行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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山藥對甲硫胺酸誘發性同半胱胺酸血症※
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之抗氧化活性研究※
※ Study on the antioxidative activity of Dioscores ※
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in methionine-induced hyper homocysteinema.※
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計畫類別：□個別型計畫 □整合型計畫 計畫編號：NSC 89-2316-B-006-019
執行期間：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日 計畫主持人：張 素 瓊
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位： 國立成功大學生物學研究所
中 華 民 國 年 月 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
山藥對甲硫胺酸誘發性同半胱胺酸血症之抗氧化活性研究 Study on the antioxidative activity of
Dioscores
inmethionine-induced hyper homocysteinema.
計畫編號：NSC 89-2316-B-006-019
執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日 主持人：張素瓊 國立成功大學生物學研究所
計劃參與人員：李懿純 國立成功大學生物學研究所
一、中文摘要
近來許多研究顯示，血漿同半胱胺酸
（homocysteine, Hcy）稍微升高是造成心血 管疾病（cardiovasular disease, CVD）的獨 立危險因子。然而，HHcy 導致 CVD 的機 制未明，HHcy 促進血管內活性氧生成所產 生的氧化壓力可能為主要原因。故本研究 利用甲硫胺酸(methionine, Met)誘發大白 鼠 HHcy 後，餵以山藥（Dioscores）來探 討其對 HHcy 及氧化壓力之影響。餵以出 生六週的大白鼠（Sprague-Dawley）食用 Met（1 g/Kg BW/d）十週誘發 HHcy。將 HHcy 大白鼠隨機分為五組：Met 組、Met
＋ vitamin C 組 （ 200 mg vitamin C/Kg BW/d）及三個 Met＋山藥組（D1、D2 及 D3）。山藥劑量分別為 1、2.5 及 5 g/Kg BW/d。分別於食用山藥及 vitamin C 八週 與 十 二 週 時 抽 血 並 犧 牲 老 鼠 。 血 漿 以 7-Fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulfonic acid （SBD-F）衍生化後，利用高效能液 相層析儀（HPLC）分析血漿 Hcy 濃度。以 血小板凝集儀（aggregometer）偵測 thrombin 誘發性血小板凝集反應。利用 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)反應，以 malondialdehyde（MDA）表示脂質過氧化。
利用 luminal 當探針，以化學冷光偵測器
（chemiluminescent）分析肝臟 ROS 含量。
利用酵素動力學分析肝臟中抗氧化酵素。
肝 臟 glutathione （ GSH ） 和 Glutathion disulfide（GSSG）以 O-Phthalaldehyde 衍生 化後，利用螢光分光光度計（Fluorescence spectrophotometer）分析。
結果發現， Met fed 十週後，血漿 Hcy 濃度由 6.7±1.0 µM 顯著增加至 21.7±4.5 µM。食用三個劑量山藥八~十二週後，血
漿 Hcy 濃度顯著比未食山藥（Met）組低，
且與控制組相近。食用中及高劑量山藥十 二週後，血小板凝集反應顯著比未食山藥
（Met）組小。食用三個劑量山藥十二週 後，也使血漿 MDA 濃度及肝臟 ROS 含量 顯著比未食山藥（Met）組低，並與控制組 相似。當大白鼠食用中及高劑量山藥十二 週後，肝臟之 catalase 活性顯著比未食山藥
（Met）組高。然而，食用山藥對肝臟 GSH 及 GSSG 沒有顯著影響。
本實驗顯示，食用山藥可以恢復因 Met 所誘發的 HHcy。此外，HHcy 可藉由攝取 山藥而減少血小板凝集、脂質過氧化及氧 化壓力。本研究結論，山藥對高蛋白飲食
（高 Met 攝取），可能誘發的 HHcy 與氧 化壓力導致的相關疾病具有保護功能，值 得推廣山藥成為保健食品。
關鍵詞：同半胱胺酸、同半胱胺酸血症、甲 硫胺酸、山藥
Abstract
Recently, a moderately elevated plasma homocystein (Hcy) level has been identified as an independent risk factor for cardiovascular disease (CVD). However, the mechanism by which HHcy leads to CVD is not known. HHcy-induced oxidative stress due to the production of reactive oxygen species (ROS) may contribute to the possible mechanism. Therefore, the purpose of this study was to investigate the antioxidative effects of Dioscores in methionine (Met)-induced HHcy animals. HHcy was induced by oral feeding Met (1 g/Kg BW/d) for 10 wks in Sprague-Dawley rats at the age of 6 wks. HHcy rats were randomly divided into five groups: Met group without
Dioscorea feeding, Met＋vitamin C group supplemented with vitamin C 200 mg/Kg BW/d, and 3 Dioscores groups (D1, D2 and D3) supplemented with freeze-dried Dioscorea powder 1, 2.5 and 5 g/Kg BW/d, respectively. Animals were sacrificed after 8 or 12 wks of Dioscorea feeding. Plasma levels of Hcy were assayed based on HPLC of the fluorescent 7-Fluorobenzo-2-oxa-1, 3-diazole-4-sulfonic acid (SBD-F) derivative.
Platelet aggregation induced by thrombin (3.2 U/ml) was analyzed with an aggregometer. Plasma lipid peroxidation was measured as thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) expressed in malondialdehyde (MDA) equivalents. ROS generation was monitored with luminometer using luminal as the probe. Activities of antioxidative enzymes were measured by kinetics of enzymes using UV spectrophotometer. Hepatic concentrations of glutathione and glutathion disulfide were quantified by fluorescence spectrophotometer after derivatized with O-Phthalaldehyde.
The results of this study showed that plasma Hcy levels were significantly increased from 6.7±1.0 to 21.7±4.5 µM after 10 wks of Met feeding. Eight and 12 wks after Dioscorea feeding, plasma Hcy of D1, D2, and D3 were significantly lower than that of Met, and similar to the basal level prior to Met feeding. Twelve weeks after Dioscorea feeding, thrombin-induced platelet aggregation of D2 and D3 were significantly lower than that of Met group. Plasma MDA levels and hepatic ROS of D1, D2, and D3 were similar to that of Ctl group and significantly lower than that of Met group after 12 wks of Dioscorea feeding. The activities of hepatic catalase in D2 and D3 groups were significantly elevated compared to Met group at 12 wks. However, feeding Dioscorea 8 or 12 wks did not significantly change hepatic levels of GSH and GSSG.
Results of our study indicated that HHcy induced by Met could be reversed by Dioscorea feeding. In addition, Dioscorea feeding could alleviate platelet aggregation, lipid peroxidation, and oxidative stress in HHcy. The protective effects of Dioscores feeding in oxidative stress induced by high
protein (Met) intake suggested Dioscores as a valuable functional food.
Keywords: homocystein, hyperhomocysteinemia, methionine, Dioscores
二、緣由與目的
近 年 來研 究顯示，血漿同半胱胺酸 (homocysteine, Hcy)稍微升高是造成 CVD 的獨立危險因子（1）。Hcy 是甲硫胺酸 (methionine)去甲基化(demethylation)的一 種含硫氨基酸。人類血漿 Hcy 正常範圍為 5-15 ìmol/L（2），大於 15 ìmol/L 為同半 胱 胺 酸 血 症 ﹙ hyperhomocysteinemia, HHcy﹚。研究報告指出，冠狀動脈、腦血 管、周邊血管疾病病人的血漿 Hcy 濃度比 正常人高（3）。本研究室以國人為對象發 現，CVD 患者血漿 Hcy 濃度顯著高於正常 人（12.2±0.3 v.s. 8.5±0.4 ìmol/L），但只 比正常人高約 4 ìmol/L（4）。此外，20~30
﹪的冠狀動脈、周邊血管疾病病人的 Hcy 濃度高達 200~250 ìmol/L（5）。
HHcy 導致動脈硬化及血栓症的機制 未明，HHcy 誘發氧化壓力所造成的低密度 脂蛋白氧化及內皮細胞受損可能為主要原 因（3）。Harker 等人指出血漿高濃度 Hcy 會造成內皮細胞損傷（6），而損傷的原因 是 Hcy 會促進血管內活性氧產生，進而引 起脂質過氧化（7）。此外，過氧化現象亦 會促進血小板吸附（adhesion）能力及血小 板活性（8）進而造成血栓症（5）。
脂質過氧化是因為細胞膜或體內的脂 質受到自由基（free radical）的攻擊，進而 影響其功能（9）。然而，人體內有一套酵 素系統可消弭超氧自由基的毒性。超氧化 岐化酉每（superoxide dismutase, SOD）可以 把 超 氧 自 由 基 （.O2-） 岐 化 成 過 氧 化 氫
（H2O2），而 H2O2會再被過氧化氫分解酉每 或麩胱甘月太過氧化酉每（Glutathione peroxidase, GPx）分解成水與氧氣，若 H2O2沒被代謝 掉則會形成更活躍的氫氧自由基（OH-.） 造成更大的傷害（10）。
研究報告指出，山藥可能增加抗氧化 酵素的活性，例如：SOD、GPx（11），減 少脂質過氧化反應（11,12），並可降低血 清三酸甘油酯（Triglycerides）及增加高密 度脂蛋白（HDL）（12）。山藥富含多種 必需胺基酸、蛋白質及澱粉，另具粘液質、
尿囊素、膽鹼、纖維素、脂肪、維生素 A、
B1、B2、C、及鈣、磷、鐵、銅、鋅與碘等 礦物質（13,14），可提供人體多種必需的 營養。其中維生素 A 與 C 是天然抗氧化 劑。因此，山藥可能具有抗氧化活性，降 低人體氧化壓力保健功能。
根據國民營養現況（國民營養狀況變 遷調查，NAHSIT，1993-1996）調查顯示，
目前國人蛋白質攝取量偏高（15），而動 物性蛋白質中 Met 含量較高。加上許多研 究發現，惡性腫瘤、腦血管疾病、心臟疾 病、糖尿病與腎炎等的發生與自由基密切 相關（12,16,17,18）。因此，本研究以本研 究室建立的 Met 誘發性 HHcy（19.4±3.8 v.s.
3.6±0.8 ìmol/L）動物模式（19），探討山 藥對 HHcy 的抗氧化活性。本研究成果將 有助於確立山藥對目前高蛋白飲食情況 下，可能誘發氧化壓力導致相關疾病的保 健功能，並有助於推廣省產山藥成為保健 食品之重要產業。
三、結果
Met fed 十週後，血漿 Hcy 濃度上升 約為控制組的三倍。餵食三個山藥劑量 八~十二週後，血漿 Hcy 濃度皆顯著比 Met 組降低約 44~54 %。
食用山藥八週後，大白鼠 thrombin 誘發性血小板凝集反應無顯著影響；食 用中及高劑量山藥十二週後，thrombin 誘發性血小板凝集反應顯著比 Met 組小 19~25 %。
食用高劑量山藥八週後，血漿 MDA 濃度顯著比 Met 組低 8 %；食用三個山 藥劑量十二週後，血漿 MDA 濃度皆顯 著比 Met 組降低約 50~54 %。
食用中及高劑量山藥八週後，肝臟 ROS 含量有減少的趨勢，但無統計差 異；食用三個山藥劑量十二週後，肝臟 之 ROS 含量皆顯著比 Met 組降低約 38~53 %。
食用中劑量山藥八週後，肝臟 SOD 活性顯著比 Met 組高；食用三個山藥劑 量十二週後，肝臟之 SOD 活性皆顯著比 Clt 組增加約 44~61 %，但與 Met 組無顯 著差異。
食用低及高劑量山藥八週後，肝臟
catalase 活性顯著比 Met 組高 46~56 %；
食用中及高劑量山藥十二週後，肝臟之 catalase 活性顯著比 Met 組高 16 %。
食用山藥八週後，肝臟 GPx 活性無 顯著差異；食用低及中劑量山藥十二週 後，肝臟 GPx 活性顯著比 Clt 組高 65~73
%，但與 Met 組無顯著差異。
食用山藥八週後，肝臟 GR 活性無 顯著差異；食用山藥十二週後，肝臟 GR 活性隨山藥劑量增加而有增加的趨勢，
且顯著比 Clt 組高，但與 Met 組無顯著 差異。
食用山藥八或十二週後，肝臟 GSH 及 GSSG 濃度無顯著差異。
四、討論
過量的 Met 在體內代謝過程可能造成 中間產物 Hcy 累積。許多研究指出，高濃 度的 Hcy 會自動氧化成 Hcy thiolactone，刺 激 ROS 產生，增加 MDA 濃度（5,6,20）並 影響血液凝集系統造成血栓（21,22,23）。
本實驗發現，過量攝取 Met 確實會使血漿 Hcy 濃度增加三倍，經過餵食山藥後，血 漿 Hcy 濃度、MDA 濃度、ROS 生成量及 血小板凝集有下降情況，因此，山藥可能 藉由降低 MDA 濃度及 ROS 生成，抑制血 小板凝集，減少因 Hcy 所造成的脂質過氧 化及自由基產生。
體內實驗顯示，HHcy 會 upregulation，
使抗氧化能力增加（24）。因此，過量攝 取 Met 會使 SOD、GPx 及 GR 活性增加，
來適應體內的氧化壓力。本研究發現，食 用山藥也可增加抗氧化酵素 catalase 幫助 自由基清除。
Welch 等人（25）指出，Hcy 會降低血 管 細 胞 硫 醇 類 的 氧 化 還 原 狀 態 （ 以 GSH/GSSG 比率來表示），本實驗發現，
Met 組的 GSH/GSSG 比率很低，表示 Met 組的氧化還原狀態最差，而食用中（Met
＋D2）劑量山藥十二週可以提昇氧化還原 狀態，維持體內氧化還原的平衡。
本研究推論，山藥的上述生理功能可 減少 HHcy 誘發氧化壓力。此研究成果將 有助於確立山藥對目前高蛋白飲食情況 下，可能誘發氧化壓力導致相關疾病的保 健功能，並有助於推廣省產山藥成為保健
食品之重要產業。
五、計畫成果自評
部份研究成果將發表於下列國際相關學術 會議：
1. Homocysteine Metabolism, 3rd International Conference. July. 1-5.
2001. Sorrento, Italy.
2. International Symposium on Functional Foods. October. 17-19.
2001. Paris, France.
六、參考文獻
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