碳點螢光探針用於檢測尿液中的四環素 類抗生素和細胞成像

國立臺東大學應用科學系研究所 碩士論文

指導教授：邱泰嘉 博士 胡焯淳 博士

碳點螢光探針用於檢測尿液中的四環素 類抗生素和細胞成像

研究生：陳哲賢 撰

中華民國一一〇年七月

國立臺東大學應用科學系研究所 碩士論文

Department of Applied Science National Taitung University Master Thesis

碳點螢光探針用於檢測尿液中的四環素 類抗生素和細胞成像

Carbon dot-based fluorescent probes apply to detection of tetracyclines in

urine and cell imaging

研究生：陳哲賢 撰 指導教授：邱泰嘉 博士

胡焯淳 博士

中華民國一一〇年七月

誌謝

在實驗室的兩年研究生涯，是我在臺東大學的六年裡最豐富的兩年，謝謝各 位老師、同學、學長姐及學弟妹，在這段期間中或多或少的幫助過我。特別感謝 邱泰嘉老師及 胡焯淳老師，在這兩年作為我的指導老師給我建議為我解惑，還 培養我們團隊合作及管理團隊的能力。同時，也感謝 黃志清老師願意在這個疫 情爆發的時期，雖然無法親自到場，但還是願意擔任我們的口試委員，非常感謝 黃老師給予論文及研究上的建議，使得我們的論文更加完整。

在研究所的兩年時光，我的同學 羅廣民非常重要，在我剛進實驗室的時候，

教我許多的基本實驗方法及技巧，讓我更快的進入狀況。謝謝農檢中心的兩位學 姊，與我們分享一些實驗上的建議及經驗，讓我們少走不少彎路。謝謝系辦阿姨，

提醒我們一些重要得時程及口試所需的相關資料。

學弟妹們，在實驗的步驟及手法上要小心注意，任何不一樣的做法都可能導 致實驗結果的改變，因此做好實驗紀錄非常重要，務必注意。一開始進入實驗室，

或許會不適應報告或實驗，但是熟悉之後，就會發現這些對於學習及研究是很有 幫助的。

最後，感謝我的家人親人，支持我念完研究所，讓我可以專注在學業上。

2021 孟秋 陳哲賢 於 臺東大學應用科學系 筆

碳點螢光探針用於檢測尿液中的四環素 類抗生素和細胞成像

作者：陳哲賢

國立臺東大學應用科學系

摘要

水楊酸(Salicylic acid, SA)和鄰苯二胺(o-Phenylenediamine, oPD)透過一鍋溶 劑熱法，合成了量子產率（quantum yield, QY）為 30.88％的亮藍色螢光碳點

（carbon dots, CDs）。碳點在使用最佳激發 295 nm 時，可以獲得最大放光波長為 410 nm。水溶性的 CDs 的粒徑分布在 1.4 至 3.0 nm 之間的範圍內，其平均粒徑

為2.23 nm。CDs 進一步用作為螢光感測器，以高選擇性及靈敏度檢測四環素類

抗 生 素 （tetracyclines, TCs ）， 包 含 了 四 環 素 （ tetracycline, TC ）、 土 黴 素

（oxytetracycline, OTC）和金黴素（chlortetracycline, CTC）。TC、OTC 和 CTC 的 偵測極限分別為 4.02 μM，1.12 μM 和 0.69 μM。另外，碳點可應用於檢測自來 水，飲用水，人工尿液和人類尿液中的四環素類抗生素濃度，TC、OTC 與 CTC 的回收率分別為87.6–107.2%，90.3–104.9%，90.1–105.8%，相對標準差(n=3)

皆小於 6.9%。此碳點亦成功用於 Huh-7 細胞的成像，這證明碳點具有低細胞毒

性和良好的生物相容性。碳點有效地分佈於細胞質內，並保證了在細胞成像和生 物及醫學研究中的潛在應用。同樣，我們成功地在酵母菌中進行成像，也驗證了 碳點可以進入真核生物中進行成像的潛力。

關鍵字 : 鄰苯二胺, 碳點, 細胞成像, 水楊酸, 溶劑熱法, 四環素類抗生素

ii

Carbon dot-based fluorescent probes apply to detection of tetracyclines in urine and cell imaging

Che-Hsien Chen

Abstract

Bright-blue fluorescent carbon dots (CDs) with a quantum yield (QY) of 30.88%

were synthesized using salicylic acid and o-phenylenediamine through one-pot solvothermal method. The CDs showed a fluorescence with the wavelength varied from 390 to 420 nm and the maximum emission wavelength at 410 nm. The particle size of the water-soluble CDs is in the range between 1.4 and 3.0 nm and the average diameter is calculated to be 2.23 nm. The CDs were further employed as a fluorescent sensor for the detection of tetracyclines (TCs), such as tetracycline (TC), oxytetracycline (OTC) and chlortetracycline (CTC), with high selectivity and sensitivity, tetracycline (TC), oxytetracycline (OTC) and chlortetracycline (CTC) included. The detection limits of TC, OTC and CTC were 4.02 μM, 1.12 μM and 0.69 μM, respectively. In addition, the carbon dots have been used to determine TCs in tap water, drinking water, artificial urine and human urine. The confocal fluorescent microscopic images of Huh-7 cells were carried out smoothly, which showing that CDs have exceptional cell membrane permeability and biocompatibility. The ultra-small carbon dots were effectively distributed in the cytoplasm of the cells, guaranteeing the potential applications in cell imaging and biomedical studies. At the same time, we successfully performed fluorescence imaging in yeast, which also verified the potential of CDs to enter eukaryotes for imaging.

Keywords ： o-Phenylenediamine, Carbon dots, Cell imaging, Salicylic acid, Solvothermal, Tetracyclines

目錄

摘要... i

Abstract ... ii

目錄... iii

圖目錄... v

表目錄... vii

第一章 緒論... 1

壹 碳點... 1

貳 四環素類抗生素 ... 1

參 碳點的合成 ... 2

一 溶劑熱法... 2

二 氮摻雜碳點 ... 4

肆 材料選擇... 7

伍 碳點螢光感測四環素類抗生素 ... 9

陸 碳點螢光的細胞成像 ... 11

柒 研究目的... 12

第二章 實驗方法及藥品 ... 13

壹 藥品... 13

貳 儀器... 13

參 碳點合成... 14

肆 碳點檢測四環素類抗生素 ... 14

伍 檢測真實樣品中的四環素類抗生素 ... 15

陸 細胞成像... 15

柒 酵母菌成像 ... 16

第三章 結果與討論 ... 17

iv

壹 碳點合成... 17

貳 碳點表徵及光學性質 ... 19

參 碳點穩定性 ... 23

肆 檢測四環素類抗生素的選擇性及靈敏度 ... 23

伍 檢測四環素類抗生素的機制 ... 28

陸 真實樣品中感測四環素類抗生素 ... 37

柒 Huh-7 細胞成像 ... 40

捌 酵母菌螢光成像 ... 43

第四章 結論... 45

第五章 參考文獻... 46

圖目錄

Figure 1.(a) TEM image of CDs. Inset: size distribution histograms of CDs. (b) FTIR spectra of oPD, SA and CDs. ... 20 Figure 2.(a) UV–vis absorption spectrum excitation and emission spectrum of CDs (inset, photographs of the CDs under daylight and UV light (excited by 254 nm)). (b)Fluorescence of carbon dots at different excitation wavelengths.

(λex = 290, 350, 400, 450, 500 nm.). ... 21 Figure 3. (a) XPS survey, (b) C1s spectra, (c) N1s spectra and, (d) O1s spectra of CDs.

... 22 Figure 4. (a)Stability of the CDs in the existence of different concentrations of NaCl.(b)Fluorescence intensity of the CDs in different pH solutions (10 mM PBS).(c)Effect of the UV irradiation time on the fluorescence intensities of the CDs.(d)Fluorescence responses of CDs in different solvents(50% v/v).

... 24 Figure 5. Selectivity of the CDs for tetracyclines (100 μM) over other antibiotics. .... 25 Figure 6. (a) The fluorescence spectra of CDs in the presence of different concentration of tetracycline. (b) Plot of the relative fluorescence intensity I/I0 at 410 nm versus the concentration of TC. Inset: the linear relationship of I/I0 and TC concentration (5–100 μM). (c) The fluorescence spectra of CDs in the presence of different concentration of oxytetracycline. (d) Plot of the relative fluorescence intensity I/I0 at 410 nm versus the concentration of OTC. Inset:

the linear relationship of I/I0 and OTC concentration (5–400 μM). (e) The fluorescence spectra of CDs in the presence of different concentration of chlortetracycline. (f) Plot of the relative fluorescence intensity I/I0 at 410 nm versus the concentration of CTC. Inset: the linear relationship of I/I0 and

vi

CTC concentration (5–400 μM). ... 27 Figure 7. The mechanisms of tetracycline (TC) detection by CDs The maximum excitation (blue line), emission (red line) fluorescence spectra of CDs and UV spectrum of (a) TC (black line), (b) OTC, (c) CTC. ... 30 Figure 8. UV–vis absorption spectra of CDs, TC, CDs+TC, and the summed UV–vis absorption spectrum of CDs and TC, respectively. ... 31 Figure 9. UV-vis absorption spectra of CDs, in the presence of 100,200 and 300 μM (a) TC, (b) OTC and (c) CTC. ... 32 Figure 10. FTIR spectra of CDs, and CDs with TC, OTC and CTC. ... 33 Figure 11. TEM images of CDs with (a)TC, (b)OTC, (c)CTC... 34 Figure 12. Suppressed efficiency (E, %) of observed (black line, Eobsd) and corrected (red line, Ecor) fluorescence intensity, λex = 295 nm, λem =410 nm. ... 35 Figure 13 Cytotoxicity test of CDs on Huh-7 cells viability. The values represent percentage cell viability. ... 41 Figure 14. (a-c) Images of Huh-7 cells without CDs. (d,g) Bright field images of Huh-

7 cells incubated with 0.18 μg/mL CDs. (e,h) Black field images of Huh-7 cells incubated with 0.18 μg /mL CDs. (f,i) The overley of (d,e) and (g,h).

... 42 Figure 15. fluorescence microscopy images of yeast incubated (a),(b)with and (c),(d)without CDs. ... 44

表目錄

Table 1. QY of CDs under different synthesis conditions. ... 18

Table 2. Parameters used to calculate IFE of TC on the fluorescence of CDs. ... 36

Table 3. Determination of tetracyclines in tap water and drinking water. ... 38

Table 4. Determination of tetracyclines in artificial urine and urine. ... 39

1

第一章 緒論 壹 碳點

螢光碳點(carbon dots，CDs)是一種，零維的碳奈米材料，是碳材料家族中的 後起之星^1-2。通常粒徑小於 10 nm 的碳點，因為其出色的性能而受到廣泛關注，

例如：低毒性，優秀的生物相容性，穩定的光致放光和良好的溶解度^3-5。碳點的

獨特光學性質、豐富的表面官能基、良好的生物相容性及穩定性，使它們從螢光 探針中脫穎而出，並激勵科學家們，嘗試將它們應用在許多令人興奮的領域中，

包含螢光墨水、感測器、生物成像、生物感測及光催化等^6-11。

貳 四環素類抗生素

在本研究中，檢測了三種第一期的四環素類抗生素，依發現的順序分別是 金黴素、土黴素及四環素。在 1956 年，法國微生物學家 André Michel Lwoff 證 明了，四環素會穿過胎盤盡速到胎兒體內，影響到其骨骼發育。而 1962 年，澳 大利亞醫生 I.S. Wallman 發表一篇文章，證明四環素會進入到發育中的牙齒 內，與鈣質結合形成黑色素沉澱，導致牙齒永久性的染色。因此，孕婦及 8 歲 以下兒童應避免服用四環素。^12-13

參 碳點的合成

一 溶劑熱法

碳點的合成方法有很多種，比較常見的有以下五種方法，水熱/溶劑熱法、微 波輔助合成、超聲波輔助合成、電化學合成及前驅物裂解等方法。我選擇使用乙 醇做為溶劑，進行溶劑熱法合成碳點。溶劑熱法具有幾項優點，便宜、環保、無 毒及有利於合成高量子產率的碳點。

2019 年，Wei Li (李偉) 及 Shouxin Liu (劉守新) 教授團隊使用葉酸及氯化 銅，以溶劑熱法來製備銅摻雜碳點。該碳點的平均粒徑為 3.57 nm，在 340 nm 激 發時，會在 410 及 470 nm 放出藍光。本篇的銅摻雜碳點對於抗壞血酸有選擇性，

在加入抗壞血酸後螢光淬滅，為靜態淬滅；線性範圍在 0.02–40 μM，R²是 0.992，

偵測極限為 17.8 nM。實際進行細胞成像的實驗，可以看到碳點進入細胞質中發 出藍色的螢光，但不能進入細胞核¹⁴。

2019 年，Liang Wang 及 Pulickel Ajayan 教授團隊使用鄰苯二酚，以乙醇為 溶劑，進行溶劑熱法來製備碳點。該碳點的平均粒徑為 6.87 nm，在 360 nm 激發 時，會在 410 nm 放出藍光。將碳點與 PVA 混和，在 80°C 加熱 6 小時得到複合 材料。在 365nm 激發下，有 392nm 螢光及 470nm 磷光。碳點與複合材料配合列 印，可以進行高科技防偽應用。實際進行細胞成像的實驗，可以看到碳點進入細

胞質中發出藍色的螢光，但不能進入細胞核¹¹。

2020 年，Zhaohui Li (李朝輝)及 Hongmin Meng 教授團隊使用對苯二胺溶在

乙醇中，以溶劑熱法來製備紅色螢光碳點。該碳點的平均粒徑為 5 nm，量子產

率為47.87 %，在不同極性的溶劑中，會放出 525 nm 至 612 nm 的放光。本篇的

紅光碳點，對於溶劑的極性有反應，以1,4-二噁烷與水混和的溶劑測試，當極性

越高時，螢光強度越低，R²是0.9722。紅光碳點成功在細胞中進行染色，並觀察

極性變化，且透過癌細胞與一般細胞的極性不同來區分兩者¹⁵。

2020 年，Shu Pang 教授團隊使用沒食子酸及鄰苯二胺，以溶劑熱法來製備

3

氮摻雜碳點。該碳點的平均粒徑為3.21 nm，在 360 nm 激發時，會在 470 及 570 nm 放出藍色及黃色螢光。該氮摻雜碳點對於 Fe³⁺有選擇性，在加入Fe³⁺後螢光 淬滅，為動態淬滅；線性範圍在0–50 μM，R²是0.998，偵測極限為 0.8 μM。碳

點在加入Fe³⁺螢光淬滅後，可以用焦磷酸來螢光回升，再用來檢測焦磷酸酶的活

性，線性範圍在0–25 μM，R²是0.996，偵測極限為 0.01 μM。實際檢測添加於 湖水及泉水中的Fe³⁺ ；檢測尿液中的焦磷酸酶的活性¹⁶。

2019 年，Cuiling Ren (任翠領)副教授團隊，利用 2,5-二胺基苯磺酸，以溶劑 熱法合成碳點，同時檢測細胞或體液中的次氯酸鹽與抗壞血酸的螢光/比色法。

在螢光方面，奈米感測器對次氯酸鹽具有很高的選擇性，線性範圍為 0.1–100 μM，

R² = 0.993，LOD = 83 nM；可透過對抗壞血酸的選擇性回升螢光，線性 0.05-20 μM，R² = 0.984。在比色法，UV-vis 光譜可以檢測出次氯酸鹽和抗壞血酸，範圍 分別為 5–200 μM 和 1–30 μM，R² = 0.998 及 R² = 0.999，次氯酸鹽的 LOD = 2.2 μM。另外，HeLa 細胞與 RAW264.7 cells 中次氯酸鹽和抗壞血酸的濃度可以 透過 RD-CD 在螢光和比色法模式下進行檢測。成功在使用螢光法與比色法，在 牛血清及大鼠腦微透析液中檢測ClO^-及抗壞血酸¹⁷。

2020 年，Jinming Zhang、Shu Wang 與 Jun Zhang 授團隊，分別將鄰間對-苯

二胺溶在DMF 中，以溶劑熱法分別合成黃藍紅色螢光碳點。對苯二胺碳點放光

波長在616 nm，水溶液在日光燈下為橘黃色。對苯二胺碳點對於 GSH 有選擇性，

加入GSH 之後碳點水溶液由黃轉藍，而紅色螢光則會淬滅。比色法的線性範圍

在12.5-800 μM；螢光法的線性範圍在 0-100 μM，LOD 為 0.7 μM。成功在尿液 與血清中檢測添加之GSH。將碳點製作成試紙及水凝膠，並都能夠檢測 GSH¹⁸。

二 氮摻雜碳點

根據半導體理論，摻雜異質原子是調整半導體能隙的有效方法。因此，可以 透過摻雜不同元素改變內部電子結構來改變碳點的固有特性，從而增加螢光量子

產率¹⁹。因此，目前大多碳點都會摻雜一種以上的異原子，常見的有氮、磷及硫

等，而最多的則是氮元素。

2019 年，Zhanhu Guo 教授團隊，使用稻米殘渣與甘胺酸，以水熱法合成氮 摻雜碳點，量子產率為23.48%。碳點平均粒徑為 2.70 nm ，在 360 nm 激發時，

會在440 nm 有最強放光。碳點對於 Fe³⁺與TC、CTC、OTC 有良好的選擇性，

測Fe³⁺時，線性範圍在3.32–32.26 µM，R²為0.972，LOD 為 0.746µM；測 TC 時，

線性範圍在3.32-32.26 μM，R²為0.983，LOD 為 0.2367 μM。碳點具有良好的生 物相容性，可以進行細胞成像，也有進行實際水樣測試，回收率為96.65％–104.28

％²⁰。

2014 年，Huan-Tsung Chang(張煥宗) 教授團隊使用鄰苯二胺，以水熱法來製 備碳點，並檢測細胞中的Cu²⁺。該碳點的平均粒徑為4 nm，在 420 nm 激發時，

會在567 nm 放光。由於 Cu²⁺與碳點表面的胺基形成配位，因此增強螢光；原本 量子產率為2%，在加入 Cu²⁺後增加至21.2%。線性範圍在 2–80 nM，R²是0.99，

LOD 為 1.8 nM。在實際檢測細胞中的 Cu²⁺，可以看到明亮的橙色放光²¹。 2018 年，Chuan Dong(董川) 教授團隊，使用對苯二胺，以水熱法合成氮摻 雜碳點，量子產率為11.5%。碳點平均粒徑為 3.65 nm ，在 366 nm 激發時，會 在590 nm 最強放光。該碳點對於 pH 有不錯的靈敏度，pH=7 時，螢光強度最高，

強酸及強鹼環境中，螢光強度越低。碳點對細胞毒性低，成功地透過細胞成像檢 測細胞的pH²²。

2018 年， Narayan Chandra Das 教授團隊，使用 κ -角叉菜膠與尿素，以水熱 法合成氮硫摻雜碳點，量子產率為69.27%。碳點平均粒徑為 3.5 nm ，在 360 nm

激發時，會在432 nm 最強放光。該碳點對於丙酮有不錯的靈敏度，線性範圍 0–

0.5 M，R² = 0.995，LOD 為 7.2 × 10⁻⁷ M。碳點成功的檢測了添加於人類血液與尿

5

液中的丙酮，檢測血液的線性範圍0–0.05 M，R² = 0.994；檢測尿液的線性範圍 0–0.01 M，R² = 0.999²³。

2019 年，Yuhui Zheng 教授，使用檸檬酸、間苯二胺與磷酸，以水熱法合成 氮磷摻雜碳點，量子產率為13%。碳點平均粒徑為 4.75 nm ，在 393 nm 激發時，

會在 509 nm 放光。該碳點對於亞硝酸具有選擇性，線性範圍 0.15–60 μM，

R²=0.9805，LOD 為 0.15 μM 。碳點成功的檢測了添加於自來水中的亞硝酸根離

子，並且成功地透過細胞成像，檢測其中的亞硝酸根離子²⁴。

2019 年，Mingxiao Deng (鄧明虓) 教授與 Changli Lu(呂長利) 教授，使用檸 檬酸及1,10-phenanthrolin-5-amine，以水熱法合成碳點，量子產率為 52%。碳點 平均粒徑為25 nm ，在 400 nm 激發時，會在 430 nm，500nm 及 630nm 放光。

該碳點可以使用市售墨水印表機，在濾紙上重複列印 20 次後，製成 pH 試紙。

該pH 試紙，具有線性範圍 pH=2–7 與 pH=7–12，R²分別為0.9977、0.9976。

pH 試紙成功的檢測了自來水及湖水的 pH 值，並且成功地透過細胞成像，觀察 細胞中的pH 值²⁵。

2017 年，Bai Yang(楊柏) 教授團隊使用鄰苯二胺及多巴胺，以水熱法製備近 紅外放光碳點，量子產率為26.28%。該碳點平均粒徑為 7.8 nm，在 540 nm 激發

時，會在800 nm 放出紅色螢光。該碳點成功進行了小鼠的生物成像，以及在製

作紅色LED 燈的光學應用上²⁶。

2019 年， Shaoming Yu 與 Changlong Jiang 教授團隊，使用檸檬酸鈉及聚丙 醯胺，以水熱法合成藍色螢光碳點；使用對苯二胺溶在乙醇中，以溶劑熱法合成 紅色螢光碳點。藍色螢光碳點，在350 nm 激發時，會在 452 nm 放藍光；紅色螢 光碳點，在350 nm 激發時，會在 620 nm 放紅光。藍色碳點對 Pb²⁺有選擇性，加

入Pb²⁺後螢光淬滅，機制為內濾鏡效應及靜態淬滅；加入紅光碳點後，以螢光比

例式檢測Pb²⁺ ，線性範圍0-200 nM，R² = 0.9931，LOD=2.89 nM。成功使用噴

墨印表機製作試紙，並使用手機分析濾紙顏色，來檢測自來水及湖水中的Pb²⁺，

自來水回收率92.8–113.6%，RSD < 7.6；湖水回收率 95.7–115.2%，RSD < 7.4 ²⁷。

2020 年，Chuan Dong(董川) 教授團隊，使用對苯二胺添加磷酸及氨水控制 酸鹼環境，以水熱法合成綠、黃、紅(鹼中酸性)螢光碳點，量子產率分別為 12%、

8%、16.8%。碳點平均粒徑為 2.57、3.51、4.15 nm ，激發放光波長分別是，361/515 nm、370/560 nm、516/615 nm。碳點皆可以做為自由基清除劑，分別最高清除 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 自 由 基 為 ， 94.76±1.09 ％ 、 92.97±0.91 ％ 、 92.37±1.12％；分別最多清除 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)自由基為，99.45±1.13％，99.09±0.93％，97.66±1.01％。成功在生物成像 上應用碳點。

2019 年，Chuan Dong(董川) 教授團隊使用乙二胺四乙酸(EDTA)及尿素，以 水熱法來製備藍色螢光碳點。該碳點的平均粒徑為4.1 nm，在 365 nm 激發時，

會放出藍色螢光。碳點加三聚氰胺，再以水熱法合成具有磷光的複合材料。該複 合材料的平均粒徑為24–35 nm，在 365 nm 激發下，會放出藍色螢光；停止照光 後，會放出磷光。該複合材料在乾燥或是水中皆有磷光出現，其成功應用在資料 安全防護上²⁸。

2020 年，Xiaoming Yang(楊曉明) 及 Zhangbao Chen(陳章寶) 教授團隊使用

葉酸及菸鹼酸，以水熱法來製備藍色螢光碳點。該碳點的平均粒徑為 4 nm，在

360 nm 激發時，會放出 441nm 的綠色螢光，螢光量子產率為 11.83%。該碳點在 pH = 2–4.08 及 pH = 11.21–13.33，有出現規律的螢光強度變化，R²皆為0.99。碳 點對於亞硝酸根有選擇性，加入後會使螢光淬滅，線性範圍 0.008 至 0.8 M，

R²=0.995，LOD= 21.2 µM；再加入抗壞血酸可以使螢光回升，線性範圍 0.0001 至 0.8 M，R²=0.995，LOD=50 µM。成功在湖水樣品中偵測到亞硝酸根及抗壞血酸，

回收率分別是88%–97.1%；89%–97.9%²⁹。

2020 年，Mohini Sain 教授團隊使用二伸乙三胺及反式烏頭酸，以水熱法來 製備藍色螢光碳點。該碳點的粒徑分佈為2–8 nm，在 355 nm 激發時，會放出 435 藍色螢光，絕對量子產率為81%。碳點對於 Fe³⁺有選擇性，加入以後會使碳點螢 光淬滅，線性範圍2-50 μM，R²=0.99675，LOD=10.42 nM。碳點水溶液在極酸和

7

極鹼環境下，會螢光淬滅，具有檢測pH 值應用的潛力。碳點水溶液可以做為隱

形墨水與酸性溶液進行防偽技術的應用³⁰。

2021 年， Yaoping Hu 教授團隊使用鄰苯二胺及硒脲，溶解在 HCl 中，以水 熱法來製備紅色螢光碳點。CDs 的粒徑分佈為 1–5 nm，在 615 nm 激發時，會放 出625 nm 的紅色螢光，螢光量子產率為 23.6%。CDs 對於孔雀石綠(MG)有選擇 性，螢光淬滅機制為內濾鏡效應，其線性範圍0.07–2.5 μM，R²=0.9997，LOD = 21 nM。CDs 成功在鯉魚、鱸魚及鱈魚樣品中檢測到添加的孔雀石綠，回收率 92.0–

108.0％，RSD 皆小於等於 5.9%³¹。

肆 材料選擇

2019 年，Biyang Deng(鄧必陽) 教授團隊，使用硼酸、對胺基水楊酸及雙甲 基丙烯酸伸乙酯(Ethylene glycol dimethacrylate, EGDMA)，以水熱法合成碳點，

量子產率為19.6%。碳點平均粒徑為 5 nm，在 380 nm 激發時，會在 520 nm 放 綠光。碳點對於 MnO4^–有選擇性，加入 MnO4^–後螢光淬滅，機制為內濾鏡效應 及靜態淬滅，線性範圍0.05-60 μM，R² = 0.9936，LOD =13 nM；再加入卡托普 利後螢光回升，線性範圍0.1-60 μM，R² = 0.9956，LOD =30 nM。成功在河水中 檢測添加的MnO4^–，回收率97.40–101%，RSD < 2.7%；在小鼠血漿中檢測卡托 普利，回收率96.67–101.6%，RSD < 3.1%³²。

2020 年 ， Xianxiang Wang( 王 顯 祥 ) 教 授 團 隊 使 用 diethylenetriaminepentaacetic acid (DPTA)、硝酸鐵及 diethylenetriamine (DETA)，

以水熱法來製備藍色螢光碳點。該碳點的粒徑分部為4–6 nm，在 370 nm 激發時，

會放出455 藍色螢光。碳點具有過氧化酶的特性，可以協助 H2O2氧化OPD。碳 點會被 oxOPD 淬滅螢光，機制為內濾鏡效應，同時 oxOPD 具有顏色，可以做 為比色探針。透過該方法可以檢測H2O2及黃嘌呤，前者螢光檢測線性範圍0–100 μM，R²=0.989，LOD=47 nM，比色法檢測線性範圍 0–100 μM，R²=0.990，LOD=50

nM ；後者螢光檢測線性範圍 0–70 μM，R²=0.995，LOD=20 nM，比色法檢測線 性範圍0–40 μM，R²=0.991，LOD=23 nM 。成功使用兩種方法在人類血清及尿 液中檢測添加的黃嘌呤，螢光法回收率在100.5–102.7%，RSD 小於 3.3%，比色 法回收率在100.1–102.2%，RSD 小於 2.4%³³。

2018 年， Mojtaba Shamsipur 教授團隊，使用對胺基水楊酸及雙甲基丙烯酸 伸乙酯(Ethylene glycol dimethacrylate, EGDMA)，以水熱法合成碳點，量子產率 為27.2%。碳點平均粒徑為 1.6 nm ，在 390 nm 激發時，會在 520 nm 放綠光。

碳點對於MnO4^–有選擇性，加入Fe³⁺後螢光淬滅，機制為Fe³⁺與表面含氧基或胺 基配位，線性範圍0.05–10 μM，R²= 0.9936，LOD =13.7 nM；再加入抗壞血酸後 螢光回升，線性範圍0.2-11 μM，R²= 0.9956，LOD =82 nM。成功在井水、河水 及礦泉水中檢測添加的Fe³⁺ ，回收率 94.0–108.0%，RSD < 4.22%³⁴。

2019 年，Shaomin Shuang(雙少敏) 教授團隊，使用 5-胺基水楊酸，以水熱 法合成碳點。碳點平均粒徑為15.9 nm ，在 550 nm 激發時，會在 594 nm 放出橙 色螢光。該碳點對於pH 有不錯的靈敏度，pH=5.25–6.75 時，螢光強度呈線性關 係，R²= 0.9939，越酸螢光強度越低。碳點對細胞毒性低，成功地透過細胞成像 檢測細胞的pH³⁵。

透過參考上述的文章所使用的胺基水楊酸，我們設計了碳點合成的配方。使 用水楊酸及鄰苯二胺，來做為碳點的碳源及氮源，同時可以為碳點帶來羥基、羧 酸基及胺基。在後續的鑑定及實驗中，證明了這個方法的可行性。

9

伍 碳點螢光感測四環素類抗生素

四環素類抗生素（TCs）是一種廣效抗生素，由於其優異的口服生物利用度

和低成本，因此廣泛用於畜牧業中的微生物疾病控制³⁶。然而，四環素的高使用

率，導致其在環境及畜產物中積累，並嚴重威脅人類及動物健康^37-38。因此，大

量的TC 可能會影響人類和動物的健康，例如：四環素牙齒(四環素牙齒，從胎兒

到八歲期間是牙齒鈣化期。在這段牙齒的成長期使用TC 治療，會造成藥品與鈣

質結合，沉澱於牙齒結構中，導致牙齒永久性的呈現灰黑色³⁹)。目前，在畜產物

（如肉類³⁷，蜂蜜⁴⁰和牛奶³⁸）中發現了抗生素殘留，它們可能引起對過敏者的 過敏反應⁴¹。檢測四環素的常用方法包括電化學分析⁴²，比色法⁴³和高效液相層

析（HPLC）⁴⁴。但是，大多數方法都需要技術人員，精密的儀器和繁瑣的樣品前

處理。因此，我們希望開發一種快速及簡便的方法，可以更有效率的進行快速篩 檢。

2020 年， Kyusik Yun 教授團隊使用茴香花種子，以水熱法來製備藍色螢光 碳點。該碳點的平均粒徑為4 nm，在 330 nm 激發時，會放出 406 nm 藍色螢光，

量子產率為8%。碳點對於四環素與 L-離胺酸有選擇性，加入四環素後，會使碳

點螢光淬滅，線性範圍0.01-40 μM，R² = 0.9994，LOD = 14 nM；加入 L-離胺酸 則是會螢光增強，線性範圍0-500 μM，R² = 0.9990，LOD = 453 nM。碳點成功在

自來水、河水、尿素及奶粉中檢測添加的四環素，回收率分別在98.6–101.5%，

98.4–100.9%，97.5–101.6%，95.1–102.5%。碳點成功在血清中檢測添加的 L-離胺 酸，回收率在98.9–100.3%⁴⁵。

2019 年，Claudia Domini 與 Mariano Garrido 教授團隊使用甘油及尿素，以 微波輔助合成法來製備藍色螢光碳點。該碳點的平均粒徑為13.2 nm，在 345 nm 激發時，會放出435 nm 藍色螢光，量子產率為 9.8%。碳點對於四環素有選擇性，

加入四環素後，使碳點螢光淬滅，線性範圍0.50-25 μM，R² = 0.9997，LOD = 165 nM。碳點成功在尿液中檢測添加的四環素，回收率在 94.7–103.0%，RSD=10.7%⁴⁶。

2020 年，Shaomin Shuang(雙少敏) 教授團隊使用 L-色胺酸及氯化銅，以水 熱法來製備藍色螢光碳點。該碳點的平均粒徑為4.84 nm，在 369 nm 激發時，會 放出464 nm 藍色螢光，量子產率為 9.5%。碳點對於土黴素、四環素及金黴素有 選擇性，加入上述三者後，皆會使碳點螢光淬滅，其機制皆為內濾鏡效應。土黴 素線性範圍 2-44 μM，R²=0.9920，LOD=0.16 nM；四環素線性範圍 2-32 μM，

R²=0.9935，LOD=0.17 nM ；金黴素線性範圍 4-56 μM，R²=0.9930，LOD=0.20 nM 。碳點成功在牛奶中檢測添加的土黴素、四環素及金黴素，土黴素回收率在 103.5–107.5%，RSD=5.1%；四環素回收率在 94.5–110.9%，RSD=5.3% ；金黴素 回收率在102.7–117.8%，RSD=5.8%⁴⁷。

2020 年， Yanzhu Guo 教授團隊使用香菸濾嘴(廢二乙酸纖維素 cellulose diacetate, CDA) 及氨水，以水熱法來製備藍色螢光碳點。該碳點的平均粒徑為 1.93 nm，在 320 nm 激發時，會放出 415 nm 藍色螢光，QY=22.4%。碳點對於四 環素(TC)有選擇性，使碳點螢光淬滅，機制為內濾鏡效應，線性範圍 0–80 μM，

R²=0.9924，LOD=0.06 μM。碳點可以作為螢光墨水應用在文件加密⁴⁸。

2020 年 ， Fanyong Yan 和 Jiping Pang 教 授 團 隊 使 用 檸 檬 酸 及 Diethylenetriamine(DETA)，以水熱法來製備藍色螢光碳點。使用 EDC/NHS 反應，

將2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)phenol (AP)修飾到碳點上，得到 CDs-AP。CDs-AP 的平均粒徑為3.2 nm，在 380 nm 激發時，會放出 488 nm 的藍色螢光，螢光量子 產率為44.7%。CDs-AP 對於四環素有選擇性，其線性範圍 0–18 μM，R²=0.993，

LOD = 0.7 nM。CDs-AP 成功在牛奶樣品中檢測到添加的四環素，回收率為 98.5–

104.0％，RSD 皆小於等於 4.1%。CDs-AP 成功在 MDA-MB-231 細胞中，進行細 胞成像，並檢測四環素⁴⁹。

11

陸 碳點螢光的細胞成像

2020 年，Lili Tong(佟麗麗) 及 Bo Tang(唐波) 教授團隊使用孟加拉玫紅及 branched polyethylenimine (bPEI)，以水熱法來製備綠色螢光碳點。該碳點的平均 粒徑為30–50 nm，在 500 nm 激發時，會放出 528 nm 的綠色螢光，螢光量子產 率為90.49%。碳點成功單獨染色細胞中溶酶體，並且可以維持染色長達 48 小時，

其不會被細胞代謝的原因是，在pH=5.5 時，碳點會有聚集的現象，形成大顆粒

就無法被代謝出去⁵⁰。

2021 年， Jinyan Du 及 Taili Shao 教授團隊使用鄰苯二胺，以水熱法來製備 黃色螢光碳點。CDs 的平均粒徑為 2.6 nm，在 410 nm 激發時，會放出 574 nm 的 黃色螢光，螢光量子產率為8.51%。CDs 對於 Fe³⁺有選擇性，螢光淬滅機制為靜 態淬滅及形成基態複合物；其線性範圍0.05–80 μM，R²=0.998，LOD = 22.1 nM。

CDs 加 Fe³⁺對於焦磷酸根離子(Pyrophosphate ions, PPi)有選擇性，由於 Fe³⁺與PPi 的作用力更強，使碳點的螢光回升；其線性範圍0.5–120 μM，R² = 0.998，LOD

= 73.9 nM。CDs 成功在 A-549 人類肺癌細胞中進行細胞成像，並可以觀測到添 加Fe³⁺與PPi 的螢光變化⁵¹。

柒 研究目的

我們透過簡單的溶劑熱法，調整了由鄰苯二胺（oPD）和水楊酸（SA）的莫 爾比，探討製備的氮摻雜螢光碳點（CDs）的螢光性質。四環素和 CDs 之間的相 互作用使碳點的螢光淬滅，並且螢光強度的減少，相對於四環素的濃度呈線性關 係。此外，CDs 出色的水溶性以及在真實樣品中的良好回收率，使我們可以使用

簡單的螢光法快速檢測不同實際樣品中的TCs。

Scheme 1

13

第二章 實驗方法及藥品 壹 藥品

鄰苯二胺 (oPD) 購自 Alfar Aesar。水楊酸(SA)購自日本 TCI。磷酸二氫鈉、

磷酸氫二鈉與磷酸鈉購自美國 Acros。Tetracycline(TC)、oxytetracycline(OTC) 及 chlortetracycline(CTC) 皆購自日本 TCI。所有化學藥品皆為分析級，無須近一步 純化即可使用。

實驗所需超純水皆由 Milli-Q 系統製作，其電阻值 ≧ 18.25 MΩ/cm。自來 水及飲用水樣品分別來自實驗室水槽桌之水龍頭及飲水機，自來水及飲用水取樣 前皆流動一分鐘後取樣。尿液來自三個月內未服用任何藥物之健康成年男性人類，

人工尿液則是參考過去文獻配置⁵²。酵母菌來自市售的乾燥酵母。

貳 儀器

螢光光譜與吸收光譜分別由日本 Shimadzu 公司，型號 RF-6000 的螢光分 光光度計以及德國 Analytik Jena 公司，型號為 specord 210 plus 的紫外光-可見 光吸收光譜儀測量。本實驗使用之參數：激發光狹縫及放射光狹縫設定為 5 nm；

掃瞄速度 2000 nm/min；放射光掃描範圍 300 - 600 nm，光電倍增管電壓設定為 700 V 。 CDs 由 美 國 Thermo fisher scientific 公 司 ， 型 號 Nicolet iS5 FTIR spectrometer 的傅立葉轉換紅外線光譜儀 (FTIR) 進行鑑定、荷蘭 Philips 公司，

型 號 CM-200 TWIN TEM 的 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 (transmission electron microscopy；TEM) 、美國 Thermo 公司，型號 K-Alpha 的 X 射線電子能譜儀 (X-ray photoelectron spectroscopy；XPS) 所鑑定，而製備樣品皆是將材料以液滴 的形式沉積在矽基材上製成並在室溫下乾燥。酵母菌成像使用日本 OLYMPUS 公司，型號 BX53 的螢光顯微鏡拍攝。細胞成像照片，使用德國 ZEISS 公司，

型號 LSM 900 的雷射共軛焦正立顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy，

LSCM)進行拍攝。

參 碳點合成

碳點由鄰苯二胺及水楊酸作為前驅物，以乙醇做為溶劑，使用溶劑熱法合 成。將 0.162 g (1.5 mmol) 鄰苯二胺與 0.414 g (3 mmol) 水楊酸溶解在 15 mL 之 乙醇中，以超音波震盪 2 分鐘使其完全溶解。將溶液轉移至 50 mL 鐵氟龍杯 中再放入高壓釜內鎖緊，將高壓釜送進高溫鍛燒爐，設定一小時加熱至 240 ℃ 並以 240 ℃ 持續加熱 4 小時。從鐵氟龍杯中取出溶液，使用旋轉濃縮儀將乙 醇去除後，回溶於 15 mL 超純水中，再以 12,000 rpm 離心 10 分鐘後取上層 液過 0.22 μm 的過濾膜過濾。最後將溶液透析 6 小時後，得到 CDs 並保存於 4℃ 冰箱中。

肆 碳點檢測四環素類抗生素

將1400 μL 之超純水、200 μL 0.1 M 的磷酸鹽緩衝溶液(pH 7)、200 μL CDs 溶液以及200 μL 不同濃度的四環素(TC)，土黴素(OTC)，金黴素(CTC)依序添加 於2 mL 離心管中均勻混合，搖晃反應 30 分鐘後使用螢光光譜儀檢測。激發波 長設定295 nm，放射波長為 410 nm 之螢光強度進行分析。

15

伍 檢測真實樣品中的四環素類抗生素

自來水及飲用水樣品分別來自實驗室水槽桌之水龍頭及飲水機，將 9.9 mL 真實樣品分別添加 100.0 μL 不同濃度之四環素(TC)，土黴素(OTC)，金黴素 (CTC)，透過 12000 rpm 離心 10 分鐘後取上層液，過 0.22 μm 的過濾膜過濾。

尿液樣品來自三個月內未服用任何藥物之健康成年男性人類，將尿液稀釋 100 倍後，分別添加 100.0 μL 不同濃度之四環素(TC)，土黴素(OTC)，金黴素(CTC) 於 9.9 mL 之已稀釋的尿液樣品中。

人工尿液是根據過去文獻製備⁵²，包含 KH2PO4 (2.8 g L^-1)，CaCl2 (0.65 g L^-

1)，MgCl2 (0.65 g L^-1)，NaCl (4.6 g L^-1)，Na2SO4 (2.3 g L^-1)，肌酐 (1.1 g L^-1)，

Na3C3H5O(CO2)3 (0.65 g L^-1)，Na2C2O4 (0.02 g L^-1)，KCl (1.6 g L^-1)，NH4Cl (1.0 g L^-1)，尿素 (25.0 g L^-1)，和葡萄糖(0.3％)。

將完成處理的真實樣品取 200 μL 加入含有 1400 μL 的超純水、200 μL 0.1M 的磷酸鹽緩衝溶液(pH 7)、200 μL CDs 溶液之 2 mL 離心管，搖晃均勻反應 30 分鐘後使用螢光光譜儀檢測。激發波長設定 295 nm，觀測放射波長為 410 nm 之 螢光強度。

陸 細胞成像

使用添加含有 10% 胎牛血清之 DMEM 培養基培養人類肝癌細胞 Huh-7，

並在 37 ℃下孵育 48 小時。之後，將 0.18 mg/mL 之 CDs 水溶液加入培養皿中，

於 37 ℃下再孵育 2 小時。孵育完成後，使用 PBS 緩衝溶液(pH = 7.4)清洗細胞 3 次後，取出細胞製片。使用雷射掃 描共軛焦顯微鏡 (Laser scanning confocal microscopy，LSCM)進行生物成像。使用 405 nm 激發波長進行實驗。

細胞成像及細胞毒性測試之實驗，皆委託慈濟大學，劉哲文教授實驗室進行。

柒 酵母菌成像

將市售的乾燥酵母加入 40℃溫水中，浸泡 1 小時使其活化，得到活酵母菌，

保存於室溫中。

取 200 μL 酵母菌溶液加入含有 1000 μL CDs 水溶液的 2 mL 離心管中，搖 晃使其均勻分散後，靜置 10 分鐘，使用超純水清洗酵母 3 次後，取 10 μL 製片 上機。使用螢光顯微鏡觀察螢光。

17

第三章 結果與討論 壹 碳點合成

我們研究了不同合成條件下碳點的量子產率變化(Table 1)，在改變了前驅物

的莫耳比、反應時間及反應溫度後，選則使用 oPD 與 SA 之莫爾比為 1：2，以

乙醇做為溶劑，在240 ℃下，溶劑熱 4 小時，得到最高量子產率(QY=30.88%)的 配方來進行後續的實驗。

Table 1. QY of CDs under different synthesis conditions.

Mole ratio

oPD:SA Temperature(℃) Time(hr) QY(%)

1:0 240 4 N.D.

1:0.01 240 4 0.93

1:0.1 240 4 13.59

1:1 240 4 10.02

1:1.5 240 4 18.05

1:2 240 4 30.88

1:5 240 4 18.94

1:2 280 4 6.09

1:2 200 4 13.06

1:2 160 4 15.27

1:2 240 6 12.02

1:2 240 2 1.05

19

貳 碳點表徵及光學性質

使用 TEM 分析合成的碳點，確認其型態與特徵。根據 Figure 1.(a)的 CDs TEM 圖，可以知道碳點呈現圓形且分散。透過統計得到碳點的粒徑分布在 1.5–

3.0 nm，平均粒徑為 2.02 nm。

Figure 2.(a)顯示了碳點的吸收圖、激發及放射波段。在 237、275 與 292 nm 處的吸收峰歸因於C=C 的 π-π*電子躍遷，這是碳點的典型特徵^{11, 53-54}。而400–

450 nm 處的吸收峰則是受 C=O 的 n-π*的影響。Figure 2.(b)可以看到除了接近最 佳激發波長的290 nm 可以激發出明亮的藍色螢光之外，在 350 nm、400 nm、450 nm 及 500 nm，也可以分別激發出較弱的藍、黃、橙及紅色的螢光，這個性質有 利於我們之後進行多色的細胞成像。

為了研究CDs 的官能團，量測碳點的 FTIR 光譜(Figure.1(b))。碳點在 3410 cm^-1的峰代表了 N-H/O-H 的拉伸震動⁵⁵。在 1620 cm^-1及1480 cm^-1則分別代表 C=C 與 C=N 的拉伸震動⁵⁵。而1380 cm^-1、1250 cm^-1及500 cm^-1代表的是C-N、

C-O-C 與芳香環的 C-H 的吸收震動^{11, 53}。發現這些官能基代表CDs 具有含 C、

N、O 及 H 的官能基團，而這些官能基團是從其前驅物繼承而來的，並使得 CDs 具有良好的水溶性。

XPS 光譜分析了碳點的表面官能基團。在 XPS 全譜圖中，我們得知碳點由 C、N 及 O 組成。如 Figure 3a 所示，碳、氮及氧的比例分別為 71.97%、2.86%和 25.16%。高解析度的 C1s 圖中有 284.8eV、286.5eV 與 288.7eV 三個峰，分別代 表C-C/C=C、C-N/C-O 與 O-C=O^55-57。高分辨率的N1s 圖中有 399.0eV 與 400.5eV 兩個峰，分別代表C-NH2與N-(C)355-58。高分辨率的O1s 圖中有 531.7eV、532.6eV、

533.0eV 及 533.7eV 四個峰，分別代表 C-O、C-OH、C=O 與 C-O-C^{11, 54, 57}。

Figure 1.(a) TEM image of CDs. Inset: size distribution histograms of CDs. (b) FTIR spectra of oPD, SA and CDs.

21

Figure 2.(a) UV–vis absorption spectrum excitation and emission spectrum of CDs (inset, photographs of the CDs under daylight and UV light (excited by 254 nm)).

(b)Fluorescence of carbon dots at different excitation wavelengths. (λex = 290, 350, 400, 450, 500 nm.).

Figure 3. (a) XPS survey, (b) C1s spectra, (c) N1s spectra and, (d) O1s spectra of CDs.

23

參 碳點穩定性

如果要應用在真實樣品的檢驗中，碳點的穩定性是相當重要的。因此，我們 測試了碳點的各種穩定性。在Figure 4a 中，碳點在 1 M 的 NaCl 溶液中螢光強度

沒有太大的變化，表示碳點在高離子強度的環境下可以維持螢光。在pH 範圍 4–

12 螢光強度沒有太大的變化，而 pH 範圍 2–4 環境下，碳點表面會質子化而導 致螢光淬滅(Figure 4b)。使用 365 nm 的 UV 光持續照射 CDs 一小時，期間碳點 螢光並沒有變化，可以判斷其有良好的光穩定性(Figure 4c)。在 Figure.4d 中，碳

點在加入50%不同的有機溶劑後，其螢光強度提升 60%，這對於我們後續檢測配

置於甲醇中的抗生素可能是有影響的，不過我們使用超純水來稀釋甲醇中的高濃

度抗生素，在上機檢測的2 mL 的樣品中，其甲醇濃度極低，不會對碳點螢光造

成影響。

肆 檢測四環素類抗生素的選擇性及靈敏度

透過同時檢測 TCs 與其他抗生素的螢光變化，來評估碳點對於 TCs 的選擇

性。如Figure 5 所示，碳點僅對於 tetracycline, oxytetracycline 及 chlortetracycline 有選擇性。而且在同時含有tetracycline 與其他干擾抗生素時，不會對探點的選擇 性造成干擾。

Figure 4. (a)Stability of the CDs in the existence of different concentrations of NaCl.(b)Fluorescence intensity of the CDs in different pH solutions (10 mM PBS).(c)Effect of the UV irradiation time on the fluorescence intensities of the CDs.(d)Fluorescence responses of CDs in different solvents(50% v/v).

25

Figure 5. (a) Selectivity of the CDs for tetracyclines (100 μM) over other antibiotics.

(b) Interference of CDs for tetracycline over other antibiotics.

如Figure 6a，在加入 5–1000 μM TC 後碳點螢光逐漸淬滅。在插圖中顯示了 TC 濃度在 5–100 μM 具有線性關係，R²為0.998，偵測極限(LOD)為 4.02 μM.

如Figure 6c，在加入 5–500 μM OTC 後碳點螢光逐漸淬滅。在插圖中顯示了 TC 濃度在 5–400 μM 具有線性關係，R²為0.9988，偵測極限(LOD)為 1.21 μM.

如Figure 6e，在加入 5–1000 μM CTC 後碳點螢光逐漸淬滅。在插圖中顯示 了TC 濃度在 5–400 μM 具有線性關係，R²為0.9947，偵測極限(LOD)為 0.69 μM.

值得一提的是，CDs 檢測 TCs 不須添加其他添加劑，可以直接感測 TCs。並

且存在其他其他抗生素的情況下可以顯示出碳點對於TCs 的選擇性。

27

Figure 6. (a) The fluorescence spectra of CDs in the presence of different concentration of tetracycline. (b) Plot of the relative fluorescence intensity I/I0 at 410 nm versus the concentration of TC. Inset: the linear relationship of I/I0 and TC concentration (5–

100 μM). (c) The fluorescence spectra of CDs in the presence of different concentration of oxytetracycline. (d) Plot of the relative fluorescence intensity I/I0 at 410 nm versus the concentration of OTC. Inset: the linear relationship of I/I0 and OTC concentration (5–400 μM). (e) The fluorescence spectra of CDs in the presence of different concentration of chlortetracycline. (f) Plot of the relative fluorescence intensity I/I0 at 410 nm versus the concentration of CTC. Inset: the linear relationship of I/I0 and CTC concentration (5–400 μM).

伍 檢測四環素類抗生素的機制

為了探討碳點加入 TCs 後的螢光淬滅機制，將 TCs 的吸收圖分別與碳點的

激發放射圖做疊圖(Figure. 7)。而圖中我們可以知道 TCs 的吸收大範圍的覆蓋 CDs 的激發及放射波峰，可以判斷螢光淬滅機制可能為內濾鏡效應(inner filter effect, IFE)。

為了更進一步的證明碳點螢光淬滅機制為內濾鏡效應，做了一系列的實驗來 證實。如圖Figure 8 所示，碳點在加入 TC 後，在吸收圖譜中與理論疊圖(碳點吸

收值與TC 吸收值相加)是幾乎重疊的，因此可以判斷 TC 與碳點並沒有產生新的

鍵結。同樣的，從圖Figure.9，可以看到在分別添加 1–3×10^-4 M 的 TCs 後，吸

收是持續上升的，並沒有出現等吸收點，可以從這裡判斷TCs 與碳點沒有產生新

的錯合物。

我們還做了 FTIR 的鑑定，如 Figure.10 所示，在分別添加了 TC、OTC 與 CTC 後，CDs 的 FTIR 訊號並沒有太大的改變，可以確認 TCs 不會影響 CDs 的 表面官能基。

在 Figure 11 中，比較加入 TCs 後的 TEM 圖，圖中統計出的平均粒徑大小 分別，CDs 加 TC 為 2.01 nm，CDs 加 OTC 為 1.98 nm，CDs 加 CTC 為 2.01 nm，

與CDs 本身的粒徑大小 2.02 nm 沒有太大的改變，因此可以認為碳點在加入 TCs 後，沒有產生聚集或是分解。

29

另外，我們使用文獻中已知的方法驗證碳點淬滅機制⁵⁹。透過Parker 方程式

將碳點受到TC 影響所淬滅的螢光校正回來，藉此得知是否有内濾鏡效應(IFE)。

螢光校正公式如下：

𝐹_𝑐𝑜𝑟

𝐹_{𝑜𝑏𝑠𝑑}= 2.3𝑑𝐴_𝑒𝑥

1 − 10^{−𝑑𝐴𝑒𝑥}10^{𝑔𝐴𝑒𝑛} 2.3𝑠𝐴_𝑒𝑚 1 − 10^{−𝑠𝐴𝑒𝑚}

各個符號分別代表，Fobsd最大螢光強度，Fcor修正過後的最大螢光強度，Aex

激發波長處的吸收，Aem為放射波長處的吸收，s 為激發光光徑，g 為激發光束邊 緣和樣品槽邊緣之間的距，d 為樣品槽的寬度。詳細數據如表 2。

如Figure.12，成功透過公式校正螢光，校正後的螢光明顯與校正前有區分開

來，可以明確的知道螢光淬滅機制為內濾鏡效應。

Figure 7. The mechanisms of tetracycline (TC) detection by CDs The maximum excitation (blue line), emission (red line) fluorescence spectra of CDs and UV spectrum of (a) TC (black line), (b) OTC, (c) CTC.

31

Figure 8. UV–vis absorption spectra of CDs, TC, CDs+TC, and the summed UV–vis absorption spectrum of CDs and TC, respectively.

Figure 9. UV-vis absorption spectra of CDs, in the presence of 100,200 and 300 μM (a) TC, (b) OTC and (c) CTC.

33

Figure 10. FTIR spectra of CDs, and CDs with TC, OTC and CTC.

Figure 11. TEM images of CDs with (a)TC, (b)OTC, (c)CTC.

35

Figure 12. Suppressed efficiency (E, %) of observed (black line, Eobsd) and corrected (red line, Ecor) fluorescence intensity, λex = 295 nm, λem =410 nm.

Table 2. Parameters used to calculate IFE of TC on the fluorescence of CDs.

concentration

(μM) Aex Aem Fobsd Fcor Eobsd(%) Ecor(%)

TC

100 0.152 0.019 39519.9 47700.51 6.2 3.8 200 0.273 0.034 32318.6 44987.49 23.3 9.3 300 0.399 0.051 26658.7 42893.84 37.6 13.5 400 0.510 0.063 21775.4 39500.57 48.4 20.4 500 0.639 0.080 17725.1 36709.92 57.8 26.0 600 0.756 0.094 15125.9 35137.46 64.0 29.2

OTC

100 0.1277 0.0049 60795.9 70370.42 14.94 2.99 200 0.2247 0.0161 51149.3 66469.96 28.44 8.37 300 0.3397 0.0283 43369.8 64236.32 39.32 11.45 400 0.4465 0.0422 36200.6 60397.23 49.35 16.74 500 0.5632 0.0571 31416 59354.08 56.04 18.18 600 0.6855 0.0755 26154.3 56118.22 63.40 22.64

CTC

100 0.097 0.008 58217.7 64316.26 18.64 2.59 200 0.184 0.025 48920.6 61476.14 31.63 6.89 300 0.307 0.068 40647.1 60750.42 43.20 7.99 400 0.417 0.109 32500.3 56536.51 54.58 14.37 500 0.526 0.148 27051.6 54308.06 62.19 17.75 600 0.645 0.190 22059.3 51527.68 69.17 21.96

37

陸 真實樣品中感測四環素類抗生素

為了證實本方法的實用性，我們進行了自來水、飲用水、人工尿液及人類尿

液中的 TCs 檢測。將不同濃度的 TCs 加標到樣品中，然後透過上述方法進行分

析。

如表 3 所示，檢測自來水中添加的 TC，OTC 和 CTC 回收率分別在 87.6–

104.2％，95.9–98.9％和 97.7–107.2％之間，相對標準偏差（RSD）分別小於 6.6

％，6.7％和 6.9％（n = 3）。檢測飲用水中添加的 TC，OTC 和 CTC 回收率分別 在89.8–101.2％，99.1–104.9％和 98.6–110.5％之間，相對標準偏差（RSD）分別 小於4.1％，5.1％和 6.4％（n = 3）。

如表4 所示，檢測人工尿液中添加的 TC，OTC 和 CTC 回收率分別為 93.1–

94.7％，95.4–101.4％及 98.8–109.3％，RSD 小於 2.5％，5.2％及 5.4％（n=3）。 檢測人類尿液中添加的 TC，OTC 和 CTC 回收率分別為 82.9–100.8％，90.3–

96.6％及 90.1–105.8％，RSD 小於 2.5％，4.6％及 3.0％（n=3）。

Table 3. Determination of tetracyclines in tap water and drinking water.

Sample Analytes Spiked level

(μM) Found (μM) Recovery (%)

RSD (%) (n = 3)

Tap water

TC

10 10.4 104.2 3.2

25 23.6 94.4 6.6

50 43.8 87.6 4.2

OTC

10 9.6 96.6 6.3

25 23.9 95.9 6.7

50 49.5 98.9 4.2

CTC

10 10.0 100.5 6.9

25 24.4 97.7 3.3

50 53.6 107.2 1.1

Drinking water

TC

10 8.9 89.8 1.3

25 24.8 99.3 4.1

50 50.6 101.2 4.1

OTC

10 9.9 99.6 1.5

25 26.2 104.9 5.1

50 49.5 99.1 4.2

CTC

10 9.8 98.6 3.5

25 27.6 110.5 6.4

50 51.5 103.0 6.3

39

Table 4. Determination of tetracyclines in artificial urine and urine.

Sample Analytes Spiked level

(μM) Found (μM) Recovery (%) RSD (%) (n = 3)

artificial urine

TC

10 9.31 93.1 0.7

25 23.68 94.7 2.5

50 47.32 94.6 2.4

OTC

10 8.99 95.4 4.9

25 26.32 101.4 3.5

50 50.83 100.7 5.2

CTC

10 10.76 105.9 4.9

25 24.09 98.8 2.4

50 54.04 109.3 5.4

urine

TC

10 8.29 82.9 2.2

25 25.21 100.8 1.1

50 48.17 96.3 2.5

OTC

10 9.03 90.3 4.3

25 24.14 96.6 3.3

50 47.02 94.0 4.6

CTC

10 9.01 90.1 3.0

25 23.67 94.7 3.0

50 52.92 105.8 3.0

柒 Huh-7 細胞成像

為了確認 CDs 是否能在生物系統中應用，我們選擇 Huh-7 人類肝癌細胞，

來進行CDs 對於細胞毒性的測試。如 Figure.13 所示，在添加 0–18 μg/mL 的 CDs 後，細胞的存活率還是超過80% (n=5)，這樣的數據顯示了 CDs 絕佳的生物相容 性。

透過使用雷射掃描共軛焦顯微鏡，進行了 CDs 在細胞成像的應用，將 18

μg/mL 的碳點添加進 Huh-7 細胞中，孵育 2 小時後，使用螢光顯微鏡觀察。如 Figure.14 所示，可以看到與亮場相對應的細胞位置，有綠色和紅色的螢光出現。

因此，可以認為CDs 有作為生物成像的染劑在生物醫學上應用的潛力。

41

Figure 13 Cytotoxicity test of CDs on Huh-7 cells viability. The values represent percentage cell viability.

Figure 14. (a-c) Images of Huh-7 cells without CDs. (d,g) Bright field images of Huh- 7 cells incubated with 0.18 μg/mL CDs. (e,h) Black field images of Huh-7 cells incubated with 0.18 μg /mL CDs. (f,i) The overley of (d,e) and (g,h).

43

捌 酵母菌螢光成像

從上述的細胞成像，我們已知碳點對於細胞低毒性，具有良好的生物相容性。

我們還進行了，酵母菌的螢光成像實驗，將 1 mL (0.18 mg/mL)的 CDs 加入酵母

菌中，孵育10 分鐘後，使用螢光顯微鏡觀測。

如 Figure.15 所示，未添加碳點時，與亮場照片相對應的位置，酵母菌具有

微弱的藍色螢光，在添加碳點後，可以看到酵母菌具有明亮的藍綠色螢光，碳點 可以成功地對酵母菌進行螢光成像。我們可以得知，碳點不只可以進行細胞成像，

還可以進行真核生物的螢光成像。

Figure 15. fluorescence microscopy images of yeast incubated (a),(b)with and (c),(d)without CDs.

45

第四章 結論

總之，我們用鄰苯二胺和水楊酸製備了 CDs。製備的 CDs 表現出優異的螢

光特性，螢光量子產率為30.88％。我們將製備的 CDs 用於 TCs 的選擇性檢測。

發現螢光淬滅效率與 TC 濃度在 5–100 μM 範圍內呈現良好的線性關係，R²為 0.998，偵測極限為 4.02 μM，OTC 線性範圍在 5–400 μM，R²為0.999，偵測極 限為1.21 μM，CTC 的線性範圍在 5–400 μM，R²為0.994，偵測極限為 0.69 μM。

對自來水、飲用水、人工尿液及人類尿液樣品進行的實驗，具有良好的回收率和 令人滿意的準確度，檢測自來水中添加的TC，OTC 和 CTC 回收率分別在 87.6–

104.2％，95.9–98.9％和 97.7–107.2％之間，相對 RSD 分別小於 6.6％，6.7％和 6.9％（n = 3）。檢測飲用水中添加的 TC，OTC 和 CTC 回收率分別在 89.8–101.2

％，99.1–104.9％和 98.6–110.5％之間，相對標準偏差 RSD 分別小於 4.1％，5.1

％和6.4％（n = 3）。檢測人工尿液中添加的TC，OTC 和 CTC 回收率分別為 93.1–

94.7％，95.4–101.4％及 98.8–109.3％，RSD 小於 2.5％，5.2％及 5.4％（n=3）。 檢測人類尿液中添加的 TC，CTC 和 OTC 回收率分別為 82.9–100.8％，90.3–

96.6％及 90.1–105.8％，RSD 小於 2.5％，4.6％及 3.0％（n=3）。另外，CDs 的

低細胞毒性及絕佳的生物相容性，使其成功進行了 Huh-7 人類肝癌細胞及酵母

菌的螢光成像。

第五章 參考文獻

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