嘉南藥理科技大學
97 年度教師專題研究計畫成果報告書
計劃主持人:李國榮
計畫名稱: PTA 治療骨質壞死症之評估 計畫編號: CN7921
計畫類型:個人型研究
執行期限: 97 年 1 月 1 日至 97 年 12 月 31 日
中華民國 九十八年 二月 二十六日
(一)摘要
骨質壞死症(Osteonecrosis)主要的成因是成骨細胞(Osteoblast ) 及破骨細 胞(Osteoclast ) 生長不平衡所致。由於 PTA 為了具有促進細胞增生的功能，
我們試圖利用 DNA 重組的方式，將 PTA 基因的構築至具有四環黴素 (tetracycline)誘發表現及抗新黴素篩選標記載體( gene vector )，此載體往後可 用以對小鼠成骨細胞(Osteoblast ) 及破骨細胞(Osteoclast )進行基因轉殖，分 別 構 築 可 過 渡 表 現 前 胸 腺 素 之 成 骨 細 胞 (Osteoblast ) 及 破 骨 細 胞 (Osteoclast )，吾人將可藉此胞細胞來探討 PTA 對細胞分化增生的影響，以評 估前胸腺素治療骨質壞死症之可行性。
(二)方法：
A.聚合酵素連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR) 利用 PCR 反應將 DNA 片段大量製造。反應混合液如下:
10x PCR buffer (Tris-HCl, 0.1 M; KCl, 0.5 M; MgCl2, 15 mM; gelatin; pH 8.3), 5 µl 10 mM dNTP, 2 µl
寡核酸引子 (sense strand, 50 pmole/µl), 0.5 µl 寡核酸引子 (antisense strand, 50 pmole/µl), 0.5 µl Taq polymerase (5 U/ml, Primezyme), 0.2 µl
cDNA 模板 (50ng) /無菌水, 42.8 µl
總體積 50 µl, 上層加入 40 µl 無菌的礦物油 (mineral oil, Sigma) 反應條件:
1. 94℃，3 分鐘 2. 94℃，1 分鐘
60℃，45 秒 72℃，30 秒 進行 35 個循環反應。
3. 72℃，1 分鐘 B.電穿孔法
本實驗乃是利用電穿孔法進行哺乳類細胞質體之轉型，以選殖穩定表現質 體 DNA 的細胞株。電穿孔法是屬於物理性的 DNA 傳送方法，其原理是利用瞬 間通電，增加細胞膜的通透性，使 DNA 得以進入細胞內。
(三)結果：
本計劃初步已成功利用 PCR 反應構築 PTA 基因之突變株，此 PTA 基因之 突變株與野生株之差異在於突變株短少 70-90 bp 之 DNA 序列，如圖一所示
mark er
BP (-)
BP-D2 (+)
BP-D2 site direct mutagenesis No.(1)-(14)
enzyme EcoRI and BamHI
圖一、箭頭所示為野生株 PTA，星號所示之突變株經 DNA 定序後為正確之 PTA 突變株
目 前 這 些 突 變 株 已 陸 續 轉 染 致 成 骨 細 胞 (Osteoblast ) 及 破 骨 細 胞 (Osteoclast )進行細胞凋亡之檢測，藉以評估 PTA 治療骨質壞死症之可行性。
BP (-)
BP-D2
(+) (1) (14)
