0.5mL MES 水溶液中，待第一部分
Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA 純化完成後加入，並攪拌反應 12 小時。最後以超純水 當作濾液，利用透析膜(Dialysis Membrances、MWCO: 5000 kDa)將未反應的 DTPA 去除，分別在 30 分鐘、60 分鐘更換濾液，過濾 24 小時後，即可獲得純化 後之Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA-Gd。
3-3-5 Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA-Gd/RBITC 磁性奈米微粒之合成
需預先配製一緩衝溶液。分別配製0.2M 之無水碳酸鈉(Anhydrous Sodium Carbonate)與碳酸氫鈉(Sodium Bicarbonate)，分別取 1mL 0.2M 無水碳酸鈉與 11.5mL 0.2M 碳酸氫鈉混合均勻，後加水至 50mL。最後可得 PH 值於 9.1 之緩衝 溶液。
將純化後之Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA-Gd 加入 300L 緩衝溶液以及 83L 異硫氰酸鹽羅丹明(Rhodamine B isothiocyanate)(1mg/mL in DMSO)，並避光攪拌
25
反應 12 小時，得Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA-Gd/RBITC。最後以超磁力磁鐵吸引 磁性奈米微粒，MES 水溶液為洗滌劑，反覆沖洗即可得純化之 Fe3O4/PMAO-NH2
@DTPA-Gd/RBITC。
3-3-6 核磁共振光譜儀 MRI 測定參數[29-31]
T1-weighted image: FOV=4.5 cm, Slice/ Thickness=1.2 mm, Flip Angle(FA)=180°, TR/ TE=800/10 ms, Matrix(MTX)= 256*256, Average(NEX)=4。
T1 value: TR/ TE= TR:400, 860, 1320,1780,2240,2700,3160,4080,4540,5000 ms,TE:10 ms, Matrix(MTX)= 256*256, Average(NEX)=4。
T2-weighted image: FOV=25*25mm2, Slice/ Thickness=1.0mm, TR/
TE=5000/11ms, Matrix(MTX)=256*256, Average(NEX)=3。
T2 value: TR/ TE= TR: 5000 ms TE: 11, 33, 55 ,77 ms。
26
第四章、結果與討論 4-1 實驗設計
此研究以發展雙功能超順磁性氧化鐵顯影劑做為主軸，合成並鑑定磁性奈米 微粒顯影劑，檢驗是否符合預期的組裝模式，最後為了證實磁性奈米微粒顯影劑 的實用性，將磁性奈米微粒顯影劑實際做光學造影及核磁共振顯影。選擇顯影劑 的材料方面，主要以無毒性的材料作為顯影劑的核心，在核磁共振影像的顯影劑 材料選擇四氧化三鐵為核心並螯合釓離子錯合物，四氧化三鐵在核磁共振顯影上 有較佳的T2 顯影效果，而釓離子錯合物在核磁共振顯影上有較佳的 T1 顯影效 果，且兩者相對於其他顯影磁性材料較無毒性。光學顯影劑材料部分，利用能夠 直接與NH2鍵結的異硫氰酸鹽羅丹明作為發光源。表面改質部分利用兩性高分 子聚1-十八烯馬來酸酐(PMAO)，改變磁性奈米微粒的表面性質，進一步利用 EDC/NHS 系統與 1,2-雙(2‐氨基乙氧基)乙烷對磁性奈米微粒進行表面官能化，最 後利用EDC/NHS 系統螯合 DTPA/Gd 完成核磁共振雙顯影劑的設計。接著利用 異硫氰酸鹽羅丹明上特有的NCS 基團與 NH2基產生鍵結，完成簡單的光學造影 設計。
Figure4.1 光學及核磁共振雙功能磁性奈米微粒顯影劑組裝示意圖。
27
4-1-1 氧化鐵磁性微粒特性分析 一. 反應機制
此合成機制利用熱分解法(Thermal decomposition)來進行氧化鐵磁性微粒的 製備，熱分解法的合成概念在前2-3-4 章節概述過。此實驗利用乙醯丙酮酸鐵 (Iron(III) acetylacetonate)作為有機金屬前驅物，其油胺(Oleylameine)作為界面活 性劑，二芐醚(Benzyl ether)為反應溶劑，反應溫度控制在 110℃使得多餘的水份 能夠去除，並接著反應溫度控制在300℃，使有機金屬前驅物完全分解成單體，
再循序漸進的產生成核反應、長晶反應，最後得到磁性奈米微粒。
Figure4.2 氧化鐵合成示意圖[27]
二. 型態分析
如Figure4.3.(a)(b)所示，樣品溶於己烷之後滴銅網，等至溶劑揮發之後，晶 體沉積於銅網上，在穿透式電子顯微鏡分析之下，以不同倍率擷取其2 維影像，
從電子影像上，可以觀察Fe3O4磁性微粒晶體的尺寸大小約為10nm±1nm，顯示 實驗合成出來的晶體為單一分散，具有尺寸均一性。
(a) (b)
Figure4.3 磁性奈米微粒 TEM 圖(a)(b)
28
4-1-2 兩性高分子包覆氧化鐵表面改質分析
由於磁性微粒Fe3O4是在非極性製程中製備完成的，其表面帶有大量的NH2
官能基，如Figure4.2 所示，為了使 Fe3O4能夠應用於生物系統，因此利用兩性 高分子的表面改質技術將Fe3O4的溶解性質改變，使其能溶解於水相溶液中。將 聚1-十八烯馬來酸酐(PMAO)的兩性高分子進行表面包覆，以改變 Fe3O4表面性 質成為水溶性的極性材料，並保護Fe3O4避免受到其他化學反應等影響，同時提 供錶面具有可修飾的鍵結；其先將PMAO 與 Fe3O4混合在二氯甲烷溶劑中，將 溶液均勻地攪拌混合，此時PMAO 的長碳鍊端會與 Fe3O4表面間產生凡得瓦爾 力(Van der Waals force)，而環氧基則暴露於 Fe3O4周圍，使得Fe3O4被包覆在 PMAO 內部，而由於 PMAO 另一端的環氧端還無法提供 Fe3O4具有水溶性，如 Figure4.4(a)，因此需再加入氫氧化鈉水溶液作用將 PMAO 上的環氧基打開，此 時一個環氧基能夠形成兩個羧酸基團(-COOH)的高分子結構型式，成為具有極性 能力的水溶性Fe3O4，其反應機制如Figure4.4(b).所示，並由 Figure4.4 可看出表 面改質後的磁性微粒在水相中分散性良好的現象。
Fe3O4
:PMAO
O
O O O O
O O
H O OH O OH
O
(a)
29 NaOH
hexane water
Figure4.5 PMAO 改質結果 4-1-3 雙功能超順磁性氧化鐵顯影劑光學與磁性分析
利用UV-PL 測量其光學性質，用來判斷異硫氰酸鹽羅丹明的 NHS 基團有無 與Fe3O4表面官能基NH2進行鍵結，如Figure4.6 所示，紅線為 UV 光譜圖，可 在555nm 附近發現一微弱吸收峰，並且利用 530nm 為激發光波長，可激發出螢 光放射波長在570nm 附近，量子產率(QY)為 0.68%，並且從峰寬可看出粒徑均 一的性質。
300 400 500 600 700
Wavelength(nm)
Abs intensity (a.u.) PL intensity(a.u.)
Figure4.4(a)氧化鐵包覆 PMAO 示意圖和 (b)PMAO 利用 NaOH 進行開環反應 (b)
Figure4.6(a)氧化鐵顯影劑的吸收光譜與螢光光譜圖 (b)照射紫外光燈前後對照示意圖
30
另外在磁性方面，將改質前後之Fe3O4 經由超導量子干涉儀(SQUID)進行 量測，利用其結果的磁滯曲線，說明Fe3O4 磁性微粒在改質前後呈現超順磁性 材料的性質，在298K 的溫度下，並無殘磁力及矯頑磁力的存在，並顯示飽和磁 化率分別為15 emu/g 及 13 emu/g。如 Figure4.7 示。
-10000 0 10000 H(Oe)
-20 -10 0 10 20
M(emu/g)
Fe3O4,T=298K Fe3O4,PMAO,T=298K
4-2 雙功能顯影劑在生物上的應用 4-2-1 核磁共振 MRI 顯影效果
此雙功能超順磁性氧化鐵顯影劑在核磁共振顯影的應用可分為正向顯影劑 與負向顯影劑，利用核心的氧化鐵與外圍的釓離子產生磁場效應，加快周遭的氫 原子的弛緩時間，使T2、T1 時間較小，使得訊號快速遞減，造成影像明顯變化，
使得影像上有明顯差異來達到顯影效果。此章節主要探討利用核磁共振顯影來探 討在不同Fe 與 Gd 濃度比例，固定 Gd 濃度所造成的影像呈現差異，並且證實在 特定的濃度範圍內可以達到所要求的顯影效果。首先利用感應耦合電漿原子發射 光譜儀(ICP-AES)來測定氧化鐵顯影劑成份比例，並稀釋配置固定 Gd 濃度為 0、
0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04mM，製備兩組不同鐵釓比例(4.4645 以及0.8644)利用核磁共振光譜儀(7T MRI)作影像檢測。所測得的 T1、T2 弛緩時 間，如Table4.1(a).(b)所示
Figure4.7 氧化鐵經表面改質後的磁力性質
31
Table4.1 核磁共振光譜儀在不同濃度下所測得弛緩時間 (I)Gd/Fe=0.3060
Gd(mM) 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 T1(ms-1) 2897.2 1637.5 1264.8 1058.7 894.03 765.96 662.26 551.02 T2(ms-1) 807.65 383.534 354.35 199.79 167.19 156.87 135.19 117.46 (II)Gd/Fe=0.8644
Gd(mM) 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 T1(ms-1) 2998.3 1197.7 881.336 744.396 607.381 530.381 463.128 372.372 T2(ms-1) 1716.7 62.504 38.0002 30.5212 24.5282 21.1318 18.2174 14.8804 (III)Gd/Fe=4.4646
Gd(mM) 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 T1(ms-1) 2757.2 1354.03 1078.97 866.014 756.04 632.513 557.445 438.963 T2(ms-1) 973.99 81.1512 54.0482 40.5319 34.611 28.2668 24.7856 19.6763
將所測得的T1、T2 弛緩時間倒數作為 Y 軸並與 X 軸釓離子(Gd)濃度作圖，
進一步計算線性迴歸，可得斜率值r1(弛緩速率)分別為(I)36.136 mM-1s-1 、(II) 56.135 mM-1s-1、(III)45.779mM-1s-1，而r2(弛緩速率)分別為(I)187.58 mM-1s-1、(II) 1593.6 mM-1s-1、(III) 1187.3mM-1s-1，顯示當Gd/Fe 達到 0.8644 時，即可得到較 佳的r1和r2值，達到較佳的顯影能力。對照於R.O.I(region of interest)影像，如 Figure4.8 示。
32
T2
0.00 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.040
[Gd]mM T1
0.00 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.040
[Gd]mM
I II III
0 0.01 0.02 0.03 0.04
[Gd]mM 0
0.5 1 1.5 2 2.5 3
1/T1/s-1
nGd/Fe=0.8644,r1=56.135mM-1s-1 nGd/Fe=4.4645,r1=45.779mM-1s-1 nGd/Fe=0.3060,r1=36.136mM-1s-1
0 0.01 0.02 0.03 0.04
[Gd]mM 0
20 40 60 80
1/T2/s-1
nGd/Fe=0.8644,r2=1593.6mM-1s-1 nGd/Fe=4.4645,r2=1187.3mM-1s-1 nGd/Fe=0.3060,r2=187.58mM-1s-1
4-2-2 在生物影像的應用
在生物影像的應用方面，將雙功能顯影劑經投藥於Hela 癌細胞中並培養一 段時間，利用共軛焦雷射顯微鏡(Confocal Spectral Microscope)觀察顯影劑是否能 經由吞噬或胞飲作用(Endocytosis)到達細胞膜內部，並利用共軛焦雷射顯微鏡 (Confocal Spectral Mocroscope)以波長 341 nm 激發光接收 429-489 nm 及 540 nm-600nm 兩波段的散射光分別辨識出 DAPI 的紅色螢光及 Fe3O4/PMAO-NH2
@DTPA-Gd/RBITC 紅色螢光位置，並觀察顯影劑是否會進入細胞體內，如 Figure4.9 示。
Figure4.7(a)T1影像與(b)T2影像，(c)T1倒數與濃度座標圖，(d)T2倒數與濃 度座標圖。
(c) (d) (a) (b)
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(a) (b)
(c) (d)
Top
Bottom (e)
Figure 4.9.(a)藍色螢光標示細胞核位置。(b)多功能奈米粒子之螢光效果。(c)兩種 螢光進行疊圖。(d)為兩種螢光與光學顯微鏡影像進行疊圖。(e)固定 XY 平面，
調整Z 軸之一系列影像。
Fiugre4.9Fe3O4/PMAO-NH2@DTPA-Gd/RBITC 於 Hela 癌細胞經 共軛焦雷射顯微鏡擷取之影像。
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第五章、結論
利用熱裂解法製程合成出Fe3O4磁性微粒，並且利用兩性高分子聚1-十八烯 馬來酸酣(PMAO)進行水相改質、EDC/NHS 系統與 1,2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷進 行表面官能化，並與DTPA-Gd 及異硫氰酸鹽羅丹明進行鍵結，成功開發出以 Fe3O4磁性微粒為中心擁有核磁共振造影與細胞顯影的多功能顯影劑。
利用熱裂解法合成出的Fe3O4磁性微粒，利用穿透式電子顯微鏡(TEM)拍攝 結果，能夠觀察有粒徑均一並且分散性良好的情形。而改質過後的Fe3O4可以觀 察到擁有0.13(emu/g)的飽和磁化率，並且圖型上沒有殘磁性或是矯頑磁力的存 在，屬於一個超順磁性的物質，由於利用PMAO 進行改質並不會改變材料原本 性質，因此可推測改質前的Fe3O4是屬於超順磁性材料。
接著利用感應耦合電漿原子發射光譜儀(ICP-AES)判斷 Fe3O4與釓(Gd)是否 有鍵結上，並且測得其濃度比例，配置一系列不同濃度的樣品進行核磁共振儀 (MRI)的測量，證明顯影功能在設計的濃度範圍內(Gd：0~0.04mM)是可行的，並 且在Fe 與 Gd 的濃度比例上，Fe 與 Gd 的差值較小時，其弛緩速率(r1、r2)的值 都較大，能使影像變化對比較明顯，並且影像表示同時具有正向顯影與負向顯影 功能。
在細胞顯影的部分，可以經由螢光染劑DAPI 所釋放的螢光觀察出 Hela 癌 細胞的細胞核所在，並且由紅色光進行套色，觀察設計的顯影劑是否可以被癌細 胞經由吞噬或胞飲作用進入到細胞膜內部。觀察結果發現，部分的顯影劑能夠被 細胞所吞噬並且發出紅光。
此顯影劑同時具有MRI 的正向、負向顯影功能以及細胞螢光顯影功能，可 以用來追蹤癌細胞或是腫瘤，但仍有許多開發的空間，例如在表面修飾葉酸，增 加顯影劑被細胞吞噬的可能性、將螢光染劑異硫氰酸鹽羅丹明置換成目前新穎材 料，量子點，以提升其光學效果，或是接上特定之抗癌藥物，進行癌細胞的毒性 測試並觀察抗癌藥物在進入癌細胞後，如何抑制癌細胞的生長狀況。
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![Figure 2.1. 在生醫應用方面多種量子點的表面改質方法 [17]](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/9libinfo/9127498.411680/16.892.101.767.127.964/Figure21在生醫應用方面多種量子點的表面改質方法17.webp)
![Figure 2.4. 嵌段式共聚高分子包覆法示意圖 [20] 。](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/9libinfo/9127498.411680/20.892.140.753.458.842/Figure24嵌段式共聚高分子包覆法示意圖2.webp)
![Figure 2.7. 核磁共振成像原理圖及顯影劑功能示意圖 [27]](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/9libinfo/9127498.411680/25.892.128.734.100.710/Figure27核磁共振成像原理圖及顯影劑功能示意圖27.webp)
