行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
石斑魚致病原之原發性免疫反應的功能性基因體研究
計畫類別： 整合型計畫
計畫編號： NSC92-2317-B-006-009-
執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日 執行單位： 國立成功大學生物科技研究所
計畫主持人： 洪健睿
報告類型： 精簡報告
報告附件： 出席國際會議研究心得報告及發表論文
處理方式： 本計畫涉及專利或其他智慧財產權，1 年後可公開查詢
中 華 民 國 93 年 12 月 10 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 ▓
成果報告□期中進度報告
（計畫名稱）
石斑魚優質種苗之功能性基因研究—石斑魚致病原之原發性
免疫反應的功能性基因體研究
計畫類別： ▓ 個別型計畫 □ 整合型計畫
計畫編號：NSC 92－2317－B006 －009
執行期間： 92 年 08 月 01 日至 93 年 07 月 31 日
計畫主持人：洪 健 睿
協同主持人：吳 金 洌
計畫參與人員： 陳 詩 蘋
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)： ▓ 精簡報告 □完
整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、列管計畫 及下列情形者外，得立即公開查詢
□涉及專利或其他智慧財產權，▓一年□二年後可公開查詢
執行單位：國立成功大學 生物科技研究所
中 華 民 國 93 年 10 月 30 日
一、中文摘要
關鍵詞: 致病原, 神經壞死病毒, 原發性之免疫反應, 功能性基因體學, 抗菌 基因
臺灣四面環海，漁業一直是重要產業。然而，水產養殖產業之魚病的 防治又是一個重要課題。尤其，是在高經濟魚種的石斑魚身上，尤顯重要。
石斑魚主要之致病原包括有病毒性與細菌性之感染居多。尤其，在白身稚 魚階段受感染後，其死亡率高、損失尤其嚴重。
免疫系統無論是從高等脊椎動物之生物的人類，甚至到低等脊椎動物之魚 類皆俱備之。然而，免疫系統裡之原發性之免疫反應(Innate immune
response)，在對抗外來之病原時，其中包括有病毒性與細菌性之感染時，在 魚類尤顯重要。雖然已知石斑魚白身階段前，已有與免疫相關細胞出現，但此 時為何會受致病原感染後，為何死亡率特高，顯然與免疫防衛能力之高低有關。
今年度分別利用格蘭氏陽性(Streptococcus iniaei)及陰性菌(Vibrio alginolyticus)去感染白身階段(約四十天左右)之點帶石斑(E. suillus)稚 魚。於不同時間點如 12、24、48 與 72 小時收取樣本及進行抗菌與抗病毒之分 析。我們發現不管是格蘭氏陽性及陰性菌在 48 與 72 小時時都能誘發出抗菌 (Streptococcus iniaei 和 Vibrio alginolyticus)與抗病毒(NNV)之物質其分 子量分別為 16 及 13 kDa。且發現此時之原發性之免疫反應似乎相當強烈，相 當值得往下探討。目前我們正針對小分子之蛋白進行分離與可能之抗菌蛋白 (antimicrobial genes)氨基酸序列分析。
二、英文摘要
Key word: Pathogens, Nodavirus, Innate immune response, Functional genomics and proteomics, Antimicrobial peptides
The immune system is belong to the high conserved evolutionary system from human to the lower vertebrate fish also could found it. Although, the immune defense system is very importantly during foreign pathogen attacked, but immediately response system- innate immune response are quickly act for protecting the host then back to normal.
The new currently technique, functional genomics and proteomics for known the functional genes changed pattern during some factor changes in homeostasis such as the physiological, nutritional, pharmacological or pathogens
infection. In this year, we are interesting to clone the target gene antimicrobial peptide gene for defense the pathogens infection in larve grouper. We used the 2-dimension gel electrophoresis to analyze the Streptococcus iniaei and Vibrio alginolyticus -infected sample or separate the protein by gel filtration column.
Then, we found in some fractions that contain some anti-pathogen molecules, which could against the Vibrio alginolyticus, Streptococcus iniaei and
betanodavirus. The molecular weight of anti-pathogens molecules are about 13 and 16 kDa, respectively.
三、報告內容
石斑魚之養殖分為種苗期及育成期，二期各有不同之感染病原。石斑魚苗(從 魚卵孵化到體色花紋出現之石斑魚稚魚)之育成率低，因此，魚苗發育之正常與 否，影響仔魚活存率甚鉅。種苗品質的好壞影響後續養殖能否成功至鉅，因此開 發優良品質種苗的生產模式為建立高效率永續水產養殖業的重要課題之一 (1)。
石斑魚病的防治一直是石斑魚養殖產業發展上的一個瓶頸，發病的原 因從病毒、細菌性病原到原生動物、乃至於寄生蟲皆有記錄。在種苗階段 目前面臨的最大威脅主要來自病毒性疾病—如 NNV（Nerves Necrosis Virus）神經壞死病毒。在育成階段則以虹彩病毒（Iridovirus），細菌 性疾病為主，如弧菌、巴斯德桿菌、鏈球菌等。NNV 的疾病往往感染早，
流行速度快、魚苗死亡率高。由於目前石斑魚種苗死亡率達 99.7%以上，
種苗後階段石斑魚育成率約在 50%左右，加上這些疾病發生目前並無積極 有效的防治策略，常造成魚群集體暴斃情事，使得平均養殖成本提高，漁 民養殖面臨經營之瓶頸 (2-4)。
免疫系統無論是從高等脊椎動物之生物的人類，甚至到低等脊椎動物之魚 類皆俱備之。然而，免疫系統裡之原發性之免疫反應(Innate immune
response)，在對抗外來之病原時，其中包括有病毒性與細菌性之感染時，在 魚類尤顯重要。雖然已知石斑魚白身階段前，已有與免疫相關細胞出現，但此 時為何會受致病原感染後，為何死亡率特高，顯然與免疫防衛能力之高低有關 (5-14)。
今年主要是要尋找抗菌蛋白及其基因之選殖。我們分別利用格蘭氏陽性 (Streptococcus iniaei)及陰性菌(Vibrio alginolyticus)去感染白身階段 (約四十天左右)之點帶石斑(E. suillus)稚魚。於不同時間點如 12、24、48 與 72 小時收取樣本及進行抗菌與抗病毒之分析。我們發現不管是格蘭氏陽性
及陰性菌在 48 與 72 小時時都能誘發出抗菌與抗病毒之物質，其分子量分別為 16 及 13 kDa。且發現此時之原發性之免疫反應似乎相當強烈，相當值得往下 探討。目前正針對這些小分子之蛋白進行氨基酸序列分析。
四、參考文獻
1. 海水養殖魚類:疾病防治專輯，屏東縣家畜疾病防治所編印 (中華民國八 十四年六月)。
2. Le Breton, A., Grisez, L., Sweetman, J. & Ollevier, F. (1997). Viral nervous necrosis (VNN) associated with mass mortalities in cage-reared sea bass, Dicentrarchus labrax. Journal of Fish Diseases 20, 145-151.
3. Mori, K., Nakai, T., Muroga, K., Arimoto, M., Mushiake, K. & Furusawa, I.
(1992). Properties of a new virus belonging to Nodaviridae found in larval striped jack (Pseudocaranx dentex) with nervous necrosis. Virology 187, 368-371.
4. Yoshikoshi, K. & Inoue, K (1990). Viral nervous necrosis in hatchery-reared larvae and juveniles of Japanese parrotfish, Oplegnathus fasciatus. Journal of Fish Diseases 13, 69-77.
5. Ellis, A. E. 2001. Innate host defense mechanisms of fish against viruses and bacteria. Dev. Com. Immuno. 25, 827-839.
6. Janeway, C. A. 2002. Innate immune recognition. Annu.Rev. Immunol. 20, 197-216.
7. Bayne, C. & Gerwick, L. 2001. The acute phase and innate immunity of fish.
Dev. Com. Immuno. 25, 725-743
8. Nygarrd, R., Husgard, S., Sommer, A. I., Leong, J. C and Robertsen, B. 2000.
Induction of Mx protein by interferon and double-stranded RNA in salmonid cells. Fish Shellfish Immunol. 10, 435-450.
9. Willians B. R. 1999. PKR: a sentinel kinase for cellular stress. Oncogene 18, 6112-20.
10. Robersten, B. 1999. Modulation of the non-specific defence of fish by structurally conserved microbial polymers. Fish Shellfish Immunol. 9, 269-290.
11. Smith, V. J., Fernandes, J. M. O., Jones, S. J., Kemp, G. D. and Tatner, M. F.
1989. Antibacterial proteins in rainbow trout. Oncorhynchus mykiss. Fish Shellfish Immunol. 10, 243-60.
12. Wang, X. H. and Leung, K. Y. 2000. Biochemical characterization of different types of adherence of Vibrio species to fish epithelial cells.
Microbiology 146, 989-98.
13. Bayne, C. J., Gerwick, L., Kazuhiro, F., Nakao, M. and Yano, T. 2001.
Immune relevant (including acute phase) genes identified in the livers of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, by means of suppression subtractive hybridization. Dev. Comp. Immunol. 25, 205-17.
14. Gallo, R. L. and Huttner, K. M. 1998. Antimicrobial peptides: an emerging concept in cutaneous biology. J. Invest. Dermatol. 111, 739-743.
五、計畫成果自評
目前正針對可能之標的蛋白，其分子量分別為 16 及 13 kDa 進行氨基酸序 列分析。可能可發現新之抗菌蛋白基因。
