應用高分子薄膜控制秋水仙素釋放速率之研究 Controlled Release of Colchicine From Polymer Films

國立宜蘭大學生物技術研究所 碩士論文

Institute of Biotechnology National Ilan University

Master Thesis

應用高分子薄膜控制秋水仙素釋放速率之研究 Controlled Release of Colchicine From Polymer Films

指導教授：楊屹沛博士

Yih-Pey Yang, Ph. D.

研究生：林美湘

Mei-Hsiang Lin

誌 謝

重回校園是一件幸福的事，這一路上雖辛苦卻也充實。非常感謝指導 老師－楊屹沛老師兩年來的鼓勵與指導，在百忙之餘與我討論實驗使我得 以順利完成論文，亦師亦友的情誼深存我心。

感謝口試審定老師－陽明大學蔡瑞瑩老師在論文上給予許多寶貴意 見，讓我體會科學研究之嚴謹。同時感謝許多所上師長兩年來的指導，林 佳靜所長、郭村勇老師、陳威戎老師、賴裕順老師以及鼓勵我重回校園的 陳淑德老師，讓我感受到當學生的美好。

還有實驗室的哲宇、敬暉、鍵寬、書宏，感謝他們在實驗上的大力協 助分擔我許多的實驗進度，以及感謝摯友宜玨、筱倩、紫君、敦耘、羽橙、

達煒、柏毅在課業與精神上的支持。

最後，謹以此書獻給我最摯愛的家人，一路支持我的外子志民、兩個 可愛貼心的寶貝新和葵、自小辛苦栽培我的父親林德榮先生、肯定鼓勵我 的鍾秀美阿姨、以及我最偉大的母親吳享妹女士。

摘要

本文以PLGA 生物可降解性高分子為控制釋放基材，包覆秋水仙素形成 薄膜，研究其於體外之控制釋放速率。實驗係利用高效能液相層析儀檢測 緩衝液內自高分子薄膜釋放之秋水仙素。研究結果顯示，各薄膜在實驗初

期均呈現大小不同的爆發釋放，釋放速率則隨時間遞減，至21 天後則出現

加速釋放現象。經28 天的累積釋放，其中以 PLA 釋放之秋水仙素量最多，

不同乳酸甘醇酸比之PLGA 薄膜以 PLGA50:50 平均釋放速率最大。

基於秋水仙素為光敏感性物質，利用 24 小時光照含秋水仙素高分子薄

膜，研究秋水仙素結構於高分子內之穩定度。實驗以高效能液相層析儀檢 測緩衝液內之秋水仙素與其主要光產物 β-lumicolchicine 含量。實驗結果顯 示，光照後各薄膜累積釋放之秋水仙素均少於不照光之各高分子薄膜。經 28 天 PLGA 高分子薄膜累積釋放之 β-lumicolchicine 比例為 PLA 薄膜的 6 至10 倍，證實高分子薄膜包覆秋水仙素會影響其光產物之生成。而 PLGA 中乳酸比例愈高產生之β-lumicolchicine 愈少，愈能穩定秋水仙素之結構。

關鍵字：控制釋放、PLGA、秋水仙素

Abstract

A high-performance liquid chromatography was employed to study the in vitro controlled release of the colchicines embedded in a biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) film. The results showed that various polymer films have different burst effect at the beginning of the release, and then the release rates decrease continuously. However, the release rates of colchicine increased while the polymer films were immersed in the buffer solution after 21 days.

Following 28 days experiment, the PLA film exhibited the maximum accumulated releasing percentage of the colchicine, but the maximum average releasing rate appeared in the PLGA50:50 films.

Colchicine is a photosensitive substance. The stability of colchicine structure inside polymer films was investigated by lighting polymer films containing colchicines for twenty-four hours. The major photoproduct, β-lumicolchicines, and colchicines in the solution were detected by high-performance liquid chromatography. The results indicated that the accumulated releasing percentage of colchicines from lighted films were all less t h an th e u n l ig h ted f il ms . T h e a c c u mu l a t e d r el e a s i n g r a t i o o f β-lumicolchicines/colchicines from PLGA films was six to ten times of PLA film, which implied that polymer films containing colchicines affect the photoproduct generation of the colchicine. Moreover, the PLGA with higher molar ratio of lactide versus glycolide had less generation of β-lumicolchicines and stabilized the colchicine structure more.

Key words：Controlled release、PLGA、Colchicine

目 錄

誌謝 ... I 中文摘要 ... II 英文摘要 ... III 目錄 ... Ⅳ 圖目錄 ... Ⅵ 表目錄 ... Ⅸ

第一章 緒論 ... 1

前言 ... 1

第一節 藥物控制釋放 ... 2

第二節 控制釋放機制 ... 5

第三節 應用於控制釋放的高分子 ... 8

第四節 秋水仙素 ... 17

第五節 研究目的 ... 21

第二章 實驗材料與實驗儀器

第一節 實驗藥品與器材 ... 22

第二節 實驗儀器 ... 24

第三章 實驗方法

（一）秋水仙素之迴歸分析 ... 26

（二）秋水仙素光反應之迴歸分析 ... 26

（三）高分子薄膜之製備 ... 27

（四）含秋水仙素高分子薄膜之製備 ... 27

（五）高分子薄膜的降解 ... 28

（六）秋水仙素體外控制釋放 ... 28

（七）光照高分子薄膜之控制釋放 ... 29

第四章 實驗結果與討論

第一節 秋水仙素之 HPLC 迴歸分析 ... 31

第二節 光照秋水仙素之 HPLC 分析 ... 34

第三節 高分子薄膜的降解 ... 38

第四節 秋水仙素體外控制釋放 ... 44

第五節 含有秋水仙素高分子薄膜光照實驗 ... 52

第五章 結論

參考文獻

圖 目 錄

圖1-1.傳統給藥方式血液中藥物濃度的變化 ... 2

圖1-2.利用控制釋放技術血液中藥物長時間之有效濃度 ... 3

圖1-3.藥物自不可降解之高分子基材擴散釋放示意圖 ... 5

圖1-4.藥物自親水性高分子基材膨脹擴散釋放示意圖 ... 6

圖1-5.藥物經由可降解高分子釋放示意圖 ... 7

圖1-6.PLA 之開環聚合反應式 ... 13

圖1-7.PGA 之開環聚合反應式 ... 14

圖1-8.PLGA 由乳酸和甘醇酸以不定比例共聚而成反應式 ... 15

圖1-9.秋水仙素結構式... 18

圖1-10.秋水仙素之光化學反應式 ... 19

圖4-1.利用 254nm 偵測不同濃度秋水仙素溶液之層析結果 ... 31

圖4-2.在 4.35 min 時秋水仙素之光譜圖及 3D 圖 ... 32

圖4-3.不同濃度秋水仙素溶液之 HPLC 迴歸分析圖 ... 33

圖4-4.利用 254nm 偵測濃度 0.1μg/μl 秋水仙素在不同光照時數之 秋水仙素及β-lumicolchicine 層析結果... 34

圖4-5.在 11.717 min 時之 β-lumicolchicine 光譜圖及 3D 圖 ... 35 圖4-6.經由光照 0 至 60 小時的 HPLC 層析面積對時間之變化…………..

37

圖4-7.PLA、PLGA50:50、PLGA50:50(sigma)、PLGA75:25 薄膜

分別在浸泡PBS 溶液不同時間後乾燥三天內之質量變化 ………..39 圖4-8.分別以 PLA、PLGA75:25、PLGA50:50、PLGA50:50(sigma)

薄膜進行in vitro 降解 28 天之質量減少平均速率 ... 40 圖4-9.分別以 PLA、PLGA75:25、PLGA50:50、PLGA50:50(sigma)

薄膜進行in vitro 降解 28 天之剩餘質量(％) ... 40 圖4-10.PLA、PLGA75:25、PLGA50:50、PLGA50:50(sigma)高分子

薄膜降解17 天的攝水率(%) ... 42 圖4-11. PLA/Col、PLGA50:50/Col、PLGA50:50(sigma)/Col 與

PLGA75:25/Col 薄膜進行 28 天控制釋放之秋水仙素累積

釋放率(%) ... 45 圖4-12.PLGA50:50/Col、PLGA50:50(sigma)/Col、PLGA75:25/Col

薄膜進行 28 天控制釋放之秋水仙素累積釋放率(%)... 46 圖4-13.PLA/Col、PLGA50:50/Col、PLGA50:50(sigma)/Col、

PLGA75:25/Col 薄膜進行 28 天控制釋放之秋水仙素平均釋

放速率 ... 46 圖4-14.PLA/Col、PLGA75:25/Col、PLGA50:50/Col、PLGA50:50

(sigma)/Col 薄膜進行 17 天體外控制釋放的攝水率(%) ... 48 圖4-15.PLA/Col、PLGA75:25/Col、PLGA50:50/Col 及 PLGA50:50

(sigma)/Col 薄膜進行 28 天體外控制釋放質量減少平均速率 ... 49

圖4-16.含藥高分子薄膜 PLA/Col、PLGA75:25/Col、PLGA50:50/Col、

PLGA50:50(sigma)/Col 進行體外釋放 28 天之剩餘質量(％) ... 50 圖4-17.經由 24 小時光照 PLA/Col、PLGA50:50/Col、PLGA50:50

(sigma)/Col、PLGA75:25/Col 薄膜 28 天內秋水仙素的累積

釋放率 ... 53 圖4-18.光照與不照光進行 28 天控制釋放秋水仙素之平均釋放速率……54 圖4-19.經由 24 小時光照與未經光照之各薄膜 28 天內秋水仙素的

累積釋放率 ... 55 圖4-20.光照含有秋水仙素高分子薄膜 28 天後之 β-LC 累積釋放率 ... 56

表 目 錄

表1-1 各類型可水解之鍵結與半生期 ... 11 表3-1.配製進行迴歸分析之 sample solutions ... 26 表4-1.利用 HPLC 偵測不同光照時數之秋水仙素及 β-LC 之滯留時

間及面積 ... 36

第一章 緒 論

前言

為了改善傳統劑型的多次給藥及避免藥物在血中濃度過高，研究學者 提出藥物控制釋放模式（Controlled release）適時、適地、適量的輸送藥物，

以增加藥物療效、減少給藥次數及減少藥物造成之副作用。近年來控制釋 放基材的研究多以生物可降解性高分子（Biodegradable polymer）如：PLA (Polylactides)、PGA (Polyglycolides)、PLGA (Poly(lactides-co-glycolides))等 為主，研究顯示，這些高分子材質因其化學結構、組成、聚合方式及比例、

分子量大小、極性等諸多因素影響被包覆藥物之釋放型態與快慢。

秋水仙素（Colchicine）早自 1763 年就被運用於治療風濕類疾病，經研 究其具有特殊之分子結構而有抑制癌細胞分裂增生之功效，因此具有抗癌 藥物之潛力，然而秋水仙素劑量過高時會造成細胞毒性，導致多重副作用，

故其適於藥物控制釋放技術之應用。

第一節 藥物控制釋放

傳統的藥物輸送是經由口服或注射方式將藥物送入體內，在給予藥物 初期血液中的藥物濃度會逐漸升高，短時間內藥物濃度達最高值而後隨之 下降，其變化如圖1-1 所示：

圖1-1. 傳統給藥方式血液中藥物濃度的變化。

這種給藥方式的缺點是如果給予劑量太低無法達到療效，而給予過多 劑量則可能因濃度過高導致生理毒性，克服這種缺點的方式就是必須重複 給藥以維持藥物的有效濃度，然而藥物以口服方式經由腸胃道可能受生理 環境影響降低其活性，或者具有較強毒性的藥物不適合以口服或注射直接 作用於全身，而且經由注射容易有感染的危險，加上若因病患的疏於配合 定時服藥以致無法維持藥效。有鑑於此，近來許多學者為了讓藥物達到更

Drug level

Minimum effective level Maximum desired level

Time Dose Dose Dose

有效的治療，並改善重複給藥的不便，提出了藥物控制釋放之技術，目的 是讓血液中的藥物濃度既可達有效作用濃度，又不會高於致毒濃度，亦可 維持長時間之療效達數日甚或數月之久，如圖1-2。

圖1-2.利用控制釋放技術讓血液中藥物可長時間維持有效濃度。

所謂控制釋放是利用基材（通常是高分子物質）裝載藥物於生理 環境中以預定之速率釋放，這樣的給藥方式可以達到適時、適地、適量的 目標。藥物輸送型態包括口服（Oral system）、貼片（Transdermal system）、

注射於非腸胃道（如肌肉、皮下）、滴劑（如眼睛）等方式，而控制釋放系

統的設計則可為微膠囊（Microcapsules）、微粒（Microspheres）、薄膜（Film）、 薄片（Wafer）、植入物（Implant）等各類形式。至目前為止，已有許多物 質及藥物如胰島素（Ishihara et al., 1983）、胜肽（Rothen-Weinhold et al., 1999）、蛋白質（Crotts et al., 1997； Sharif and O’Hagan, 1995； Cohen et al.,

Maximum desired level

Minimum effective level

Dose Time

Dose level

1991）、抗癌藥物（McCarron et al., 2000； Brem et al.,1993； Garcia et al., 2002）、疫苗（Webber et al., 1998； Shah et al., 1992； Tamada and Langer, 1993）、類固醇（Zhou et al., 1998）、抗生素（Webber et al., 1998； Yoo et al., 2004）、生長激素（Xanthe et al., 2000； Cleland et al., 1997； Singh et al., 2001； Juan et al., 2002； Brodbeck et al., 1999； Cleland et al., 1997）、青 光眼治療劑（Wang et al., 2004）、DNA（Jones et al., 1997）等被應用於控制 釋放的研究。

第二節 控制釋放機制

藥物控制釋放的機制分為三大類型：擴散釋放、膨脹釋放和侵蝕釋放。

ⅰ擴散釋放 (Diffusion-controlled release system )

這是將藥物包埋於不可降解之高分子基材最主要之釋放方式，如圖 1-3 所示。這種系統的釋放機制主要是當高分子形成多孔性基材包埋藥物時，

置入生物體內因體液之浸潤使得藥物分子經由高分子交聯（Crosslink）形成 之孔洞擴散釋放出來（Gurny et al., 1982）。所以高分子內包埋藥物的大小會 影響其釋放速率，亦即包埋的藥物若為蛋白質等大分子物質，則其經由孔 洞擴散之速率相對減緩（Tongwen and Binglin, 1998；Hutchinson and Furr, 1990），是利用這種釋放機制的一大缺點。因此應用這種釋放系統需要考量 包埋物質或藥物的分子大小，以利通過高分子微結構內之孔徑，將物質或 藥物擴散釋放。

圖1-3.藥物自不可降解之高分子基材擴散釋放示意圖。

Time

ⅱ 膨脹釋放 (Swelling-controlled release system )

這是一種需要經由環境中的水或體液滲入參與調控釋放速率的機制，

主要是以親水性(Hydrophilic)高分子為基材的釋放方式，如圖 1-4 所示。這 種控制釋放機制主要是由於水或體液滲入高分子基材時造成高分子膨脹，

使得高分子表面積增加，而加速物質或藥物的擴散釋放(Colombo et al., 1992)。在這種釋放系統中，舉凡能影響高分子膨脹之因子，皆能參與釋放

速率的調控，如環境的pH 值、溫度和離子濃度等因子，當然在不同因子作

用下，高分子微結構孔徑的大小既可能增加抑或減小，都會影響釋放之速 率。

圖1-4. 藥物自親水性高分子基材膨脹擴散釋放示意圖。

ⅲ 侵蝕釋放 ( Erosion-controlled release system )

此種控制釋放之機制有別於上述兩種，在這種釋放系統中藥物不僅自 高分子基材之孔洞擴散釋放，同時也經由基材高分子遭破壞分解而將包埋

Time

之物質或藥物釋放出來，如圖1-5 所示。依高分子侵蝕的形式可區分為兩種 型態，一為主體侵蝕（Bulk erosion）： 物質不只侷限於基材表面亦可因基 材內部崩解而釋放，其溶解速率及藥物釋放速率不易掌控。另一為表面侵 蝕（Surface erosion）：僅由基材表面失去物質，其優點是以此為藥物傳輸系 統時可因降解速率穩定以偵測藥物釋放速率。

圖1-5.藥物經由可降解高分子釋放示意圖。

一般藥物在以可降解高分子為基材的釋放系統中，其釋放速率的表現 可能出現幾個階段：初期快速釋放，又稱爆發釋放（Burst effect），是位於 高分子表面或接近高分子表面的藥物快速釋放，數小時內即會發生；第二 階段以穩定速率釋放，是為零級反應（Zero-order kinetics），這可能是藥物 由高分子內擴散釋放的結果；最後階段釋放速率緩慢，此時藥物隨高分子 降解而擴散釋放（Tarvainen et al., 2006； Wang et al., 2004）。若是藥物釋 放速率穩定並可達有效濃度，則可為有潛力發展之輸送系統。

Time

第三節 應用於控制釋放的高分子

早期有許多高分子物質應用於生物領域，主要是因為特殊的物理性 質，例如 Polyurethanes（PU）有良好的彈性可發展為醫用人工臟器；矽膠

（Silicones）有絕緣性並具備生物相容性以及熱安定性等特點，而成為生醫 用途的材料；Polymethyl methacrylate（PMMA）透明、質輕又具備物理強 度，可作為硬性隱形鏡片；Polyethylene（PE）的膨脹係數小可作為外科手 術的縫線或是人造血管的材料；Poly(vinyl pyrrolidone)（PVP）的良好懸浮 能力，在食品加工上作為品質改良用、釀造用及食品製造用劑。

近年來可降解性高分子被廣泛應用於生物醫學技術和醫學治療上，舉 凡藥物輸送系統（Heller 1984）、外科手術使用之可吸收線材（Chu 1985）、

血管支架（Agrawal et al., 1992）和組織重生的植入物（Cima et al., 1991）、

癌症的局部治療（Brem et al., 1993； Schold et al., 1991）、疫苗的開發（Alonso

et al., 1993）等。

利用於侵蝕控制釋放系統的高分子，即為可降解性高分子，這類高分 子物質通常具有可水解之鍵結，如酯基、醯胺基、尿素基等，主要可分為 天 然 高 分 子 和 人 工 合 成 高 分 子 兩 大 類 。 天 然 高 分 子 ， 如 ： 膠 原 蛋 白

（Collagen）、褐藻酸鹽（Alginate）、透明質酸（Hyaluronic acid）、明膠

（Gelatin）、幾丁質（Chitin）、幾丁聚醣（Chitosan）等，這些天然高分子 純化及商品量化困難且成本高，材料本身的機械強度較差，抗分解能力及

分解速度控制不容易，於是人工合成之可降解高分子高度被研究應用，包 括聚醚類、聚胺類、聚酯類，常見者為：聚乳酸（Polylactic acid, PLA）、聚 甘 醇 酸 （ Polyglycolic acid, PGA ）、 乳 酸 和 甘 醇 酸 共 聚 物

（ Poly(lactide-co-glycolides), PLGA）、聚酐（Polyanhydrides）、聚原酸酯

（Polyorthoesters）等，其中又以聚酯類最被廣泛使用，如PLA、PLGA等。

所有高分子都會降解，以降解發生所需時間之長短可區分為長時間才會降 解之「非降解性高分子（Non-degradable polymer）」與短時間內可降解之「降 解性高分子（Degradable polymer）」。高分子降解可由諸多形式促成，如：

光裂解、熱裂解、機械性裂解、化學性裂解等（Gopferich, 1997），所謂生 物可降解性高分子，則是可在生物體內經由水解（Hydrolysis）或由生物環 境中的因子如：鹽離子、酵素催化水解。許多學者曾針對高分子「降解

（Degradation）」和「侵蝕（Erosion）」提出不同定義，一般而言「降解」

指的是高分子骨幹鍵結被切斷形成寡聚物（Oligomer）經一連串水解斷鍵最 後產生單體（Monomer）的連續過程，而「侵蝕」是指經由高分子斷裂成 之寡聚物或單體被釋出而致原高分子減少質量之結果（Tamada and Langer, 1993）。高分子在生物體內降解的過程包含三步驟：一開始水滲入高分子主 體，也可能伴隨發生高分子膨脹的現象，接著高分子水解產生寡聚體或單 體等水溶性產物，進而使高分子微結構改變並形成許多孔洞使產物分子釋 放至周遭環境中以致高分子質量減少（Mathiowitz et al., 1993）。尤其聚酯類

高分子，其水解是一種自我催化（Autocatalysis）的降解機制，由於其降解 產物造成高分子主體內部pH值改變而調控了降解的速率（Li and McCarthy, 1999）。一些可降解性高分子其組成成分為生物體內可自然代謝之分子如 PLA和PLGA，故以此高分子之各種植入物的形式置於生物體內，可藉由其 在生物體內的降解 並依體內自然代謝機制排出體外，而不致造成體內代謝 上的障礙（Vert et al., 1981），因此這些高分子一般具有良好之生物相容性

（Biocompatible），也省去植入後再經外科手術取出之麻煩。

並非每一種高分子物質或藥物都可設計成理想的藥物控制釋放系統，

亦即無法達成穩定的零級釋放速率，因此在設計藥物控制釋放系統時必須 考量高分子本身特性及影響其降解的諸多因素。以高分子本身特性而言，

會 影 響 高 分 子 降 解 之 因 子 ， 也 就 能 參 與 調 控 物 質 或 藥 物 釋 放 之 速 率

（Gopferich, 1997），甚至藥物和高分子間之交互作用，也是影響藥物釋放 速率之重要因子。

諸多影響控制釋放系統高分子降解速率及藥物釋放速率的因素如下：

（1） 鍵的種類：高分子骨幹（Backbone）上鍵結的形式決定水解的速率。表 1-1為各類型鍵結水解之速率。（Gopferich, 1996）

表 1-1.各類型可水解之鍵結與半生期。（Gopferich, 1996）

（2） pH值：pH值的改變會催化高分子水解，特別是以酯鍵（Ester bond）

聚合而成之高分子，可經由酸或鹼催化分解（Gopferich, 1996）。

（3） 溫度：在高於高分子玻璃轉移溫度Tg值（Glass transition temperature）

之上的溫度下，其降解速率也會增加（Li and McCarthy, 1997）。

（4） 高分子共聚物的組成成分：共聚高分子物質因其共聚比例之不同，可 能有不同的物理性質如玻璃轉移溫度Tg（Gopferich, 1996）或親疏水 性程度不同，因而也造成降解速率之差異（Wang et al., 2004）。

（5） 高分子的親水性程度：愈是親水性高分子在含水的環境中攝水量較

多，也提升高分子的降解速率（Ron et al., 1993）。

（6） 高分子的分子量：在許多研究中指出，高分子分子量減少時，攝水量 增加更加速高分子的降解。

（7） 高分子系統的形狀及大小：高分子被設計成不同的植入物形狀如薄膜 或是微粒其降解速率也呈現不同結果（Witt and Kissel, 2001）。

（8） 藥物融入高分子的濃度：藥物比例愈高，burst effect 的量愈多，藥物 比例愈低，則釋放的總量愈少。（Wang et al., 2004）

（9） 包埋的藥物或物質和高分子間之交互作用力：藥物的親疏水性、酸鹼 性、極性等，和選用的高分子是否產生強的交互作用，在降解過程是 否會破壞藥物活性，若是包埋蛋白質類的物質時更須注意在降解過程 中是否因此造成蛋白質變性 (Denaturation)、凝結 (Aggregation)或降 解等。

在高分子降解過程中可觀察到某些性質的改變，如:結晶產生、pH值改 變、分子量降低、攝水量增加、質量減少、微結構改變、體積膨脹、孔洞 增加等（Li and Vert, 1994；Wang et al., 2004；Li and McCarthy, 1999；Jimoh

et al., 1995；

PLA和PLGA等高分子常見用於控制釋放，茲就其控制釋放與降解特性 分述如下：

Polylactic acid 或 Polylactide (PLA) 是由乳酸為單體經熱催化開環聚

合而成之高分子，其反應式如圖1-6，為具有生物可降解、熱塑性之脂肪族

聚酯類聚合物。

錯誤!

圖1-6. PLA 之開環聚合反應式。

已有許多學者進行此高分子降解特性之研究（Li et al., 1990； Vert et al., 1991; Therin et al., 1992； Grizzi et al., 1995），也因此常被用為藥物控制釋 放系統的基材。PLA在37℃、pH＝7.4的環境中之降解機制為：一開始位於 表面水溶性的寡聚體產物先行擴散並溶於介質中，而降解後表面形成之羧 基（Carboxylic end group）則被緩衝液中和，最後結果是表面降解慢於內部 降解（Li and McCarthy, 1999）。相對於其他可降解性高分子，PLA的降解速 率較慢，尤其在PLA分子量極大時要降解並不容易，必須在15000g/mol以下 才會有明顯的降解發生（Pitt et al., 1981），此時高分子的滲透性和親水性也

隨之增加（Lamprecht et al., 2000）。由於其為聚酯化合物易受酸或鹼催化水 解，故酸性藥物包埋於此基材會增強酯鍵水解而加速其降解速率（Vert et al., 1991； Tarvainen et al., 2006）；而鹼性藥物包埋於此基材中，則可能因為鹼 催化酯鍵水解而加速降解（Tarvainen et al., 2006； Maulding et al., 1986），

也可能因為鹼中和了高分子末端的羧酸根而抑制降解（Bodmeier and Chen, 1989； Mauduit et al., 1993）；至於中性藥物，親水性藥物增強其降解，而 疏水性藥物則抑制其降解（Vert et al., 1991）。沒有添加塑化劑的PLA薄膜

（Mw∼250000）其玻璃轉移溫度Tg為43.5℃，低於此溫度時高分子是玻璃 相，不具彈性不易延展，抗壓性亦差（Kranz et al., 2000），若要以此高分子 為基材做為生物體植入物則可能不夠柔軟適用。

Polyglycolide 或 Polyglycolic acid (PGA) 是由甘醇酸為單體經熱催化

開環聚合而成之高分子，其反應式如圖1-7，也是生物可降解、熱塑性之脂

肪族聚酯聚合物。

圖1-7. PGA 之開環聚合反應式。

由於可溶解 PGA 的溶劑有限，少有單獨以此高分子做為控制釋放基

材，然而卻可將之與它種高分子共聚以改變其降解釋放特性，如PLGA。

PLGA 是 目 前 最 廣 泛 被 用 來 做 為 控 制 釋 放 基 材 的 高 分 子 材 料

（Brannon-Peppas, 1995； Athanasiou et al., 1996），它是由乳酸和甘醇酸兩 種單體經由不規則的開環加成反應形成之共聚聚合物（Copolymer），其共 聚結構如圖1-8。

圖1-8. PLGA是由乳酸和甘醇酸以不定比例共聚而成。

PLGA 的降解機制也是經由酯鍵的水解，釋放出的單體即為乳酸和甘醇 酸，具有生物可降解性及生物相容的特性（Jain et al., 1998），PLGA 高分子 之 Tg 值同 PLA 會隨分子量減少而降低，甚至會隨 PLGA 中乳酸比例下降 而降低（Omelczuk and McGinity, 1992； Engelberg and Kohn, 1991），推測 聚乳酸是較為疏水性(Hydrophobic)之分子，而聚甘醇酸是較為親水性之分 子，所以共聚成之PLGA 若甘醇酸含量提高則親水性較 PLA 明顯，降解速 率也快於PLA（Kranz et al., 2000）。於是用於控制釋放系統之 PLGA 則可

X: 乳酸單體之數目 Y: 甘醇酸單體之數目

藉由其乳酸和甘醇酸的比例調整其物理特性，再者由於分子量和乳酸對甘 醇酸之比例同為影響降解速率之重要因子，故可同時調控藥物釋放之速率

（Park, 1994）。

綜合許多以可降解性高分子為基材的控制釋放研究報告，諸如高分子 的組成成分、高分子微結構、分子量、親疏水性、共聚物的單體比例和單 體在聚合時的排列方式、高分子和藥物的交互作用、pH值、鹽的濃度、製 成的植入物形狀、植入之部位、高分子吸附環境中的物質如水、脂質、離 子的特性，和高分子因水或酵素催化降解之機制等因素都會影響藥物自高 分子中釋放的速率（Tarvainen et al., 2006； Hutchinson and Furr, 1990； Li and McCarthy, 1999； Witt and Kissel, 2001； Bayomi, 1994； Miyajima et al., 1998； Sung et al., 1998； Rothen-Weinhold et al., 1999； Vogelhuger et al., 2001），此外，在研究也顯示控制釋放系統添加的藥量也會左右釋放的速率

（Tarvainen et al., 2006）。因此利用適合於生理條件下適度降解以達藥物穩 定釋放速率之高分子，將可成為藥物輸送之良好媒介。

第四節 秋水仙素

秋水仙素（Colchicine；N－［（7S）－5,6,7,9,－tetrahydro－1,2,3,10－

tetramethoxy－9－oxobenzo［a］heptalen－7－yl］acetamide）是一種取自秋 水仙（Colchicum autumnale）等百合科植物（Liliaceae）球莖或種子的生物 鹼（Alkaloids），外觀為淡黃色針狀結晶，食用進入體內經由肝、腎代謝，

具有毒性，攝入過量會引起發燒、噁心、嘔吐、呼吸困難、血尿、腹瀉、

腹痛，由於秋水仙素也會累積於心臟，更嚴重時則會引發心血管破裂、血 小 板 減 少 、 顆 粒 性 白 血 球 缺 乏 症(Agranulocytosis) 、 橫 紋 肌 溶 解 症 (Rhabdomyolysis)、甚至肝腎等多重器官衰竭致死（Sauder et al., 1983；

Stapczynski and Rothstein, 1981； Folpini and Furfori, 1995； Kintz et al., 1997； Milne and Meek, 1998； Dehon et al., 1999； Deveaux et al., 2004），

目前對於秋水仙素中毒並無治療之特效藥。早自1763 年，秋水仙素被用作 為治療風濕類疾病，特別是痛風（Gout）的藥物（Nadius et al., 1977），有 時也因其能引發嘔吐腹瀉之故，臨床醫學上引用為瀉藥和催吐劑，美國食 品與藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)已經核准將秋水仙素 作為治療痛風和家族性地中海熱（Familial Mediterranean fever）（Zemer et al., 1991）、類澱粉變性病（Secondary amyloidosis (AA)）和硬皮病（Scleroderma）

（Alarcon-Segovia et al., 1979）之藥物。秋水仙素的分子式為 C₂₂H₂₅NO₆， 結構式如圖1-9 ：

圖1-9. Colchicine 之結構式。

秋水仙素的生化功能相當特殊，它是一種具有三環結構的分子，其中A

環上有三個甲氧基(Trimethoxyphenyl)，B 環上有一個乙醯基（Acetyl），C 環則為托酚酮（Phenyltropolone），其中 A 環和 C 環具有和 Tubulin 結合之 活性，可防止Tubuline 的聚合（Polymerization）而抑制 Microtubule 生成，

因而將有絲分裂（Mitosis）停頓於間期（Metaphase），也會抑制嗜中性球

（Neutrophil）的運動與活性，而有抗發炎的效用（Andreu et al., 1998；

Banerjee et al., 1997； Hastie and Rava, 1989）。基於其特性，許多學者也嘗 試研究將之應用於許多免疫和發炎方面的疾病如：貝雪氏症（Bechet's disease）（Masuda et al., 1989）、原發性膽汁鬱積性肝硬化（Primary Biliary Cirrhosis, PBC）（Kaplan et al., 1986）、阿滋海默症（Alzheimer's disease, AD）

（Weiner et al., 1998），近來更有商品化之藥物將秋水仙素結合抗發炎藥物 Olsalazine 應用於治療激燥性結腸症（Constipation-predominant irritable

A C B

bowel syndrome）。現在有許多學者將秋水仙素或其衍生物應用於治療癌症 的研究（Staretz and Hastie, 1993； Helms et al., 1995； Berg et al., 1997；

Bagnato et al., 2004； Bombuwala et al., 2006），目的是想藉由秋水仙素停頓 有絲分裂的特性抑制癌細胞的增生。

秋水仙素在光存在下不安定，是對光極為敏感之物質，經由光照行光 化學反應，其光反應式如圖1-10。

圖1-10.秋水仙素之光化學反應式。（Nery et al., 2001）

Colchicin

γ-LC β－LC

α－LC

秋水仙素經由光照後，在 C 環－托酚酮（Tropolone ring）結構上會行 環 異 構 化 反 應 （Cycloisomerization ） 生 成 β-lumicolchicine (β-LC) 和 γ-lumicolchicine (γ-LC)兩種產物，互為順、反異構物，若將光產物持續照光 則會生成 β-LC(β-lumicolchicine)的二聚體（Dimer），即 α-lumicolchicine

（α-LC）（Forbes, 1995）。許多學者的研究指出，經由不同溶劑萃取光照產

物β-LC 和 γ-LC 之比值雖不盡相同，β-lumicolchicine 仍是秋水仙素最主要 的光產物（孫,2003； Nery et al., 2001）。由於 β-lumicolchicine 具有與 Colchicine 相異之 C 環，故與 Tubulin 結合的能力並不如秋水仙素（Ray et al., 1981），而喪失了抑制細胞有絲分裂的功能。

第五節 研究目的

藥物控制釋放是一種為使藥物於體內達到預期釋放速率之技術，能 使藥物釋放於體內達長效之有效濃度，在設計良好之釋放系統下，亦能 使具有較強毒性之藥物作用於局部組織減少傷害正常細胞生理功能。

降解性高分子是一種良好之藥物輸送基材，其中又以 PLGA 最為 廣泛被使用，其兼具生物合適性與可降解之特性，能助使藥物送入體內 特定部位，但由於必須使藥物經其穩定之降解特性達到零級釋放，是故 需考量影響其降解之因素，本研究以乳酸和甘醇酸之共聚比、PLGA 之 分子量大小、及藥物與PLA 和 PLGA 高分子間之作用力等因子為主要探 討方向。

目前被研究的抗癌藥物種類繁多，其中抗癌機制各有不同，而秋水 仙素經研究證實會與 Tubulin 結合以抑制細胞分裂，使細胞週期停頓於間 期，故有潛力成為新的抗癌藥物之一，但秋水仙素是光敏感性藥物，在保 存上需注意避光。本研究選用秋水仙素作為控制釋放技術之標的，因其特 殊之生理活性足以抑制腫瘤細胞，卻又具有致死之毒性不適用於直接口 服，故以體外釋放研究其釋放速率之特性，作為將秋水仙素應用於抗癌之 參酌。再者，由於秋水仙素之光敏感性，也藉此實驗研究高分子基材與藥 物之交互作用是否抑制光對光敏性藥物活性之破壞，探討以高分子控制釋 放作為光敏劑維持正常活性之可行性。

第二章 實驗材料與實驗儀器

第一節 實驗藥品與器材

（1）秋水仙素：Colchicine

廠牌：Sigma Lot no.：056K1180 分子量：MW:399.44 m.p.：150℃

（2）聚乳酸：PLA（Polylactide）

廠牌：Sigma Lot no.：075K1361 平均分子量：MW:85000∼160000

（3）聚乳酸甘醇酸：PLGA50：50（Poly(lactic-co-glycolic acid)）

廠牌：Sigma Lot no.：036K1379 平均分子量：MW：40000∼75000

（4）聚乳酸甘醇酸：PLGA50：50（Poly(lactic-co-glycolic acid)）

廠牌：興技生物科技公司 Lot no.：3A01904005001 平均分子量：MW：35000∼65000

I.V.：0.30∼0.49 dl/g Tg：39∼44℃

（5）聚乳酸甘醇酸：PLGA75：25（Poly(lactic-co-glycolic acid)）

廠牌：興技生物科技公司 Lot no.：3A01306505001 平均分子量：MW：65000∼130000

I.V.：0.50∼0.79 dl/g Tg：42∼47℃

（6）二氯甲烷 ：Dichloromethane，2.5L 裝，試藥級 廠牌：Acros organics Lot no.：A014940801

密度：1.325 g/m 分子量：MW：84.93

（7）PBS 緩衝液：Phosphate buffered saline 10× concentrate 廠牌：Sigma Lot no.：016K6081

成分：10 mM sodium phosphate，pH∼7.4 and 0.9％ NaCl

（8）甲醇:Methanol

廠牌：Mallinckrodt chemicals Lot no.：C33E24

（9）乙腈：Acetonitrile

廠牌：U. T. Baker Lot no.：C38805 分子量：41.05

（10）二次水

（11）燒杯：20ml，no.1000 ，Pyrex

（12）錐形瓶：1000ml，Tai Fong

（13）玻璃瓶：20ml

第二節 實驗儀器

高效液相層析法(High performance liquid chromatography ，HPLC)是分 離技術中相當重要的一種方法，適用於半揮發性和非揮發性化合物或遇熱 易被裂解的待測物。應用此方法進行分析的先決條件是標的待測物必須溶 於作為移動相的溶劑中，移動相的溶劑在加壓的狀況下輸送，其作用原理 係藉移動相通過靜相達到分離的效果，混合物中的各成份在靜相和移動相 之間的分配係數不相同(即親和力不同)，使其在管柱中的滯留時間不相同 而得以分離出來，若化合物與靜相親和力較強，則沖提較慢(即滯留時間 長)，而化合物與移動相的親和力較強，則沖提較快(即滯留時間短)。待測 標的物之分子量適用範圍由數十至數十萬，使用分析型管柱之測定極限可 至 pg。光電二極體陣列檢測器（Photo diode array detector, PDA）與紫外光

－可見光（UV-VIS）檢測器的原理非常相似，都是利用光波來測量析出物

（Elution）的光吸收度（Absorbance），有別於 UV-VIS 只能偵測某一特定 波長的吸收度，PDA 檢測器可測得析出物之全光譜。因此，HPLC－PDA 除了傳統的二維層析譜之外， 還能同時提供光譜資料，得到三維資料，即 滯留時間（Retention time）、吸收度、與吸收光波長。此外，HPLC－PDA 除了具備HPLC 分離與純化物質的功能外，更可由析出峰作為純度的檢定，

以判斷是否有共析物（Coelution）的存在，經由比對析出物的光譜，亦能 鑑別其成分，對於成分複雜的天然物之分離及分析有特別顯著之效果。

（1）HPLC 實驗儀器設備

高效能液相層析儀（HPLC－PDA）

光電二極體陣列檢測器 Waters 2996 PDA，Waters 溶劑輸送梯度幫浦 Waters 600E，Waters

控制暨積分軟體 Empower，Waters

C₁₈層析管柱 3.9×300mm I.D. μBondapak C₁₈ 10-μm，Waters 手動微量注射器 Rheodyne 7725i

線上脫氣幫浦 In-Line Degasser AF，Waters

（2）抽真空幫浦 Commercial Motors G8GCX，Ge

（3）超音波震盪器 Ultrasonic cleaner D150

（4）微量滴管 Witopet digital，Witeg

（5）微量注射器 702SNR 25μL SYR，Hamilton

（6）微量天平 AB54-S Max：51g Min：10mg ，Mettler Toledo

第三章 實驗方法

（一）秋水仙素之迴歸分析

將秋水仙素溶於甲醇，配製成濃度分別為0.6、0.35 及 0.25μg/μL 等三 種標準溶液（Standard solution），在室溫下分別將三種標準溶液稀釋為 0.1∼0.0001μg/μL，如表 3-1 所示。每個樣本溶液取 20μL 注入 HPLC 偵測，

進行迴歸分析。

標準溶液 濃度（μg/μL） 樣本溶液 濃度（μg/μL） Amount（ng）

A 0.6 a 0.1 2000

b 0.05 1000

B 0.35 c 0.01 200

d 0.005 100

C 0.25 e 0.001 20

f 0.0001 2

表3-1.配製進行迴歸分析之 sample solutions。

（二）秋水仙素光反應之迴歸分析

將秋水仙素溶於水中配成濃度為0.1μg/μl 之標準溶液，分別進行 0、1、

2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、60 小時之光照（以15W 之日光燈 距樣本20cm 處連續照光）。每個Sample solution 在照光後取 20μL 注入 HPLC

（梯度泵送系統：等位沖提（Isocratic elution）之沖提液：Acetonitrile 30%：

Water 70%；沖提速率：1.5 ml/min；解析度：1.2 nm；偵測範圍：210 nm ∼ 400 nm）偵測秋水仙素及其主要光產物β-LC 的量，進行迴歸分析。

（三）高分子薄膜之製備

先秤量直徑2.4 公分之圓形玻璃瓶空瓶質量，再秤取約 0.1 克的 PLA 高分子置於瓶中，加入1.5ml DCM 待其溶解，置於室溫下揮發一天後改放 入真空乾燥器，每日抽氣二次使溶劑揮發至質量不再改變，秤量玻璃瓶含 薄膜之質量。

製得之薄膜重＝玻璃瓶含薄膜之質量－玻璃瓶空瓶質量。

PLGA 50：50、PLGA 75：25 的高分子薄膜也依上述方式製備。

（四）含秋水仙素高分子薄膜之製備

先秤量直徑2.4 cm 的圓形玻璃瓶空瓶質量，再秤取約 11.1mg 的

Colchicine 和 0.1g 的 PLA 放入玻璃瓶內，加入 1.5ml 的 DCM，置於室溫避 光處待其溶解並揮發，一天後改放入真空乾燥器，每日抽氣兩次將溶劑揮 發至質量不再改變，秤量玻璃瓶含薄膜之質量。

製得之含秋水仙薄膜重＝玻璃瓶含薄膜之質量－玻璃瓶空瓶質量。

PLGA 50：50、PLGA 75：25 含秋水仙素高分子薄膜也依上述方式製備。

（五）高分子薄膜的降解

形成 PLA 高分子薄膜的玻璃瓶加入 PBS 緩衝液（pH=7.4）2ml 後，置 於室溫下，2 小時後倒掉 PBS 溶液，接著加入甲醇 10ml 沖洗玻璃瓶後倒棄，

約10 至 15 分鐘使甲醇揮發後秤重，測量薄膜之濕重。秤重完將玻璃瓶放 至真空乾燥器揮發三天，每天抽氣兩次，至質量不再改變後秤重，測量薄 膜之乾重。每次秤完乾重後加入新鮮的PBS 溶液 2ml。

依上述步驟分別測量浸泡PBS（pH=7.4）緩衝液 2 小時、 6 小時、12 小時、1、2、3、5、7、9、11、14、17、21、28 天的薄膜濕重與乾重。

PLGA 50：50、PLGA 75：25 的高分子薄膜降解也依上述步驟。

（六）秋水仙素體外控制釋放

形成PLA/Colchicine高分子薄膜的玻璃瓶加入PBS緩衝液（pH=7.4）2ml 靜置約10分鐘，倒出PBS溶液，取20μl注入HPLC測量Colchicine的釋放量（梯 度泵送系統：等位沖提之沖提液：Acetonitrile 30%：Water 70%；沖提速率：

2 ml/min；解析度：1.2 nm；偵測範圍：210 nm ∼ 400 nm）。接著在玻璃瓶 內加入10ml甲醇沖洗玻璃瓶後倒棄，約10至15分鐘待甲醇揮發後秤重，測 量薄膜之濕重。秤重完將玻璃瓶放至真空乾燥器揮發三天，每天抽氣兩次，

至質量不再改變後秤重，測量薄膜之乾重。每次秤完乾重後加入新鮮的PBS 緩衝液2ml。

依上述步驟分別測量2 小時、6 小時、12 小時、1、2、3、5、7、9、

11、14、17、21、28 天的 Colchicine 釋放量及薄膜質量變化。

PLGA 50：50/Colchicine、PLGA 75：25/Colchicine 高分子薄膜也依上 述方式測量體外釋放速率。

（七）光照高分子薄膜之控制釋放

先秤量直徑2.4 cm 的圓形玻璃瓶質量，再秤取約 11.1mg 的 Colchicine 和0.1g 的 PLA 放入玻璃瓶內，加入 1.5ml 的 DCM 待其溶解，並置於距離 15 瓦日光燈管 20 公分處照光 24 小時，之後改放入真空乾燥器，每日抽氣 兩次將溶劑揮發至質量不再改變，秤量玻璃瓶含薄膜之質量。

形成PLA/Colchicine 高分子薄膜的玻璃瓶加入 PBS 緩衝液（pH=7.4）

2ml 靜置約 10 分鐘，倒出 PBS 溶液，取 20μl 注入 HPLC 測量 Colchicine 的釋放量。接著在玻璃瓶內加入10ml 甲醇沖洗後倒棄，約 10 至 15 分鐘待 甲醇揮發後秤重，測量薄膜之濕重。秤重完將玻璃瓶放至真空乾燥器揮發 三天，每天抽氣兩次，至質量不再改變後秤重，測量薄膜之乾重。每次秤 完乾重後加入新鮮的PBS 緩衝液 2ml。

依上述步驟分別測量2 小時、6 小時、12 小時、1、2、3、5、7、9、

11、14、17、21、28 天的 Colchicine 釋放量及薄膜質量變化。

PLGA 50：50/Colchicine、PLGA 75：25/Colchicine 高分子薄膜也依上 述方式進行光照實驗。

第四章 實驗結果與討論

第一節 秋水仙素之 HPLC 迴歸分析

秋水仙素通過層析管柱的時間約為 4.35 min 左右，各峰所滯留的時間

（Retention time）有隨濃度變小而延長的現象，如圖 4-1 所示，其滯留時間

範圍約為4.312∼4.403 min 之間，從濃度 0.1∼0.0001μg/μl 間之滯留時間變化 約在0.091 min 之內。由此結果顯示，秋水仙素之滯留時間會隨濃度而有所 改變，但其變化量微小，對結果影響不大。

圖4-1.利用 254nm 偵測濃度為 0.1μg/μl、0.05μg/μl、0.01μg/μl、0.005μg/μl、

0.001μg/μl、0.0001μg/μl 秋水仙素溶液之層析結果，每一濃度溶液三重覆。

秋水仙素溶液在滯留時間4.35 min 之析出峰光譜圖及 3D 圖如圖 4-2 所 示。此光譜圖與文獻（Alali et al., 2004）所記載之秋水仙素吸收光譜吻合，

故可確定此析出物為秋水仙素。

圖 4-2.在 4.35 min 時之秋水仙素：

（a）光譜圖：秋水仙素的吸收光為 243.8nm 和 352.2nm （b）3D 圖：RT 4.35 min 時為秋水仙素

不同濃度之秋水仙素溶液其秋水仙素含量與析出峰面積之線性迴歸如 圖 4-3 所 示 ， 其 結 果 顯 示 ， 在 實 驗 中 的 秋 水 仙 素 溶 液 範 圍 內

（0.1∼0.0001μg/μl），秋水仙素之含量與析出峰面積呈線性關係。

(a)

(b)

圖4-3.利用不同濃度之秋水仙素溶液經 HPLC 析出含量所繪製層析面積對秋水仙素 質量之迴歸分析圖。

校正曲線 Y=1.51×10³X-3.09×10⁴，決定係數R2=0.995728。

第二節 光照秋水仙素之 HPLC 分析

利用濃度為0.1μg/μl 的秋水仙素標準溶液在不同光照時數下（0、1、2、

3、4、6、8、10、12、24、36、48、60 小時）進行 HPLC 分析，其層析結 果如圖 4-4 所示。由於光照秋水仙素會使秋水仙素結構中之 C 環行環異構 化反應產生主要光產物β-lumicolchicine（β-LC），由圖中可知在 HPLC 偵測 之滯留時間11.7min 左右會出現β-LC。

圖4-4.利用 254nm 偵測濃度為 0.1μg/μl 的秋水仙素標準溶液不同光照時數（0∼60 小 時）之秋水仙素及β-LC 之層析結果。

β-LC 在滯留時間 11.717 min 之析出峰光譜圖及 3D 圖如圖 4-5 所示。

圖4-5. 在 11.717 min 時為 β-lumicolchicine：

（a）光譜圖：β-LC 的吸收光為 222.5nm、266.3nm 和 337.8nm （b）3D 圖：RT 11.717 min 時為 β-LC

(a)

(b)

以HPLC 偵測不同光照時數之秋水仙素溶液其秋水仙素及 β-LC 含量結 果如表4-1，在光照 24 小時後之 β-LC 比例約為 0.933%∼1.05%。

光照 colchicine β-Lumicolchicine

RT Area Height RT Area Height

0 hr 5.571 5588938 243699 Missing Missing Missing 1 hr 5.607 5616950 243207 Missing Missing Missing 2 hr 5.643 5609347 240125 Missing Missing Missing 3 hr 5.789 5683290 238501 Missing Missing Missing 4 hr 5.814 5730354 228449 Missing Missing Missing 6 hr 5.805 5601839 222638 Missing Missing Missing 8 hr 5.841 5620293 222696 Missing Missing Missing 10 hr 5.842 5668618 225898 11.815 19895 628 12 hr 5.812 5553059 220850 11.765 35743 946 24 hr 5.803 5479952 217457 11.803 51612 1800 36 hr 5.803 5364932 214010 11.791 76810 2694 48 hr 5.794 5305395 211811 11.776 119228 3935 60 hr 5.829 5211714 208286 11.814 175608 5312

光照 colchicine β-Lumicolchicine

RT Area Height RT Area Height

0 hr 5.863 5626643 232928 Missing Missing Missing 1 hr 5.856 5604787 230971 Missing Missing Missing 2 hr 5.845 5563576 229364 Missing Missing Missing 3 hr 5.882 5594147 230617 Missing Missing Missing 4 hr 5.681 5596977 238893 Missing Missing Missing 6 hr 5.714 5536107 235475 Missing Missing Missing 8 hr 5.764 5550264 234087 Missing Missing Missing 10 hr 5.910 5480847 224968 11.574 29005 896 12 hr 5.855 5530730 226212 11.607 19817 789 24 hr 5.919 5434452 219537 11.765 57748 1946 36 hr 5.913 5279776 215744 11.581 92052 3068 48 hr 5.907 5252822 215679 11.528 138926 4379 60 hr 5.922 5124236 209642 11.544 194242 5852

表 4-1.利用 HPLC 偵測不同光照時數之秋水仙素及 β-LC 之滯留時間及面積。

5000000 5100000 5200000 5300000 5400000 5500000 5600000 5700000 5800000

0 20 40 60 80

光照時間(小時) 層

析 面 積

第一次 第二次

-50000 0 50000 100000 150000 200000 250000

0 20 40 60 80

光照時間(小時) 層

析 面 積

第一次 第二次

圖4-6.經由光照 0 至 60 小時的 HPLC 層析面積對時間之變化。

(a)秋水仙素(b)β-LC (a)

(b)

第三節 高分子薄膜的降解

薄膜的製備是將約0.1 克的高分子置入玻璃瓶，加入 1.5ml DCM 待其 溶解，於室溫下揮發一天後改放入真空乾燥器，每日抽氣二次使溶劑揮發 至質量不再改變。

在高分子薄膜降解實驗中，加入 PBS 緩衝液（pH=7.4）於盛裝高分子 薄膜之玻璃瓶後數小時，可以看見瓶底之高分子薄膜由透明無色變為乳白 色。實驗過程中，PLA 薄膜容易自玻璃瓶脫落，而 PLGA 薄膜則至 28 天後 仍與玻璃瓶緊密黏附。

在測量高分子薄膜降解之質量變化時，高分子薄膜的玻璃瓶分別加入 PBS 緩衝液（pH=7.4）2ml 後，置於室溫下，經過預定時間後倒掉 PBS 溶 液，接著加入甲醇 10ml 沖洗玻璃瓶後倒棄，約 10 至 15 分鐘使甲醇揮發後

秤量薄膜之濕重（薄膜濕重＝濕的薄膜含瓶重－空瓶重），秤重完將玻璃瓶

放至真空乾燥器揮發，每天抽氣兩次，至玻璃瓶之質量不再改變，秤取質 量作為薄膜之乾重（薄膜乾重＝乾燥之薄膜含瓶重－空瓶重）。

圖 4-7 為 PLA、PLGA50:50、PLGA50:50(sigma)、PLGA75:25 薄膜分 別浸泡 0 小時和 2 小時後，72 小時內乾燥過程之質量變化。根據實驗結果 顯示，薄膜乾燥之結果均以在乾燥器乾燥三天後質量趨於穩定，於是本實 驗其餘薄膜浸泡後之乾燥天數以三天為乾燥日數，其所秤量之質量是為薄 膜之剩餘質量。

105 110 115 120 125

0 20 40 60 80

乾燥時間(小時) 薄

膜 質 量︵ m

g︶

PLA PLGA75:25 PLGA50:50 PLGA50:50(sigma)

102 107 112 117 122

0 20 40 60 80

乾燥時間(小時) 薄

膜 質 量︵ m g︶

PLA PLGA75:25 PLGA50:50

PLGA50:50(sigma)

圖4-7.PLA、PLGA50:50、PLGA50:50(sigma)、PLGA75:25 薄膜分別在浸泡 PBS 溶液不同時間後乾燥三天內之質量變化。

（a）薄膜浸泡 0 小時（b）薄膜浸泡 2 小時。

圖4-8 所示為分別以 PLA 和 PLGA 薄膜進行 in vitro 降解實驗的質量 減少平均速率，由圖中可以看出此實驗在開始以 PBS buffer 浸泡的前幾個 天，不論是 PLA 或是 PLGA 薄膜的質量都緩慢減少，自 17 天後則出現快

(a)

(b)

慢不同的降解速率，其中以 PLGA50:50 薄膜的降解速率最快，PLGA75:25 薄膜次之，而PLA 薄膜的降解速率最慢。

圖4-8. 分別以 PLA、PLGA75:25、PLGA50:50、PLGA50:50(sigma)薄膜 進行in vitro 降解 28 天之質量減少平均速率。

圖4-9 為分別以四種高分子薄膜進行體外降解 28 天之剩餘質量(％)。

70 75 80 85 90 95 100 105 110

0 200 400 600 800

時間 薄

膜 餘 重(

%)

PLA PLGA75:25 PLGA50:50 PLGA50:50sigma

圖4-9.分別以 PLA、PLGA75:25、PLGA50:50、PLGA50:50(sigma)薄膜 進行in vitro 降解 28 天之剩餘質量(％)。

-4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

0 200 400 600 800

時間(小時) 質

量 平 均 減 少 速 率

PLA

PLGA75:25 PLGA50:50 PLGA50:50(si gma)

經由28 天的浸泡，PLA 薄膜剩餘質量為 98%，減少了 2%，PLGA75:25 薄膜剩餘質量為 94.3%，減少比例為 5.7%，PLGA50:50 薄膜剩餘質量為 79.9%，減少比例為 20.1%，PLGA50:50(sigma)薄膜剩餘質量為 95.4%，減 少比例為4.6%。相較之下，PLGA 薄膜的質量減少比例均大於 PLA 薄膜，

此結果與文獻結果相同（Kranz et al., 2000），主要因素可能為 PLA 相較於 PLGA 高分子有較高之疏水性，因而使得較為親水之 PLGA 易使水滲入 PLGA 表面造成 PLGA 降解快於 PLA；而比較不同比例的乳酸甘醇酸之 PLGA 高分子之降解速率，其中含有較高乳酸比例之 PLGA75:25 高分子薄 膜也因乳酸之疏水性而有較PLGA50:50 為慢之降解速率；若以乳酸甘醇酸 比例相同之 PLGA50:50 高分子相比，由於兩者之分子量不同，PLGA50:50 的分子量小於PLGA50:50(sigma)，兩者的降解速率以 PLGA50:50 分子量小

者為快。然而，這些高分子薄膜於17 天內的質量減少比例均偏低，推測可

能是本實驗所使用之PLA 高分子分子量為 85000∼160000，PLGA75:25 高分 子之分子量為65000∼130000，PLGA50:50 高分子之分子量為 35000∼65000，

PLGA50:50(sigma)高分子之分子量為 40000∼75000，四者的分子量都偏高，

由於高分子之分子量愈大，玻璃轉移溫度（Tg）越高，所選用之四種高分 子之Tg 值均高於 37℃，在室溫下形成的是不具彈性與塑性之薄膜，性質類 似玻璃結晶，水分的吸收不容易，於是實驗中以緩衝液浸泡高分子薄膜，

理論上會因高分子吸收水分水解而加速高分子降解卻因具有較高之分子量

與較高之Tg 值而使其降解的速率相對減緩；17 天之後 PLGA50:50 薄膜的 快速降解則可能是此薄膜開始行主體侵蝕而有質量的明顯減少。於是針對 薄膜對於水分的吸收做進一步探討。

圖4-10 為測量 17 天內各薄膜的含水率。含水率的計算是利用下列關係 式求得：

含水率（％）＝[（W_w－W_d）/W_d] ×100％

W_w：浸泡過 PBS 緩衝液後倒去緩衝液的薄膜濕重

W_d：將濕的薄膜置入乾燥器抽氣揮發至質量不再改變（乾燥三天）之 薄膜乾重。

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

0 100 200 300 400 500

時間（小時）

薄 膜 含 水 率︵

％︶

PLA PLGA75:25

PLGA50:50 PLGA50:50sigma

圖4-10. PLA、PLGA75:25、PLGA50:50、PLGA50:50(sigma)高分子薄膜 降解17 天的攝水率(%)。

浸泡17 天的實驗結果如圖 4-10 所示，由於實驗初期誤差較大而出現各 高分子薄膜不規則之實驗圖形，若我們以浸泡第17 天時的結果來看，PLA

薄膜的含水率為 52.5%，PLGA75:25 薄膜的含水率為 70.8%，PLGA50:50 薄膜的含水率為31.5%，而 PLGA50:50(sigma)薄膜之含水率僅 12.3%，顯示 在 17 天內的各高分子薄膜的吸水程度均有限，降解可能均僅發生於 PLA

及 PLGA 薄膜表面，因而並未有大量的降解發生，也因此薄膜質量的改變

並不明顯。再者，由於高分子量之高分子降解會先產生不溶性（Water insoluble）之較低分子量的碎片，經由 17 天的浸泡水解仍未達到高分子行 主體侵蝕的臨界分子量（Mw＜15000）（Rothen-Weinhold et al., 1998），所 以質量下降比例僅佔1.3%∼5.2% ，此結果與利用相近分子量進行實驗之參 考文獻（Kranz et al., 2000）相似，然而，PLA 是較為疏水性高分子，其較 兩種 PLGA 高分子的攝水率為高，推測其可能的原因，或許是因為 PLGA

高分子一開始的降解速率快於 PLA，卻因降解產生之寡聚體在高分子表面

形成再結晶，因而妨礙了水分吸收。

綜合上述結果，PLGA50:50 在 17 天後降解速率快速增加，而要使 PLA、

PLGA75:25 及 PLGA50:50(sigma)高分子達到主體侵蝕以造成質量明顯下 降，則必須延長實驗時間。

第四節 秋水仙素體外控制釋放

含有秋水仙素的高分子薄膜體外控制釋放實驗的方式是將含有的高分 子薄膜加入PBS 緩衝液（pH=7.4）2ml 依預定時間浸泡，之後倒出 PBS 溶 液並取 20μl 注入 HPLC 測量 Colchicine 的釋放量（利用秋水仙素迴歸分析 所得之面積對質量之校正曲線），再依其比例換算 2ml 之所有秋水仙素之質 量。圖 4-11 是利用 PLA、PLGA75:25、PLGA50:50 和 PLGA50:50(sigma) 四種高分子基材體外控制釋放之秋水仙素累積釋放率。高分子薄膜之秋水 仙素累積釋放率（%）是依下列公式計算：

累積釋放率（%）＝[（W_col＋W_β-LC）/W₀] ×100%

W_col：自高分子薄膜釋放之秋水仙素質量

W_β-LC：自高分子薄膜釋放之 β-LC 質量（雖無照光仍有極少數 β-LC 在 實驗中產生）

W₀：製備高分子薄膜添加之秋水仙素質量－製備成薄膜經乾燥後被甲 醇洗去之Col 質量

以下將含有秋水仙素之高分子薄膜簡稱，含有秋水仙素之PLA 高分子 薄 膜 稱 為 PLA/Col ， 含 有 秋 水 仙 素 之 PLGA50:50 高 分 子 薄 膜 稱 為 PLGA50:50/Col ， 含 有 秋 水 仙 素 之 PLGA50:50(sigma) 高 分 子 薄 膜 稱 為 PLGA50:50(sigma)/Col ， 含 有 秋 水 仙 素 之 PLGA75:25 高 分 子 薄 膜 稱 為 PLGA75:25/Col。

0 10 20 30 40 50 60

0 200 400 600

時間(小時) 累

積 釋 放 率

(

% )

PLA/col PLGA5050/col PLGAsigma/col PLGA7525/col

圖4-11.PLA/Col、PLGA50:50/Col、PLGA50:50(sigma)/Col與PLGA75:25/Col

薄膜進行28 天之 in vitro 控制釋放，秋水仙素累積釋放率(%)。

由圖4-11 的結果顯示，秋水仙素在 PLA/Col 薄膜的體外控制釋放累積 釋放率呈現三個階段：在PBS 溶液浸泡開始的 2 小時內就有大量的釋放，

是為 Burst effect，2 小時至 6 小時釋放速率較快，6 小時之後則為緩慢釋放。

經由 28 天的體外釋放，累積釋放率約達 55.52%，其中因為 Burst effect 的 釋放率為38.38%。相對於 PLA/Col 薄膜，三種 PLGA/Col 薄膜的 Burst effect 的釋放率較小，浸泡 2 小時的 PLGA50:50/Col 薄膜之釋放量為 3.46%，

PLGA50:50(sigma)/Col 薄膜為 2.23%，PLGA75:25/Col 薄膜為 4.32%，如圖 4-12，其中 PLGA75:25/Col 和 PLGA50:50/Col 薄膜的累積釋放線型呈現兩

個階段：實驗開始的12 小時內釋放速率較為快速，隨後的累積釋放率則呈

現緩慢增加，然而，PLGA50:50(sigma)/Col 薄膜在 12 小時後的釋放速率則

更顯得緩慢。經28 天的體外釋放，PLGA50:50/Col、PLGA50:50(sigma)/Col、

和PLGA75:25/Col 薄膜累積釋放率分別達 11.08%、8.12%以及 20.71% 。

0 5 10 15 20 25

0 100 200 300 400 500 600 700 800

時間(小時) 累

積 釋 放 率 (

% )

PLGA5050/col PLGAsigma/col PLGA7525/col

圖4-12.PLGA50:50/Col、PLGA50:50(sigma)/Col、PLGA75:25/Col 薄膜進行 28 天之in vitro 控制釋放，秋水仙素累積釋放率(%)。

為得知秋水仙素在不同薄膜的釋放速率，圖4-13 為不同時間測得各薄 膜釋放之秋水仙素質量除以時間所得之秋水仙素平均釋放速率。

1.E+00 1.E+01 1.E+02 1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06

0 100 200 300 400 500 600 700 800

時間(小時) 秋

水 仙 素 平 均 釋 放 速 率

PLA/col

PLGA50:50/col

PLGA(sigma)/co l

PLGA75:25/col

圖4-13.PLA/Col、PLGA50:50/Col、PLGA50:50(sigma)/Col、PLGA75:25/Col 薄膜進行28 天之 in vitro 控制釋放，秋水仙素平均釋放速率。

(ng/hr)

由圖4-13 的結果可知，實驗開始 2 小時內秋水仙素之平均釋放速率以 PLA/Col 薄膜最大，PLGA75:25/Col 次之。秋水仙素在各薄膜的平均釋放速 率均以實驗初期最為快速並隨時間遞減，其中 PLA/Col 薄膜的平均釋放速 率在5 天內快速減少，5 天之後的平均釋放速率則趨於穩定，穩定後之平均 釋放速率為四種薄膜中最少，而三種 PLGA/Col 薄膜的平均釋放速率在 5 天之後亦趨於穩定，其中 PLGA50:50/Col 和 PLGA75:25/Col 薄膜穩定後之 平均釋放速率相似且大於PLGA50:50(sigma)/Col 薄膜。在 21 天後，由圖的 結果發現，PLGA50:50/Col、PLGA50:50(sigma)/Col、PLGA75:25/Col 薄膜 的平均釋放速率有增加的趨勢。然而PL A/Col 薄膜和 PLGA50:50/Col 薄膜

的平均釋放速率線型相似，可能因同批樣品在相同時間利用 HPLC 檢測所

致，改善的方式可以在使用HPLC 偵測樣品前先做檢量以減少誤差。

藥物的釋放機制除了藥物自高分子微結構中的孔洞擴散釋放出來之 外，高分子的攝水量也就是水的滲入也是主要影響的因素之一，由於緩衝 液浸泡高分子薄膜會使高分子降解，致使薄膜表面因降解而形成更多孔 洞，水透過這些孔洞滲入高分子致使產生更多水進入高分子之通道，而加 速藥物擴散釋放速率（Wang et al., 2004）。圖 4-14 為四種高分子薄膜進行 17 天體外控制釋放的攝水率。實驗含秋水仙素薄膜攝水量的方法如同測量 高分子薄膜攝水率，每次將緩衝液倒出後加10ml 甲醇清洗薄膜及玻璃瓶隨 即倒棄，待甲醇於室溫下揮發至肉眼不可見（約十於分鐘）則秤量薄膜濕

重（薄膜濕重＝濕的薄膜含瓶重－空瓶重）。攝水率亦是利用下列關係式求 得：

攝水率（％）＝[（W_w－W_d）/W_d] ×100%，

W_w：薄膜濕重

W_d：由乾燥器抽氣揮發至質量不再改變（乾燥三天）之薄膜乾重（薄 膜乾重＝乾燥之薄膜含瓶重－空瓶重）。

0 50 100 150 200

0 150 300 450

時間(小時) 含

秋 水 仙 薄 膜 攝 水 率 (

% )

PLA/col PLGA75:25/col PLGA50:50/col PLGA50:50/col-sigma

圖4-14. PLA/Col、PLGA75:25/Col、PLGA50:50/Col、PLGA50:50(sigma)/Col 高分子薄膜進行17 天體外控制釋放的攝水率(%)。

由圖 4-14 結果所示，四種高分子薄膜的攝水率在進行體外控制釋放實 驗中所得結果呈現不規律性，四種薄膜的攝水率在實驗開始數小時內呈現

急速下降，但自72 小時之後，其攝水率有增加的趨勢，可能是因為隨著高

分子降解而使水滲入的量增加之故。經過17 天的浸泡，PLA/Col 薄膜的攝 水率為83.9%，PLGA75:25/Col 薄膜的攝水率為 72.3%，PLGA50:50/Col 薄 膜的攝水率為71.7%，PLGA50:50(sigma)/Col 薄膜的攝水率為 25.6%，結果

顯示 PLGA50:50(sigma)/Col 薄膜之攝水量是四者中最少。攝水率呈現不規 律性的原因可能是實驗操作倒入甲醇清洗薄膜時甲醇未完全揮發，殘留之

甲醇影響了秤重之結果，尤其PLA 薄膜在實驗中會自玻璃瓶脫落，使得仍

有殘留之水分位於薄膜和玻璃瓶底間不易乾燥，加上薄膜雙側受浸潤所以 含水比例較PLGA 多，實驗誤差較大。

比較 17 天的實驗時間，含有秋水仙素的高分子薄膜之攝水率均大於不 含秋水仙素的高分子薄膜，可能是秋水仙素本身為水溶性分子，在含有秋 水仙素的薄膜經過緩衝液浸泡後，因秋水仙素與水分子間之作用力而增加 了高分子內水分的吸收。

除了薄膜吸收水分可能影響藥物釋放的因素外，薄膜質量的減少也是 影響藥物釋放速率的重要因子。

圖4-15 為含秋水仙素高分子薄膜 28 天體外釋放質量減少平均速率。

-4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000

0 100 200 300 400 500 600 700 800

時間(小時) 質

量 減 少 平 均 速 率

PLA/Col

PLGA75:25 PLGA50:50

PLGA50:50(sigma)

圖4-15.PLA/Col、PLGA75:25/Col、PLGA50:50/Col 及 PLGA50:50(sigma)/Col

高分子薄膜進行28 天體外控制釋放的質量減少平均速率。

(μg/hr)