環境微生物實驗
畫碟法.倒碟法.塗抹法
原理
1. 概述微生物的培養可以分為混合跟純種培養,混合培養是利用一種以上微生 物(混合菌種)進行培養,可以表現群體生存的共同特性,環境工程中二級處理廢 水時活性污泥之生長.衛生掩埋法進行固體廢棄物的處理為混合培養的典型 實例.而純種培想是以單一微生物菌種及其衍生物生細胞進行之
而純種培養方法主要 (1) 增值培養
用調整的培養條件,以便篩選某種特殊微生物的過程稱為增殖培養,也是 一個純種培養的重要步驟之ㄧ,可仰制一些會干擾培養過程之微生物生 長.
(2) 分離
經由增值步驟可將想研究的於選擇性培養機中大量繁殖,然而可能有少 數其他菌種存於其中,無法完成純化因此有必要進一部利用分離技術把 微生物分離成獨立菌落,達成純種培養.
1. 倒碟法:又稱為混合稀釋法,先以接種環或吸管進行連續稀釋,接著各 取 1ML 稀釋菌連同 40 到 50 度溶融狀態的固體培養基一起置入已滅 菌的培養液一齊治入已滅菌的培養皿中,等凝固後置於恆溫培養箱 培養即可獲得最佳分離效果 並可用於微生物的記數
2. 畫碟法;利用接種環將待分離的樣品均勻劃於固體培養基表面,如此 可將混合,如此可將混合生長的菌落分離成單一菌落,達到純種培養 的目的
3. 塗抹法;地入幾滴菌液再培養皿再利用三腳彎棒塗抹菌液在固體培 養基上
2. 大量培養包含批次培養跟連續培養
(1) 批次培養;在營養有限的情況下培養為生物,因此微生物生長有限而活性 也不能維持太長的時間
(2) 連續培養;可以不斷有新的營養援助入培養皿中還有代謝物質會定時排 出,所以菌體可以保持活性和新鮮度
步驟
塗抹法：將菌液稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取 0.1ml 固定量滴至培養基中央，
將三角彎棒沾取酒精後微微過火一下，在培養皿蓋子稍微塗一下，在
將培養基中的菌液塗抹均勻，放至 37oc 培養箱培養。以 30～300 個菌為 主。
倒碟法：將菌液稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取 0.1ml 固定量，之後先配置培 養基，因需做 5 培養皿，所以取 125ml 二段水及 2.875g 的豐富培養基 配製，等培養基配製完成後冷卻至 40oc 左右，與固定量的菌液一起混 和均勻，放置 37oc 的培養箱培養。
劃碟法：拿取 5 個培養基，將接種環燒烤至火紅色，在將接種環放入菌液裡面，
在劃碟時要注意路徑不要重複，完成第一次劃碟時接種環還要在火燒 一次，劃之前先在空白的培養基降溼，在以第一次劃碟的部份作為菌 的來源，在劃第二次，依序做完 5 個培養基。
實驗器材設備及水樣來源
設備：微風培養箱、高溫高壓滅菌釜、電子天平
器材：5 支試管、酒精燈及酒精、打火機、燒杯、三教彎棒、接種環、10 個培養皿
（含培養基）、定量玻璃吸管及吸球
培養基部分：5 個空的培養皿（用 125ml 二段水及 2.875g 的豐富培養基配製）、
取藥杓、隔熱手套、秤藥紙、錐型瓶 取樣來源：實驗室外水池
問題
1. 討論你們這組以三種分離技術（劃碟法、塗抹法與倒碟法）所得之實驗結果 是否成功地分離微生物，即在培養基形成單一菌落？若無單一菌落，說明實 驗可能失敗的原因。
有幾個稀釋倍數沒有分離成功。
有可能是水樣加太多
2. 試述劃碟法、塗抹法和倒碟法的實驗原理、步驟及其實驗中應注意事項？
先將菌液稀釋 5 個連續倍數
塗抹法：取 0.1ml 到培養基中央，將三角彎棒沾取酒精過一下火，在培養基 上將菌液小心塗抹，要注意彎棒過火及塗抹的部份。
倒碟法：取固定液 0.1ml，自行配置培養基放置高溫高壓滅菌釜滅菌，等冷 卻之後與固定菌液倒入培養皿混和，注意培養基溫度不要太高。
劃碟法：將接種環火烤至呈現紅色，在放入菌液裡後取出，注意接種環上是 否有水膜，在劃碟時路徑不要重複到。
為何實驗需有對照組，其目的為何？若對照組上有微生物生長代表什麼意義？
（1）可以檢測培養基裡有無受到其他微生物的汙染，假如對照組有，那實 驗出來的東西可能就不準確了
（2）培養基已經受到污染
討論
這次的實驗要注意到劃碟、倒碟及塗抹等這些方法，塗抹法在前幾個實驗都有做 過，只是要小心彎棒不要燃燒太久，以免斷掉，倒碟法較麻煩，得自行配製培 養基，劃碟法則是需要將接種環燒到火紅為止，且小心注意路徑不要重複。
心得
致維：這次的實驗學習三種分離技術，其實有些步驟相差不多，在這次稀釋部 分應該算是很成功，在拿器材時真的要小心的使用，實作快到了，要把 這些步驟一個一個記起來。
俊綸：我們這一次做的實驗，跟上次做的實驗差不多，但多了兩個新的東西要 做 但沒想到結果最後，我在做塗抹法的時候，沒想到三角彎棒我因為在 用火燒的時候燒太久了，結果因為受不了熱度而斷掉，真的太不小心了。
文迪：這次我們做第六組的實驗，除了等培養皿高溫殺菌時間外，其餘時間已 開始實驗步驟與方法，這次除了塗碟法還做了倒碟法，經過老師的教導 使得我們更加熟析道碟法，以及實驗的重要性。
從源：這次的實驗除了要數量不算少的培養皿外，用儀器在培養皿上面劃碟也 個很重要的步驟，還有要將駿逸低在培養皿上面的時候使用玻璃棒消毒 過火的動作也不可馬虎，還有組員不小心將玻璃棒弄斷，不過實驗很順 利的進行。
實驗數據
倒碟法 10-1
菌數：161
計算菌液：161*10*10＝1.61*104
10-2
菌數：137
計算菌液：137*10*100＝1.37*105 10-3
菌數：56
計算菌液：56*10*1000＝5.6*105
10-4
菌數：9
計算菌液：9*10*10000＝9*105 10-5
菌數：3
計算菌液：3*10*100000＝3*106
倒碟法
161 137
56
9 3
0 50 100 150 200
10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 稀釋倍數
菌落數
菌數
平均數＝（1.61*104+1.37*105+5.6*105+9*105+3*106）/5＝9.23*105 標準差＝【58.845*1011/5-1】1/2＝1212899.419≒1.21*106
塗碟法 10-1
菌數：TNTC
10-2
菌數：217
計算菌液：217*10*100＝2.17*105 10-3
菌數：113
計算菌液：113*10*1000＝1.13*106
10-4
菌數：84
計算菌液：84*10*10000＝8.4*106 10-5
菌數：19
計算菌液：19*10*100000＝1.9*107
塗碟法
217
113 84
0 19 50 100 150 200 250
10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 稀釋倍數
菌落數
菌數
平均數＝（2.17*105+1.13*106+8.4*106+1.9*107）/5＝5.75*106 標準差＝【23.45*1013/4-1】1/2＝8841191.473≒8.84*106
劃碟法 10-1
菌數：18
10-2
菌數：5 10-3
菌數：8
10-4
菌數：3 10-5
菌數：2
