國立臺灣大學公共衛生學院職業醫學與工業衛生研究所 碩士論文
Graduated Institute of Occupational Medicine and Industrial Hygiene College of Public Health
National Taiwan University Master Thesis
大氣微粒於第一型糖尿病大鼠動物模式 糖尿病腎病變之研究
Diabetes Nephropathy in Type 1 Diabetes Animal Model Exposed to Ambient Particulate Matter
羅鎧 Lo, Kai
指導教授：鄭尊仁 博士
Advisor: Cheng, Tsun-Jen, MD, Sc.D.
中華民國 99 年 7 月
July, 2010
II
致謝
這篇致謝文的開始，我要感謝主耶穌基督，藉由王榮德老師介紹讓我進到鄭 尊仁實驗室。
感謝老師的指導，隨時敞開大門讓學生進去跟他討論，我印象中從來沒有被 老師拒絕過，所以鄭老師實驗室是沒有 office hour 的。其次是老師對於每個我們進 行的實驗都會仔細的討論，給予指導且告訴我核心的知識。在實驗結束的時候，
不因學生實驗失敗怒罵學生，而是要我去思考哪個環節出現問題要我去解決，寫 下討論報告，並語重心長的告訴我我做錯了甚麼。
站在巨人的肩膀上可以看得更遠，是牛頓說的，我在我現階段的人生中遇到 了我智識上的巨人，他甘願讓我踩在他的肩膀上，只為了使我看得更遠，想的更 多，老師是真實去實踐用生命去感動生命。也給我一個榜樣讓我相信科學的真善 美。
感謝實驗室的夥伴亭亭，雖然你的脾氣不好，但也是個真性情的人，在你的 面前絲毫不能說客套話，都是要說濺血濺淚的真心話，也辛苦你容忍我優柔寡斷 和閒適的個性，雖然我不太懂你的實驗，可是我想你大概需要一個人傾聽你做了 甚麼，希望我可以幫到忙。直到今天我都覺得真是交到一個好朋友跟實驗夥伴。
最後感謝實驗的其他成員，蓉燕、哲雯、元鴻學長、雅如提供我實驗上的幫 助，還有乖巧的學妹們小阮、安琪，在我的犧牲實驗上提供極大的幫忙。以及我 的父母他們提供我精神和經濟上的支柱讓我專心致力於實驗。
羅鎧致謝
I
目錄
目錄...I 圖目錄... III 表目錄... IV 摘要... V Abstract ...VII
一、前言... 1
二、文獻回顧... 2
2-1 微粒空氣汙染與糖尿病之流行病學研究... 2
2-2 微粒空氣汙染與心血管、糖尿病之毒理學研究... 5
2-3 糖尿病之病理生理學... 8
2-4 糖尿病造成之慢性腎病變... 11
2-5 腎功能異常指標 ... 12
2-6 第一型糖尿病疾病動物模式... 13
三、研究方法... 15
3-1 實驗設計流程 ... 15
3-2 實驗動物 ... 16
3-2-1 實驗動物飼養條件 ... 16
3-2-2 第一型糖尿病大鼠誘發 ... 16
3-3 測量方法 ... 16
II
3-3-1 常規測量 ... 16
3-3-2 大鼠犧牲、抽血、臟器組織處理 ... 17
3-4 微粒暴露和監測 ... 19
3-5 統計方法 ... 20
四、結果... 21
4-1 暴露資料 ... 21
4-2 體重 ... 21
4-3 24-hr飲水量... 21
4-4 血糖 ... 22
4-5 24-hr尿量... 22
4-6 Albumin creatinine ratio (ACR) ... 22
4-7 24-hr total albumin... 23
4-8 Cell blood count/ differentiated cell (CBC/DC) ... 23
4-9 Biochemical markers ... 25
五、討論... 27
六、表與圖... 34
七、參考文獻... 63
III
圖目錄
圖1 Body weight measurement ... 34
圖2 Location of NTU school of public health... 37
圖3 Drinking water measurement on the 4th, 8th, 12th week... 38
圖4 Blood glucose measurement on the 4th, 8th, 12th week ... 39
圖5 Urine volume measurement on the 4th, 8th, 12th week ... 40
圖6 ACR measurement on the 0th,4th, 8th, 12th week... 41
圖7 24hr total albumin measurement on the 0th,4th, 8th, 12th week... 42
圖8 Red blood cell related indicators ... 43
圖9 Platelet related indicators... 44
圖10 Hemoglobin related indicators... 45
圖11 White blood cell related indicators... 46
圖12 Biological indicators... 49
IV
表目錄
表1 PM mess concentration in exposure cage and ambient environment.. 50
表2 Daily drinking amount (ml/day)... 51
表3 Fasted glucose (ug/dL) ... 52
表4 Urine volume (ml/day) ... 53
表5 Albumin creatinine ratio (ACR) (mg/g) ... 54
表6 Total albumin(mg/day) ... 55
表7 Red blood cell related indicators ... 56
表8 Platelet related indicators... 57
表9 Hemoglobin related indicators ... 58
表10 White blood cell related indicators... 59
表11 Biological indicators... 60
V
摘要
目的：建立糖尿病腎病變動物模式並探討亞慢性暴露週遭大氣微粒對於第 一型糖尿病腎臟之健康效應。
方法：(Sprague-Dawley)SD 大鼠注射 Streptozotocin(STZ)(55mg/kg body weight)後造 成胰島組織受損而無法分泌胰島素，作為第一型糖尿病大鼠動物模式。施打後以 血糖高於300mg/dL 做為標準，視為誘發成功。使用此糖尿病動物去進行為期 16 週的亞慢性大氣微粒暴露。每四週採24 小時尿液，最後於 16 週犧牲取其血液、
尿液以及器官。
結果：血糖、胰島素以及糖化血色素(HbA1c)等糖尿病相關之生理指標均達到糖尿 病標準。此外代表腎功能的白蛋白肌酐酸比值(ACR)在糖尿病組均顯著高於控制 組，我們斷定在第一型糖尿病腎病變大鼠動物模式誘導成功。以全身性暴露腔 Individual Ventilation Chamber (IVC)做為媒介，使大鼠進行長期大氣微粒全身性呼 吸暴露(24hr/day, 7days/week,共 16 週)，並以呼吸過濾空氣之大鼠做為對照組。結 果發現大氣微粒對於糖尿病大鼠在腎功能上-白蛋白肌酐酸比值(ACR)具有負面健 康效應(160.86±117.73mg/g vs 267.74±433.17mg/g)，但不具有統計上的顯著效應。
但是HbA1c 卻發現在暴露組顯著高於控制組，僅觀察到這樣的現象但詳細的機制 仍然不明。
結論：雖然大氣微粒並未對糖尿病大鼠在腎病變上具有顯著的負面健康效應，但 可稍微觀察到趨勢，此外經過暴露後糖尿病大鼠的HbA1c 有顯著上升，然後無血 糖資料以及其他資料支持，機制仍然不明，但可做為未來亞慢性大氣微粒暴露於 易感族群研究的參考。
VI
關鍵字：第一型糖尿病，腎病變，亞慢性呼吸暴露，腎絲球， 大氣微粒。
VII
Abstract
Objective: to establish successful type 1 diabetes nephropathy animals and explore the health effect of ambient particulate matter by this model
Method: male SD rats received 55mg/kg body weight STZ by intravenous injection to induce and become type 1 diabetes. Blood glucose being 300mg/dL is the standard for discriminating it is diabetic or not. And we used this model to deal with 16 weeks subchronic inhalation exposure study.
Results: we observed that insulin and HbA1c reach to the criteria of diabetes mellitus (DM) level and the albumin creatinine ratio(ACR) was significantly higher in DM group than in healthy group. Thus, we consider the type 1 diabetes nephropathy animal model was established successfully. The ambient air particulate matter (PM) was conducted by individual ventilation cage (IVC) system. The whole body inhalation exposure was ongoing (24hr/day, 7days/week and 16 weeks).The diabetes rats in exposed group were compared to non-exposed group and we found that ACR in exposed group was slight higher than non-exposed group but without significant difference(160.86±117.73mg/g vs 267.74±433.17mg/g), but we observed HbA1c was higher in exposed group than in control group. However the detailed mechanism is still unclear.
Conclusions: Our results have shown that ambient air PM has no significant negative health effect but we observe HbA1c is elevated in diabetes exposed rats. Even though the mechanism of increased HbA1c is unclear in exposed group ,we can take this to be the reference in the future study.
key words: type 1 diabetes, Diabetes nephropathy, subchronic inhalation exposure, glomerulus, ambient air particulate matter
1
一、前言
在流行病學研究中發現，大氣微粒和多種心血管相關疾病的死亡率和住院率 有高度相關，雖然從人類活動所排放的大氣微粒對於正常健康個體不具有威脅 性，但許多文獻指出有心血管方面疾病患者對於大氣微粒具有高度的敏感性，然 而近幾年來易感受族群研究已經轉向糖尿病等新陳代謝異常的議題，過去流行病 學和毒理學研究指出，糖尿病患者或是糖尿病動物模式本身就具有多重併發症的 危險性，糖尿病也和心血管疾病分享部分的致病機轉，但是仍有許多部分尚待釐 清。此外我們知道糖尿病除了對於大直徑血管的傷害之外，對於腎臟上的小型血 管也具有傷害力，有許多研究也指出糖尿病藉由傷害腎絲球體上的小血管進而改 變腎臟的腎功能甚至導致腎臟功能喪失。因此本實驗利用第一型糖尿病疾病動物 模式，藉由亞慢性呼吸使動物暴露於周遭大氣微粒，因而去探討大氣微粒對於循 環系統中較小直徑血管的衝擊-糖尿病腎病變。因此本實驗探討下列幾個研究：
研究一：第一型糖尿病腎病變大鼠是否誘導成功。
研究二：經由呼吸暴露後，比較健康大鼠和糖尿病大鼠的對於周遭大氣微粒 的健康效應。
研究三：進行大氣微粒慢性暴露實驗，藉由定期追蹤糖尿病大鼠白
蛋白肌酐酸比值或是 24 小時總蛋白尿判斷糖尿病大鼠腎病程度。
研究四：大鼠犧牲後觀察白血球產生情況、糖化血色素、肝功能、脂質資料 等，去判斷大氣微粒的其他健康效應。
2
二、文獻回顧
2-1 微粒空氣汙染與糖尿病之流行病學研究
空氣汙染造成的長期健康效應有以下:Pope等人發表於1999年的研究，針對90 位平均年齡77歲的老人，時間是1995-96年間，地點在Utah vallay, USA。兩個心血 管生理指標被使用，其一是血氧飽和度，其二是心跳率。所觀察暴露物質為PM10(微 粒粒徑小於10um)。結果發現PM10在暴露前一日每上升100ug/m3和心跳率上升 0.78beat/min有統計上相關。進一步研究指出PM10前一日每上升100ug/m3和心跳率 上升5beat/min或10beat/min的勝算比分別是1.29和1.95倍並且有統計上顯著(Pope et al.,1999)。
Pope等人發表於2002年研究，針對全美500000筆的死因資料和空氣汙染物比 對，結果發現PM10重量濃度上升10ug/m3則全死因風險上升4%，心肺死因風險上升 6%，肺癌上升8%。Pope等人在2004運用同一筆族群資料分析，結果發現PM10重量 濃度上升10ug/m3則鬱血性心臟病，心律不整，心衰竭，和心震顫之風險上升8%-18%
不等(Pope et al.,2002)。
空氣汙染造成的短期健康效應，最著名的是美國NMMAPS(National Morbidity, Mortality, and Air Pollution Study) : Samet等人發表在2000年的研究，針對美國20個 大都市的死亡率，觀察暴露物質為美國環保署公告持續監測的五大汙染物，PM10， 臭氧，二氧化氮，二氧化硫，一氧化碳。結果發現PM10重量濃度上升10ug/m3則全 死因(total death)估算相對死亡率(estimated relative mortality)上升0.51%，此外PM10
重量濃度上升10ug/m3則心血管和呼吸道估算相對死亡率(estimated relative mortality)上升0.68%(Samet,2000)。
短期效應探討短期死亡率、住院率、急診次數、症狀惡化程度(多和呼吸道有
3
關)。關於短期死亡率研究，Schwartz發表在2000年的研究指出，PM10五天的動平 均(moving average)重量濃度每上升10ug/m3死亡率上升1.4%，但若是看PM10四天動 平均或是單天的平均值重量濃度會低估暴露造成的死亡率效應(Schwartz,2000)。
關於住院率研究，Linn等人發表在2000年的研究指出，每增加一個一氧化碳的 四分位距(quartile)，因心血管疾病住院率上升4%，NO2、PM10都有同樣顯著的住 院率增加，但是O3卻具有保護效應(Linn et al.,2000)。關於急診次數研究，Delfino 等人發表在1997年研究指出每一單位的O3平均值增加，則因呼吸道急診次數上升 21%，每一單位的PM10,PM2.5, 和附著在微粒上的SO4平均值增加則分別造成急診 次數分別上升12%、16%、6%，健康效應相較臭氧較低。關於症狀惡化程度研究 (Delfino et al.,1997)，Schwartz等在1994年研究指出，對象為美國六城市中1844位 學童，暴露物質為PM10和PM2.5，發現PM10的增加和下呼吸道病症以及咳嗽事件都 有顯著相關(Schwartz et al.,1994)。
短期效應除了上述的呼吸道疾病之外，也有微粒和心血管方面的研究，這些 部分包含缺血性心臟病、心震顫、心衰竭。Hoek等人發表在2001年的研究指出，
腦血管病變、心震顫、心肌梗塞、心衰竭，和微粒空氣汙染有較高的相關性。而 在微粒空氣汙染和心血管死因研究中發現，這四種死因相較於總心血管死因的相 對風險(relative risk)為四到五倍(Hoek et al.,2001)。在台灣的研究，Tsai等人發表於 2003年，本研究使用因腦內出血產生的住院率當作健康效應，發現PM10和NO2上升 會造成腦內出血這項健康效應的相對風險上升(Tsai et al.,2003)。最近的大型研究也 顯示，個人疾病狀況會對微粒造成的死亡有修飾效應(modified effect)(Zeka et al.,2006)。
從上述的幾項研究針對心血管相關疾病造成的長期效應和短期效應進行研 究，而這些研究似乎都指向心血管疾病患者相較於其他種類病患對於空氣汙染或
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是空氣當中的微粒，例如PM2.5或是較大尺度微粒PM10有較高的易感受性。Goldberg 等人發表在2001年的研究，觀察的暴露汙染物為PM2.5和硫化物，結果發現糖尿病 患和呼吸疾病病患產生的死亡率和暴露汙染物有高度相關性。Zanobetti等人發表在 2001年研究中，針對心血管疾病患者區分為有糖尿病和無糖尿病患者，結果發現 空氣中微粒濃度每上升10ug/m3有糖尿病的心血管病患的住院率為無心血管病患住 院率的兩倍，此篇研究認定糖尿病為心血管疾病的修飾因子(Zanobetti et
al.,2001)。Zanobetti等人發表在2002研究指出糖尿病與非糖尿病患者相比，有2倍
的PM10微粒相關心血管疾病住院率(Zanobetti et al.,2002)。O'Neill等人發表在2005 年研究，四種汙染指標被研究分別是PM2.5、微粒數目、碳黑微粒、硫酸化合物，
結果發現當這些微粒濃度上升，則糖尿病病患的血管反應下降，其中PM2.5和硫酸 化合物環境濃度上升，則物理性壓迫方法血管舒張或是硝化甘油方法血管舒張能 力均下降(O'Neill et al.,2005)，Gold等人發表2000年研究指出PM2.5濃度上升對於糖 尿病患的HRV有減少的效應(Gold et al.,2000)。Seaton等人在1999年的文章指出，
空氣汙染物會造成肺部的發炎，進一步影響血液的黏滯性(viscosity)，而造成心血 管疾病(Seaton et al.,1999)。Schwartz等人發表於2001年研究，使用美國第三次全國 健康和營養調查資料庫，去比對血液中的指標和汙染物的相關性，發現血液中凝 血原(fibrinogen)、白血球數量(WBC)、血小板(platelet)這些和發炎及凝血相關的血 液因子和PM10、碳黑微粒、硫酸化合物有顯著相關性(Schwartz,2001 )。Sprager等 人研究指出第二型糖尿病患者血液中的發炎指標譬如IL-6和TNF-α有顯著的高出 正常人數值(Schwartz,2001 ; Seaton et al.,1999; Spranger et al.,2003)。因此從上述幾 篇文獻的回顧可以推敲，微粒造成的發炎反應，和糖尿病造成的發炎反應似乎產 生共伴效應，也使得受其一影響或兩者影響的易感族群在死亡率、住院率等健康 效應上較正常人有顯著的上升。
糖尿病是全世界高盛行的慢性病影響超過兩億人(Wild et al.,2004)，根據衛生 署國民營養健康狀況變遷調查研究顯示，糖尿病盛行率已達9.2％，較前一次「三
5
高調查」大幅提高近3個百分點；其中尤以65歲以上男性最為嚴重，最近三次調查 的糖尿病盛行率由13.1％、17.6％到28.5％。根據2007年統計，台灣地區每10萬人 有44.6人死於糖尿病，在十大死因中排名第四，死亡率較5年前增加了14％；其中 男性死亡率為十萬分之43.1，比5年前增加了18％；女性為十萬分之46.2，比5年前 增加了10％。健保局也公布糖尿病醫療費用支出名列第五，顯見糖尿病在台灣是 個急需關注的議題。
糖尿病併發症包括小血管(microvascular)及大血管(macrovascular)併發症。大血 管併發症包括冠狀動脈與腦血管粥狀動脈硬化(atherosclerosis)、周邊血管疾病、中 風、甚至是截肢，Creager等人2003文獻回顧提到，糖尿病會造成內皮細胞nitrogen oxide(NO)下降endothelin-1(ET-1)上升產生血管收縮無法放鬆的健康效應，此外過 高的血糖和NO下降也會引發發炎物質的產生(Creager et al.,2003)，此外組織因子和 Plasnimogin阻斷因子上升會造成血栓產生進而造成粥狀動脈硬化(Creager et al.,2003)。小血管併發症則包括視網膜病變(retinopathy)，神經病變(neuropathy)，
以及腎病變(diabetic nephropathy, DN)。糖尿病腎病變是造成末期腎病需接受腎臟 透析治療的最大原因(Zimmet et al.,2001)，台灣也因洗腎人口快速增加，造成相當 大的健保負擔，釐清微粒空氣污染與糖尿病腎病變之間的關連，並且利用他的關 連減少空氣汙染在糖尿病腎病變的修飾作用，在公共衛生上有重大意義。目前微 粒相關研究都以大血管病變為主，對於小血管病變較少探討，且小血管相較於大 血管對於糖尿病的衝擊較無抵擋能力，這也是本實驗有興趣的地方．
2-2 微粒空氣汙染與心血管、糖尿病之毒理學研究
目前微粒空氣汙染物相關毒理研究主要針對心血管和糖尿病機制，毒理研究 證據指出PM10可能會造成粥狀動脈硬化的進展，Suwa 等人發表於 2002 年研究，
先天性高血脂兔作為本實驗動物模式，組織切片觀察和白血球計數兩種方法被使
6
用，結果發現PM10暴露組的系統性多核白血球的數目上升，此外PM10暴露組也 使的粥狀性動脈硬化產生的血管損壞在觀察上更顯著，最後作者發現冠狀動脈硬 化損壞程度和肺部巨噬細胞所吞噬的PM10數量有顯著相關性(Suwa et al.,2002)。
Donaldson 等人發表於 2002 的文獻回顧中使用許多毒理證據說明微粒造成心血管 惡性健康效應可能機制，微粒或是過度金屬在吸入後產生氧化壓力，而氧化壓力 會產生兩種子效應，一是低密度脂肪酸氧化，進而產生粥狀脂肪斑塊，而這些斑 塊的剝離是造成缺血性心血管疾病的主因；二是氧化壓力產生NF-kB，進而刺激 肝臟產生CRP，CRP 也會影響粥狀脂肪斑塊的產生；除了刺激 CRP 產生，肝臟也 會在氧化壓力的影響下促進凝血現象，凝血現象容易增高血液黏滯性等，進一步 造成血管阻塞的現象；而氧化壓力也會造成發炎反應，發炎反應會造成更多的氧 化壓力，因此形成互相促進的關係(Donaldson et al.,2001)。而以上的影響最終可能 導致缺血性心臟病、惡性心室心律不整、增加血塊剝離機會、增加因急性栓塞引 起的冠心病症狀。Sirivelu 等人研究，使用卵巢白蛋白(OVAs)引發呼吸道過敏大鼠，
此大鼠暴露於濃縮大氣微粒(CAPs)，結果發現在吸入 CAPs 這組或是單卵巢白蛋白 所引發呼吸道過敏大鼠下視丘室旁核(PVN)均顯著的產生腎上腺素，甚至大鼠血漿 中的可體松也顯著上升，作者認為CAPs 影響了神經系統(Sirivelu et al.,2006)。
Gurgueira 等人研究，SD 大鼠被使用，將其暴露於 CAPs 和控制組做對照，發現暴 露組的心臟和肺臟有較高的氧化壓力(Gurgueira et al.,2002)，雷等人研究也指出，
暴露於濃縮大氣微粒之下，大鼠呼吸次數下降，潮氣量增加，在Methacholine 的 作用下，老鼠搏動產生變化，結論為在CAPs 的影響下會增加呼吸系統的過敏感度 (Lei et al.,2004)。而鄭等人研究指出大鼠暴露 CAPs 在心血管方面會造成心跳、血 壓改變(Chang et al.,2005; Cheng et al.,2003)。鄭等人研究指出，將自發性高血壓大 鼠暴露於CAPs 五小時候，大鼠的 RMSSD 從原本下降 15%變成下降 60%，此研究 證實CAPs 會改變自發性高血壓大鼠的心跳變異性(Chang et al.,2005)。Nadziejko 等人所做的動物實驗證實，在暴露CAPs 四小時後，實驗動物和暴露前的自己比較
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發現，delayed beat 有顯著的增加，結論認為 CAPs 會造成心律的異常(Nadziejko et al.,2004)，Wellenius 等人使用狗做為實驗動物，在暴露 CAPs 五小時後，發現實驗
狗缺血性心臟病情況惡化，作者認為大氣微粒是造成急性缺血性心臟病的原因之 一(Wellenius et al.,2003)。
微粒在動物毒理的研究多半是關注心血管方面的效應，然而糖尿病也是微粒 的易感受因子之一。Sun等人在2005研究中，使用ApoE基因剔除小鼠，這種先天性 基因缺陷小鼠是以C57BL/6J為背景發展的品系，此基因剔除小鼠對於體內脂肪酸 的運輸和儲存能力下降，造成過多的游離脂肪酸存在循環系統中，因此易造成粥 狀動脈硬化；暴露濃縮大氣微粒六個月後，將暴露組與過濾空氣組(filtered air)相 比，結果發現主大動脈組織切片染色暴露組都較實驗組的粥狀動脈硬化程度較 多，此外發炎反應也較劇烈，因為較多的巨噬細胞出沒；在測試主大動脈的收縮 程度也發現暴露組的收縮程度較劇烈，但放鬆程度下降，本實驗的其他結果也顯 示，暴露在PM2.5的環境下會造成主大動脈的氧化壓力上升，結論認為長期低濃度 的PM2.5微粒暴露，大動脈在某種程度，因為上皮細胞受損造成血管收縮放鬆能力 出現異常 (Sun et al., 2005)。在這個研究中，微粒加速動脈大血管壁粥狀硬化的效 應，可能可以用內皮細胞異常來解釋。過去的研究也指出，微粒會在健康成人造 成急性動脈收縮(Brook et al., 2002)。Sun等人發表在2009研究，使用C57BL/6J小鼠 動物模式，此一動物模式被認為是從事和新陳代謝相關研究較好的選擇；本研究 探討的汙染源為CAPs，將小鼠暴露24週後進行犧牲，本實驗的結果發現，實驗動 物出現全身性的胰島素阻抗現象，系統性的發炎現象，腹部脂肪肥大；此外，進 一步測量內皮細胞對於胰島素的敏感度，結果發現胰島素訊息傳遞鏈出現對胰島 素的阻抗現象(Sun et al.,2009)。
微粒對於心臟及大血管病變效應的機轉研究，目前已經受到重視。可能的機 轉包括自律神經系統，或是對心肌的直接毒性(Brook et al.,2004)。另外的假說包
8
括，微粒在易感族群引起肺部發炎，進一步造成系統性發炎，而增加心臟及大血 管病變疾病風險(Seaton et al.,1995)。原因可能是由於血液高凝固狀態，或是因為動 脈粥狀硬化斑塊的形成和不穩定(Brook et al.,2004)。然而目前微粒對於血管病變的 研究多集中在大血管，微粒對小血管病變之效應及機轉尚不清楚，我們最近的研 究發現，微粒會造成糖尿病大鼠腎臟病理的變化，值得進一步研究。本研究將比 較微粒對健康大鼠與糖尿病大鼠腎病變之效應，探討糖尿病是否對微粒相關小血 管病變具有易感性。
2-3 糖尿病之病理生理學
糖尿病的高血糖使 (1)polyol路徑強化(2)hexosamine路徑的活性增加(3)protein kinase C的活化和(4)advance glycation endproduct大量產生等四條路徑造成心血管 傷害。Polyol路徑的強化，肇因葡萄糖大量出現在循環系統中且不被儲存，造成酒 精還原脢大量使用NADPH去轉化葡萄糖為sorbital，NADPH在體內是擔任以氧化 Glutathione的還原劑，Glutathione是體內重要的還原物質如此體內的氧化壓力變無 法移除。Hexosamine路徑的增強會造成發炎物質PA-1和TGF-β的產生。PKC的活化 會造成一連串加重糖尿病事件產生如: NO下降ET-1上升，造成內皮細胞異常，
TGF-β發炎物質的產生。最後advanced glycated end products (AGE)的大量產生會造 成氧化壓力的產生，進一步產生NF-κB為發炎前驅物(Brownlee,2001)。高血糖只能 解釋部分大血管病變，研究顯示除了高血糖的影響下，胰島素阻抗也會造成大血 管病變，Hanley等人針對胰島素阻抗是否會增加罹患心血管疾病研究，透過游離脂 肪酸的釋放，跟高血糖一樣引發氧化壓力的增加，過去許多報告指出胰島素阻抗 之族群使用LDL、HDL、收縮壓、三酸甘油脂這些因子校正後，發現胰島素阻抗 為增加心血管疾病風險因子，Du等人研究中，使用細胞實驗和動物實驗證明以下 機制：游離脂肪酸會造成組織氧化壓力上升，游離脂肪酸也會造成胰島素阻抗現
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象，作用和高血糖一樣，結論為高血脂會同時導致粥狀動脈硬化甚至心臟病以及 胰島素阻抗引發第二型糖尿病(Du et al.,2006; Hanley et al.,2002)。Hannes等人所做 研究指出三點，第一點游離脂肪酸增多確實與肥胖個體有顯著相關，第二在食用 抗游離血脂藥物Enalapril (angiotensin converting enzyme inhibitor)確實可以降低 因胰島素阻抗現象而不彰的脂肪代謝現象。第三點在胰島素作用下脂肪氧化作用 被抑止的現象在肥胖個體非常明顯。另外內皮細胞上的訊息傳遞鏈失調也是造成 胰島素阻抗以及接下來糖尿病病程發展的重要原因，De Vriese等人的文獻回顧 中，提到藉由上皮細胞分泌的血管舒張素如NO以及ET-1，這些體內化學物質的異 常都會導致身體新陳代謝的異常。第二型糖尿病可能較第一型糖尿病有較高的大 血管病變風險，高血糖，游離脂肪酸以及胰島素阻抗都會在內皮細胞造成傷害，
包括氧化壓力增加，訊息傳遞的混亂以及糖化氧化基分子受體(RAGE)的活化(De Vriese et al.,2000; Hennes et al.,1996)。
糖尿病本身不會造成直接死亡率，但易伴隨其他併發症，常見造成高死亡率 之併發症為心血管疾病，而氧化壓力被認為可能是造成糖尿病發生，以及糖尿病 併發症的重要角色(Giugliano et al.,1996)。體內的高血糖、高血脂情況會導致大分 子例如蛋白質醣化和葡萄糖自動氧化(glucose auto-oxidation)及脂質過氧化(lipid peroxidation)，而這些過度的氧化會造成體內產生許多自由基，這些自由基會進一 步傷害大小血管上的上皮細胞(Baynes,1991)，而氧化壓力本身自由基的身分會去產 生更多的自由基，此外氧化壓力會使內皮功能失常，造成血管傾向收縮，另一方 面發炎反應增，會引來巨噬細胞而造成更強烈的發炎反應，加速血栓形成使得動 脈容易形成粥狀動脈硬化，而粥狀動脈硬化是造成心肌梗塞、多種腦血管疾病等 的主要病因。
高血糖和過多游離脂肪酸的釋放和胰島素阻上現象，這些造成上皮細胞產生 負面的健康效應。同時也產生氧化壓力，擾亂細胞內的訊息傳遞，和活化AGE 產
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物的受器(De Vriese et al.,2000)。氧化壓力會作用在許多器官上包括血管，造成糖 尿病發生或是心血管疾病(Giugliano et al.,1996)。氧化壓力肇因體內在產生和清除 之間失去平衡，糖尿病本身因為蛋白質的醣化現象以及過多的葡萄糖進行代謝產 生自由基，甚至進一步高糖、高脂飲食，使體內產生過多的游離脂肪酸，在代謝 過程中就產生了自由基(Baynes,1991)。這些現象都無形的增加了氧化壓力，而氧化 壓力因此去損害內皮細胞功能、導致血管收縮、增加發炎現象、增加血栓風險，
這些可能機制也同時引發粥狀動脈硬化(Bell et al.,1983)。
糖尿病患通常也同時有內皮細胞功能異常之現象，包含了過度或是過少的施 放體內所需物質，改變了膜的屏障，降低抵抗血栓產生的功能。而損壞的內皮細 胞功能導致其底下的肌肉細胞產生分化，而這樣一來血管的結構會因此而產生改 變，粥狀動脈硬化風險因此大增。
內皮細胞所施放的物質當中最重要物質為 NO，本身是血管放鬆因子，此外可 抑止血小板活動防止血栓形成，其藉著阻止巨噬細胞登入內皮細胞表面以及滲入 其底層的肌肉組織進而限制了發炎反應。不論是第一型或第二型糖尿病患者都有 內皮細胞受損和NO 施放異常的病理現象。因此 NO 的降低施放可能對粥狀動脈硬 化貢獻很大。除了NO 和他結抗的 ET-1 也會因為內皮細胞之受損而異常施放，ET-1 會造成血管收縮，除了血管收縮外他也會造成發炎，可以促使血管平滑肌收縮以 及增生。NO 降低和 ET-1 增加會導致血管收縮、肌肉增生，最後可能產生粥狀動 脈硬化。
糖尿病會產生以及增強發炎反應，發炎活性增加導致上皮細胞異常進而增高 粥狀動脈血栓形成的風險。而氧化壓力會導致和發炎相關的轉錄因子NF-κB，而 NF-κB會導致TNF-α產生，進而產生IL-6等發炎物質，此外也會產生activator protein (AP-1)而引發發炎物質，並且加強leukocyte attracting chemokines的表現。C-reactive protein (CRP)，interleukin-6 (IL-6)和tumor necrosis factor-α (TNF-α)在糖尿病患者都 會增加(Spranger et al.,2003)。
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2-4 糖尿病造成之慢性腎病變
糖尿病腎病變是西方國家中末期腎臟病的頭號原因，在台灣因為糖尿病盛行 率上升，加上醫療發達因而延長了病患的壽命，糖尿病腎病變的也越來越多，甚 至有追上慢性腎絲球腎炎，而成為末期腎臟病最主要的病因。糖尿病併發腎病變 之後，病人的死亡率遠大於未併發腎病變的病人，其中最主要的死因是心臟血管 疾病。即使是進入末期腎臟病，糖尿病病人之預後也遠比其他非糖尿病末期腎臟 病人為差。這些種種皆形成沉重的醫療與社會負擔，顧了解病預防期發生成為今 日醫學的重要課題。
糖尿病腎病變之演變，以第一型糖尿病的情形研究的較清楚，其病程的進展 較有規律性，依循時間有固定階段性的變化。至於第二型糖尿病，因確實發病時 間常無法確定且病患本身常有許多其他病症，糖尿病神病變的病程研究就相對的 匱乏。不過一班的看法認為第一型與第二型糖尿病腎病變的變化進程大致是類似 的。以第一型糖尿病為例，腎病變分為以下五個階段：
第一階段，糖尿病剛發病時，此時腎絲球過濾率(GFR)較同年齡正常人上升 20-40%，腎臟血流(renal plasma flow)上升9-14%，這就是所謂的高過濾現象 (hyperfiltration)。在顯微構造下，可發現腎絲球肥厚(hypertrophy)、腎小管及間質 (interstitium)增生，腎臟體積變大。此時變化均為可逆，若控制好血糖可讓上述變 化回復至正常。
第二階段，對第一型糖尿病而言，發病一年半至兩年半後幾乎所有病人均進 入此一階段。生理變化同上，檢測尿液中白蛋白含量也正常(<30mg/day)，但在病 理上已出現腎絲球基底膜變厚及間質(mesengium)增加之變化，一般此階段維持約 5-15年。在此階段，控制好血糖仍可讓高過濾現象(hyperfiltration)改善，避免腎功
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能進一步惡化。
第三階段，此階段稱為微量蛋白尿(microalbuminuria)階段，尿中白蛋白為 30-300mg/24hr，此時用一般的驗尿試紙檢測仍為陰性反應，唯有收集尿液做定量 分析分能得之。之前所述的病理變化持續加重，一般進行至此階段，糖尿病已有6 至15年以上病史。
第四階段，此階段稱為明確腎病變(overt nephropathy)階段，用一般驗尿試紙 即可檢出蛋白尿，此時的尿中白蛋白大於300mg/24hr(相當於尿中總蛋白量
500mg/24hr)。進行至此階段，糖尿病已有15至18年之病史。由此階段起，腎絲球 過濾率(GFR)約以每年10ml/min之速度下降。
第五階段，末期腎病變(end stage renal disease)。第四階段經過七年或糖尿病發 病25 年以上，即進入末期腎臟病而需要透析治療。
2-5 腎功能異常指標
Microalbumin
尿液中的蛋白質包括以下幾種：白蛋白(albumin)，大約有 20％；其它的成分 還有亨利氏管上皮細胞所分泌的Tamm-Horsfall mucoprotein 和一些免疫球蛋白輕 鏈(immunoglobulin light chain)及 β2-microglobulin 所組成。
腎絲球的過濾增加主要是因為腎絲球的通透性(permeability)改變所造成的。正 常的腎絲球血管屏障會限制分子量較大的陰離子像albumin 的濾過。物質要通過腎 絲球血管屏障主要取決於過濾物的size 和 charge 來決定。高血糖及腎絲球腎炎會 造成large pores 的數目上升及腎絲球血管屏障上的 heparan sulfate (charge barrier 的 主要成分，是一種polyanion)減少，而造成通透性的改變，在這樣的改變之下，白 蛋白就會藉由腎絲球體進入腎小管，因此就可以在患者的尿液中測得不正常濃度
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的白蛋白。
β2-microglobulin
正常情況下，一些較小的蛋白質像 β2-microglobulin，免疫球蛋白輕鏈及氨基 酸會通過腎絲球血管屏障。這些物質會在近端腎小管被重吸收。在腎小管疾病與 腎臟間質性疾病時，重吸收會出現障礙，而造成蛋白質的流失。這一類的蛋白質 流失量會比腎絲球過濾率增加所造成的蛋白尿輕微。
Creatinine clearance (Ccr)
Ccr 此試驗廣泛地被用來當作是替代評估腎小球過濾率(GFR)的方法，理論 上，此試驗的結果是可信賴的，但常常會因為尿液的收集不完全而影響到結果。
肌氨酸酐清除率的計算是藉由測量尿中肌氨酸酐的濃度(Ucr[mg/dL])、血漿或血清 中肌氨酸干的濃度(Pcr [mg/dL])，和尿流量的速率(V[ml/dL])，增加的情況發生於：
高心輸出量、運動、肢端肥大症、糖尿病(早期)、感染、甲狀腺功能低下症。降低 的情況發生於：急性或慢性腎衰竭、腎血流量降低(休克、出血、脫水、充血性心 臟衰竭)。
KIM-1
腎臟受損分子在健康腎臟是偵測不到，他本身是跨膜蛋白質，在細胞受損時 會釋出，在近端腎小管產生毒害或是缺氧時，這個蛋白質就會釋出於尿液中，他 被認為是早期腎小管產生傷害所代表的生理指標。
Smad 1
Smad 1 是 collagen 4 的轉錄因子，當腎絲球體發生病變時，便發大量產生，進 而去控制collagen 4 的轉錄、轉譯造成基底膜的增厚，被認為是一個新興的腎功能 指標可以更精確預測第一階段和第二階段的腎病變(Toshio Doi 2008)。
2-6 第一型糖尿病疾病動物模式
Strepzotocin 是土壤微生物 Streptomyces Achromogenes 的代謝物，於 1963 年第
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一次使用於糖尿病之動物毒理研究(Bell et al.,1983)。Streptozotocin 會直接作用在胰 島組織的beta 細胞上產生毒害，主要的功能：結構類似葡萄糖，會替代葡萄糖接 應到胰島組織表面的Beta 細胞的細胞膜，使 Beta 細胞無法傳遞分泌胰島素的訊 息，此外此毒素會破壞Beta 細胞的細胞膜造成其功能喪失，Bell 等人關於糖尿病 大鼠動物模式建議施打STZ 劑量為 65mg/kg body weight，然後約莫維持 6 個星期，
模式生物的血糖即有恢復現象，使用Streptozotocin 誘發之糖尿病大鼠被發現 Glutathione 在紅血球細胞和胰島細胞數量減少現象，他也同時抑止了 SOD，此活 性脢為清除體內自由基，在施打高劑量的Streptozotocin 的 10-12 小時之後，大鼠 體內的血糖會升高，緊接著大鼠的血糖會維持在300mg/dL 或是更高，但血糖會在 六個月後下降，研究也發現在施打Streptozotocin 十二周後，大鼠的血壓和心律會 有顯著下降。這個動物模式已經被使用在各種糖尿病病理之研究並且行之數年。
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三、研究方法
3-1 實驗設計流程
SD rats (n=52)
Healthy rats (n=16) Diabetes rats (n=35)
Filtered air(n=8) Whole air(n=8) Filtered air(n=17) Whole air(n=18) Renal functions
*Albumin creatinine ratio (ACR)
*Urine 24hr albumin
*Creatinine clearance Blood cell info
*CBC/DC Inflammation and
oxidative stress
*8-OHdG
*IL-6
*TNF- α Diabetes indicator
*Body weight
*Blood glucose
*Blood insulin
*HbA1c
*Fasted 24hr water drinking amount
*24hr urine volume
Biological indicators
*GPT/ GOT
*Lipid profile
*Plasma albumin
*Plasma BUN
*Plasma creatinine
Vascular indicators
*NO
購入大鼠 STZ施打
一週
開始暴露
五週 四週 四週 四週
採集檢體 採集檢體
採集檢體
13thand 16thweek 犧牲
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3-2 實驗動物
3-2-1 實驗動物飼養條件
本實驗嚴格控制之溫度(20±2℃）、溼度、通風及12小時光照週期切換，充分供 給乾淨之飼料及飲水，每日換墊料及清理排泄物，並每日檢視動物外觀皮毛，行 為及活動，測量體重，實驗須收集尿液時改換置於專用代謝籠，並記錄其尿量。
3-2-2 第一型糖尿病大鼠誘發
第一型糖尿病大鼠，使用7週大雄性Sprague-Dawley (SD rats)大鼠(樂斯科生物 科技股份有限公司)，在大鼠8週大時，靜脈注射55mg/kg-body weight劑量的 Streptozotocin(STZ, Sigma, St Louis, MO, USA)，將大鼠誘導成第一型糖尿病大鼠動 物，於暴露前一周監測血糖，血糖高於300mg/dL為誘導成功。40隻糖尿病大鼠於 施打STZ後有4隻死亡，1隻於暴露後第11週死亡，1隻未達標準遭淘汰，失敗率為 15%。
3-3 測量方法
3-3-1 常規測量
大鼠在暴露前以及之後的奇數週均有測量其體重變化，此外每次收集尿液同 時均統計其飲水量以及尿液量。每組動物均於暴露前，開始暴露後第4，8，12，
16周，分別置於由專用代謝籠中，經禁食但飲水不受限制的清醒情況下，收取24
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小時尿液，所收得的尿液檢體於2500rpm離心十分鐘去除雜質後，進行以下分析。
取5ml尿液，利用全自動分析儀，進行尿液常規檢查(Urine routine)。尿液常規檢測 包含尿液白蛋白和尿液肌肝酸，尿中白蛋白肌酐酸比值(ACR)即為上述二者之比 值。而此外我們將尿中白蛋白濃度乘上總尿液量得到尿中白蛋待24小時內總白蛋 白量。在尿液收集完畢後，由實驗大鼠尾部採血，使用羅氏快速血糖儀測空腹血 糖值(Accu-Check；Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)。
3-3-2 大鼠犧牲、抽血、臟器組織處理
本實驗是選擇暴露結束的時間點是根據大鼠的健康狀況決定，體重過度減輕、
以及表現出外表可視之痛苦狀態，即結束我們的暴露實驗，暴露終止時間是定在 16週，但在13週時有部分老鼠體重過輕，本實驗室擔心因此會產生死亡率因此在 13週為亞慢性實驗的最低需求時間點犧牲一批，我們在這個時間點選擇體重過輕 的糖尿病大鼠16隻(暴露組8隻，控制組8隻)以及做對照的健康大鼠4隻(暴露組2 隻，控制組2隻)，而剩下之大鼠則在計畫的16週這個時間點進行犧牲，會選擇16 週乃是考慮到大鼠體重過輕可能會造成死亡率。暴露結束後馬上以腹腔方式給予 大鼠55mg/kg劑量pentobarbital，待昏迷後剪開其腹腔，抽腹主動脈血液，2ml置於 含有EDTA的採血管中送至台大動物中心測CBC/DC(Medonic CA620, Sweden)，剩 餘一半血液樣本未含EDTA採血管在4 ºC靜置兩小時後，3500rpm離心10分鐘，取上 清液冰入-80℃冰箱中此為血清部分。另一半血液樣本放入含有EDTA採血管當充分 搖晃均勻，避免凝血現象，一樣3500rpm離心10分鐘，取上清液此為血漿，取血漿 送至台大實驗動物中心實驗室，使用乾式生化儀分析血液中Creatinine、GPT/GOT、
BUN、creatinine、albumin、glucose、lipid profile (Arkray SP4410, Japan)。其餘血 漿和血清以200μl為單位分裝於eppendorf中並保存於-80 ºC冰箱中。Fibrinogen使用 專門採血管採血，送至嘉義基督教醫院檢驗科進行分析。HbA1c送至國泰醫院檢驗
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科生化組進行檢測，使用HPLC高效率液相層析儀去檢測(Bio-Rad, USA)HbA1c。
其他IL-6(R&D, USA)、TNF-α(R&D, USA)、NO(R&D, USA)和Insulin(Mercodia, USA) 利用血清以及ELISA去定量分析。此外檢測尿中8-OHdG送至吳焜裕老師實驗室協 助分析，使用UPLC-MS/MS(Thermo TSQ Quantum Access,USA)
乾式生化儀其原理乃是利用試紙吸附樣本，再透過不同波長的可見光去照射 試紙，利用不同受測物質在試紙上光吸收的程度不同，去分析待測物質的濃度。
高效率層析分離法(HPLC)是分析化學中極重要的一種分析方法，主要是藉由流動 相將待測樣品帶入層析分離管，再藉由樣品中各個成分與分離管中的填充物表面 的靜止相之親和力或作用力的不同，而依序先後流出分離管，此時，若連接一適 當的偵測器，則每一成分在流出分離管後流經偵測器時，都可分別得到一偵測信 號。由每一信號出現的時間(即滯留時間)之不同，可做為定性判定是何種成分物之 依據，而信號的大小則可做為定量測定含量之依據。酵素連結免疫吸附分
（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），可以測定抗原或抗體。酵素連結免 疫吸附法( enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA )的原理是依據螢光抗體方法 發展出來的，它是將酵素連接到抗原或抗體分子上來偵測抗原抗體反應，最後加 上酵素的受質，依其呈色強弱來表示。
組織和器官於採血後即剪下，用PBS浸洗，以下方式儲存：
器官 處理 器官 處理
腎臟 福馬林 冰上 電顯液 -80
℃
肺臟 福馬林 冰上 -80℃
心臟 福馬林 冰上 電顯液 -80
℃
肝臟 福馬林 冰上 -80℃
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腹主動脈 福馬林 冰上 電顯液 -80
℃
大腸 -80℃
眼球 福馬林 -80℃ 肌肉 福馬林 冰上 -80℃
大腦 福馬林 冰上 -80℃ 睪丸 福馬林 -80℃
檢體的部分有四種處理方式，依照儲存方式將檢體等分，一部分放入福馬林作之 後組織包埋使用，一部分放置冰上做冷凍包埋使用，以及泡入電顯液做電顯用切 片，最後部分放入-80℃冰箱中。
3-4 微粒暴露和監測
本研究使用 IVC 系統(Individually ventilated cage system; Tecniplast Inc., Exton, PA)，執行大氣微粒之動物暴露實驗，可直接將大氣及其微粒(Whole air, WA)引入 暴露腔中供實驗動物吸入(Inhalation study)。IVC 系統設置於台灣大學公衛學院九 樓暴露實驗室，由窗邊直接引入大氣，經過一條引流管(口徑 10 公分、長度 7.5 公 尺)後進入空氣處理器，處理器出口端分支成四條獨立的不鏽鋼導管，大氣最終經 由這些不鏽鋼導管進入各暴露腔中。對照組暴露腔的入口空氣閥前端加裝高效能 濾網(High-Efficiency Particulate Air, HEPA)過濾裝置，以濾除大氣中之空氣微粒汙 染物，使對照組大鼠呼吸的為過濾空氣(Filtered air, FA)。空氣處理單元將大氣總抽 氣流量控制在79±1 m3/h 範圍內，同時監測各暴露腔的氣流流量，各暴露腔入口端 的空氣閥(Air valve)調控腔內空氣擴散呈穩定低速(< 0.15 m/s)狀態。
動物暴露期間，暴露腔將使用微粒濃度監測器(model 1.108; Grimm
Labortechnik Ltd., Ainring, Germany)進行質量濃度連續監測。本實驗將一台微粒監
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測器放入隨機選取的一個暴露腔中，監測器每一分鐘紀錄一筆微粒平均濃度值，
微粒粒徑監測範圍為＜10、＜2.5 及＜1 μm 三種粒徑(PM10、PM2.5及PM1.0)。而監 測時間由2009 年 12 月 21 日到 2010 年 4 月 9 日共 16 週，該微粒監測器可同時進 行濾紙採樣，所收集之濾紙樣本將進行微粒成分分析。除此之外我們也使用公衛 大樓四周鄰近的三個測站(古亭、萬華、中山)，將這些測站在 2009 年 12 月 21 日 到2010 年 4 月 9 日共 16 週的 PM10和PM2.5濃度資料平均起來，得到一平均值代 表環境微粒濃度資料。
3-5 統計方法
本研究以SPSS 17.0 for window evaluation version 版統計軟體，進行暴露組與 控制組，和健康大鼠及糖尿病大鼠在各項生理指標、腎功能指標、發炎指標的分 析，實驗數據以平均值加減標準差（mean ± SE）表示。不同組間(控制組與暴露組 以及糖尿病組與健康組)使用 Mann-Whytney test 檢定，同一組不同時間點使用 Wincoxon matched paired test 檢定，此兩種檢定均為無母數統計檢定，無母數統計 針對樣本數目小且不符合常態分布的族群所使用，P-value＜0.05 視為有統計上顯 著差異。
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四、結果
4-1 暴露資料
本次暴露時程為 2009/12/22 至 2010/4/9 共計 16 週，本次實驗暴露資料如下：
PM10為13.68±11.76 μg/m3, PM2.5是13.65±11.75 μg/m3 而 PM1為12.99±11.15 μg/m3。
4-2 體重
健康大鼠控制組和暴露組在暴露大氣微粒前測重分別為 424.4±28g 和 408.1±29.1g，在經過 13 週後體重變為 540±30g 和 577.5±43.8g，體重顯著增加 (P<0.01)。糖尿病大鼠控制組和暴露組在暴露大氣微粒前測重分別為 269.2±34.3g 和264.4±31.8g，在經過 13 週後體重變為 300.0±45.6g 和 292.5±35.6g 顯著的增加 (p<0.05)。健康大鼠的控制組和暴露組在整個實驗過程中體重變化都沒有差異，糖 尿病大鼠也是一樣，然而健康大鼠和糖尿病大鼠體重間有顯著差異(P<0.01)(圖 1)。
4-3 24-hr飲水量
本次實驗每四個禮拜收集尿液時會測量一次大鼠的飲水量，此喝水量是在禁 食情況下測量。健康大鼠控制組在第四週測量的飲水量16.8±10.0ml 到了第十二週 降至7.9±4.5ml，健康大鼠暴露組在第四週飲水量為 20.4±2.3ml 至第十二週降至 5.3±4.7ml。糖尿病大鼠控制組在第四週飲水量為 14.1±8.7ml 到第十二週升至 20.2±8.6ml，糖尿病大鼠暴露組第四週為 17.7±12.5ml 至第十二週升至
30.2±18.8ml。健康大鼠飲水量和糖尿病大鼠飲水量每周各組間沒有差異，健康大 鼠控制組和暴露組之間沒有差異，糖尿病大鼠於第十二週飲水量暴露組高於控制 組且具有統計上差異(P<0.05)，第四和第八周沒有差異性(圖 3,表 2)。
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4-4 血糖
健康大鼠控制組和暴露組於第四週為 93.0±5.4mg/dL 和 96.4±15.6mg/dL，到了 第十二週則為95.1±6.1mg/dL 和 93.0±7.8mg/dL，前後週沒有變化。糖尿病大鼠控 制組和暴露組於第四週為436.3±73.8mg/dL 和 432.0±65.0mg/dL 至第十二週為 391.1±80.7mg/dL 和 359.6±82.5mg/dL。控制組和暴露組於第四週和第十二週比較，
血糖均顯著的下降(P<0.05)。健康大鼠和糖尿病大鼠各週各組比較，糖尿病各組較 健康大鼠各組血糖有顯著的差異，而健康大鼠或糖尿病大鼠暴露組或控制組彼此 比較則沒有差異性(圖 4,表 3)。
4-5 24-hr尿量
健康大鼠控制組和暴露組 24-hr 尿量在暴露前分別為 27.3±14.8ml 和
19.4±7.4ml，在第十二週分別為 17.8±11.6ml 和 17.6±2.8ml，有減少的趨勢但沒有 統計上的顯著。糖尿病大鼠控制和暴露組暴露前分別為40.5±11.1ml 和
38.9±17.7ml，糖尿病大鼠在實驗前和第十二週尿液量都沒有差異。健康大鼠和糖 尿病大鼠相較尿液有顯著性的較少(P<0.1)(圖 5,表 4)。
4-6 Albumin creatinine ratio (ACR)
健康大鼠控制組和暴露組白蛋白肌酐酸比值(ACR)變化在暴露前分別為 16.2±10.0mg/g 和 11.2±2.7mg/g，在經過十二個禮拜後白蛋白肌酐酸比值(ACR)變為 46.4±56.8mg/g 和 32.9±30.0mg/g，有增加的趨勢，控制組沒有顯著上改變，暴露組 有顯著上改變(p<0.05)。糖尿病大鼠控制組和暴露組暴露前測量值為
109.3±173.0mg/g 和 79.1±80.9mg/g，經過十二周後糖尿病大鼠控制組和暴露組測量 值為169.0±120.2mg/g 和 267.7±433.2mg/g，兩組均有增加趨勢且均具有統計上的 顯著(P<0.05)。健康大鼠控制組和暴露組相互比較，在各週的測量值都沒有差異
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性，而糖尿病大鼠控制組和暴露組在各週的測量值，暴露組有高於控制組趨勢但 為達統計上顯著。而糖尿病大鼠兩組測量值均高於健康大鼠測量值且達統計上顯 著(P<0.05)(圖 6,表 5)。
4-7 24-hr total albumin
健康大鼠控制組和暴露組變化在暴露前分別為 2.1±1.8mg/day 和
1.1±0.3mg/day，在經過十二個禮拜後變為 9.2±12.5mg/day 和 4.9±3.9mg/day，有增 加的趨勢，控制組沒有顯著上改變，暴露組有顯著上改變(p<0.05)。糖尿病大鼠控 制組和暴露組暴露前測量值為5.3±5.5mg/day 和 4.4±2.5mg/day，經過十二周後糖尿 病大鼠控制組和暴露組測量值為8.1±5.3mg/day 和 13.5±20.4mg/day，兩組均有增加 趨勢且均具有統計上的顯著(P<0.05)。健康大鼠控制組和暴露組相互比較，在各週 的測量值都沒有差異性，而糖尿病大鼠控制組和暴露組在各週的測量值，暴露組 有高於控制組趨勢但未達統計上顯著。而糖尿病大鼠兩組測量值均高於健康大鼠 測量值且達統計上顯著(P<0.05)(圖 7,表 6)。
4-8 Cell blood count/ differentiated cell (CBC/DC)
CBC/DC 分成四大部分，紅血球、血小板、血紅蛋白和白血球。紅血球部分(圖 8,表 7)，在數量濃度上糖尿病控制組和暴露組均低於健康大鼠控制組和暴露組且達 到統計上顯著(7.8±0.7 vs. 8.3±4.5 106/mm3 and 7.7±0.8 vs. 8.3±4.3 106/mm3,
p<0.05)。但是健康大鼠控制組和暴露組比較沒有統計上顯著差異，同樣情況也在 糖尿病大鼠上觀察到。平均血球容積(MCV)顯示，糖尿病大鼠控制組和健康大鼠 控制組之間有顯著差異(51.0±2.2 vs. 48.9±26.2μm3,p<0.05)，但是糖尿病暴露組和 健康大鼠暴露組之間沒有顯著差異。健康大鼠控制組和暴露組之間也沒有顯著差 異，這樣的情況在糖尿病大鼠上面也是一樣。在紅血球寬度(RDW)指標中，糖尿 病大鼠控制組和健康大鼠控制組有顯著差異(37.8±2.5 vs. 34.5±18.5μm3,p<0.05)，但
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是這樣的現象在糖尿病暴露組以及控制組間沒有看到，不論健康大鼠或是糖尿病 大鼠在其暴露組和控制組之間都沒有看到差異性。紅血球血容比(HCT)為紅血球佔 總血液的體積百分比，若是短少代表貧血，本實驗中糖尿病大鼠暴露組和健康大 鼠暴露組有顯著的差異(40.0±3.7 vs. 40.7±21.8,p<0.05)，在糖尿病控制組和健康大 鼠控制組沒有看到差異性。不論健康大鼠或糖尿病大鼠在暴露組和控制組之間均 沒有差異性。血紅蛋白在糖尿病暴露組以及健康大鼠暴露組之間有顯著較低 (13.8±1.0 vs. 15.2±7.9 g/dl)，在健康大鼠控制組和糖尿病大鼠控制組之間沒有差異 性，健康大鼠和糖尿病大鼠之間無論控制組或是暴露組沒有差異性。血紅蛋白的 大小(MCH)四組均沒有差異性。平均血紅蛋白濃度(MCHC)在四組也沒有差異性。
第二部分是血小板部分(圖 9,表 8)，血小板總數糖尿病大鼠無論在控制組或是 暴露組均顯著低於健康大鼠控制組和暴露組(662.1±179.6 vs. 868.0±466.9 103/mm3 and 683.7±163.6 vs. 881.3±457.3 103/mm3, p<0.05)，而健康大鼠和糖尿病大鼠暴露組 和控制組之間沒有差異性。血小板平均體積(MPV)，糖尿病大鼠控制組和暴露組，
健康大鼠控制組和暴露組四組之間沒有差異性。血小板的大小分布(PDW)也是同平 均血板容積四組之間沒有差異性。大血小板也是同MPV 以及 PDW 四組之間並無 差異。血小板血容百分比(PCT)糖尿病大鼠無論在控制組或是暴露組均顯著低於健 康大鼠控制組和暴露組(0.5±0.1 vs. 0.6±0.3 % and 0.5±0.1 vs. 0.6±0.3 %, p<0.05)，而 健康大鼠和糖尿病大鼠暴露組和控制組之間沒有差異性。
第三部分是血紅蛋白(圖 10,表 9)，其中血紅蛋白重量濃度糖尿病暴露組顯著高 於健康大鼠暴露組(13.5±1.3 g/dL vs. 15.2±7.9 g/dL, p<0.05)，其他分組未有差異 性，此外糖化血紅色素糖尿病控制組顯著高於健康控制組(5.7±2.4 % vs.
2.5±1.3%,p<0.05)，此外糖尿病大鼠暴露組顯著高於糖尿病大鼠控制組(7.4±3.1% vs.
5.7±2.4%,p<0.05)。
第四部分是白血球部分(圖 11,表 10)，白血球總數糖尿病大鼠無論控制組或是 暴露組均低於健康大鼠(3.3±2.2 vs. 4.0±2.4 103/mm3and 2.3±1.5 vs. 3.0±1.8 103/mm3)
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在其他組之間均沒有差異。淋巴球細胞百分比(LYMF%)糖尿病大鼠無論是控制組 或是暴露組均低於健康大鼠(49.1±21.2 vs. 63.0±35.1% and 46.1±20.4 vs.
59.9±34.4%)，但在健康大鼠和糖尿病大鼠控制組和暴露組之間沒有顯著差異。顆 粒性白血球比例(GRAN%)糖尿病控制組和暴露組均高於健康大鼠(41.1±19.8 vs.
30.0%±18.0 and 42.3±19.2 vs. 31.2±20.0%)，但是健康大鼠控制組和暴露組之間沒有 差異，糖尿病大鼠兩組之間也沒有差異。其餘白血球種類比例(MID%)糖尿病控制 組和暴露組較健康大鼠控制組和暴露組比例顯著較高(9.8±3.6 vs. 7.1±4.2% and 11.5±4.4 vs. 8.9±5.7%)，但糖尿病大鼠控制組和暴露組之間以及健康大鼠控制組和 暴露組之間沒有差異。
4-9 Biochemical markers
肝功能指標中(圖 12,表 11)，GPT 糖尿病大鼠控制組高於健康大鼠控制組，同 樣的情況再糖尿病大鼠暴露組和健康大鼠暴露組上看到(129.6±79.1 vs. 44.4±13.4 IU/L and 119.0±47.7 vs. 39.7±11.8 IU/L) 。健康大鼠控制組和暴露組之間沒有差 異，糖尿病大鼠同健康大鼠。GOT 糖尿病大鼠暴露組高於健康大鼠暴露組
(160.5±71.8 vs. 68.0±25.4 IU/L, p<0.05)，這樣的現象在糖尿病控制組和健康控制組 沒有看到，此外健康大鼠暴露和控制組之間沒有差異，並且糖尿病大鼠暴露和控 制組之間沒有差異。
血液中的尿氮(BUN)，糖尿病控制組顯著高於健康控制組(32.6±15.9 vs.
10.2±4.6 mg/dL, p<0.05)，這樣的現象也出現在糖尿病暴露組和健康暴露組上 (31.4±14.9 vs. 10.2±4.6 mg/dL,p<0.05)，而其中健康大鼠暴露組高於健康控制組 (14.0±5.8 vs. 10.2±4.6, p<0.05)，在其他的糖尿病控制組與暴露組間沒有差異。血液 中的肌酐酸(Crea)僅在糖尿病控制組高於健康控制組(1.6±0.5 vs. 1.0±0.3 mg/dL)，但 這樣的現象不見於糖尿病暴露組和健康暴露組，而另一方面健康大鼠控制組和暴
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露組之間以及糖尿病控制組和暴露組之間均沒有差異。
血糖部分，糖尿病組均高於健康組：糖尿病控制組高於健康控制組(668.8±117.0 vs. 170.3±41.6 mg/dL, p<0.05)，在糖尿病暴露組和健康暴露組(670.8±125.1 vs.
174.9±29.1 mg/dL, p<0.05)，在健康大鼠控制和暴露組間就沒有差異，同樣情況再 糖尿病控制和暴露組間也沒有差異。
脂質資料分成四個部分，第一部分總膽固醇(T-cho)，糖尿病控制組高於健康 控制組(106.2±33.5 vs. 58.3±11.8 mg/dL, p<0.05)，糖尿病暴露組顯著高於健康暴露 組(111.6±44.3 vs. 57.1±7.1 mg/dL, p<0.05)，健康大鼠控制組與暴露組間沒有差異，
糖尿病大鼠控制組與暴露組間沒有差異。第二部分為三酸甘油脂(TG)，糖尿病控 制組高於健康控制組(257.1±96.1 vs. 29.3±20.9 mg/dL, p<0.05)，糖尿病暴露組高於 健康暴露組(235.6±74.9 vs. 62.3±25.3 mg/dL, p<0.05)，健康暴露組高於健康控制組 (62.3±25.3 vs. 29.3±20.9 mg/dL, p<0.05)，但在糖尿病大鼠暴露組和控制組間沒有差 異性。第三部分是高密度脂蛋白，糖尿病控制組和健康大鼠控制組沒有差異性，
且健康暴露組和控制組間以及糖尿病暴露組和控制組間也沒有差異性。
在代表腎功能的肌酐酸過濾率(Ccr)，糖尿病大鼠控制組低於健康大鼠控制組 (0.3±0.2 vs. 1.4±0.6 ml/min, p<0.05)，糖尿病大鼠暴露組顯著低於健康大鼠暴露組 (0.3±0.2 vs. 1.2±0.7 ml/min, p<0.05)，但在健康大鼠暴露組與控制組間以及糖尿病大 鼠暴露組與控制組間沒有顯著差異。 本次在氧化壓力和發炎反應部分(表 12)，氧 化壓力即8-OHdG 我們發現糖尿病大鼠較健康大鼠高，但在暴露組和控制組之間 沒有差異。其他發炎反應各組均沒有差異性。
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五、討論
健康 SD 大鼠在施打 STZ 一週後，成功誘發成為第一型糖尿病大鼠，其血糖 濃度均高過300mg/dL。而將此大鼠進行為期 16 週大氣微粒暴露實驗，最終發現糖 尿病暴露組HbA1c 顯著高於控制組。
Shen 等人研究使用此一建議劑量施打，維持八週所造成之死亡率約 27%，此 實驗對於糖尿病誘發成功之定義為血糖超過16.7mmol/l 約 300mg/dL(Shen et al.,2009)，Hartner 等人研究使用更高的劑量 70mg/kg body weight，其對糖尿病誘
發成功的定義為血糖值超過250mg/dL，其實驗維持到 16 週時死亡率約為
50%(Hartner et al.,2007)。本實驗雖使用較低劑量 55mg/kg body weight 但是對於糖 尿病誘發成功定義為血糖值超過300mg/dL，因此經過 16 週的暴露期總死亡率為 12.5%，可以斷定 STZ 施打劑量越高所伴隨的死亡率越高，因此本次實驗證實不需 施打如此高之際量也可以得到高血糖的動物模式，降低死亡率以及延長實驗時 間，為本實驗優於其他實驗之處。
探討糖尿病大鼠動物模式是否建立成功，從三個指標探討，一是體重，二是 血糖，三是胰島素。體重的部分可以從本實驗數據看到糖尿病大鼠組顯著低於健 康大鼠組，驗證第一型糖尿病因為沒有辦法儲存糖分導致體重減輕。而無法儲存 血糖的原因是因為胰島素的分泌不足，本實驗數據顯示在未禁食的情況下第一型 糖尿病大鼠胰島素仍然顯著低於健康大鼠，而進一步造成血液中有過量的葡萄糖 游離，本實驗中也驗證糖尿病大鼠的血糖遠高於健康大鼠。糖尿病大鼠是否建立 成功最直接是觀察其血糖值，大部分文章都定250mg/dL 血糖值做為誘發糖尿病成 功的標準(Shen et al.,2009)，也有部分文章定 300mg/dL 血糖值做為標準(Hartner et al.,2007)，本實驗於施打 STZ 後有 5 隻死亡，1 隻未通過 300mg/dL 因此排除實驗。
這樣的高血糖肇因低胰島素分泌的因素，從實驗數據可以觀察到胰島素分泌糖尿
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病大鼠其分泌量為一般健康大鼠的20%，推斷其分泌胰島素的功能喪失八成，如 此低的分泌量也造成高血糖的產生。異常的新陳代謝也造成體重的異常，Shen 等 人的研究發現健康大鼠會隨著時間增重，但糖尿病大鼠在過了八週體重沒有大幅 的上升(Shen et al.,2009)，這樣的狀況也在本實驗看到，在 Hertner 等人的實驗中也 看到，其中Hertner 等人認為是 STZ 造成大鼠體重不增加的原因(Hartner et
al.,2007)。此外糖尿病個體顯著特徵是三多：吃多喝多尿多在本實驗都有觀察到，
在吃多的部分我們沒有量化的數據，但在尿多部分我們觀察到糖尿病大鼠控制組 在十二週顯著高於健康控制組(39.7±11.6 vs. 17.8±11.6ml,p<0.05)，這樣的現象也可 以在暴露組看到。且在糖尿病大鼠這組有增大的趨勢，認為在糖尿病的病情有惡 化的趨勢。喝多部分，糖尿病大鼠的喝水量在十二周時較健康大鼠來的大量 (20.1±±8.3 vs. 7.9±4.5ml,p<0.05)。大量喝水可能原因為因為體內無法留住血糖，大 量進食導致的口渴所致。
針對糖尿病腎病變之研究，因此從觀察尿中白蛋白來去判斷糖尿病腎病變之 程度。糖尿病透過高血糖導致的高氧化壓力造成對大小血管產生健康效應，其中 小血管的併發症是值得關注，通常在較嚴重的CVD 產生之前都是小血管的病變，
例如：視網脈病變、神經病變、腎病變。而高血糖透過氧化壓力增加腎臟上面的 基質(mesengial matrix)增厚，或是破壞腎臟上面的足細胞以及改變腎臟的通透性，
進而使腎過濾能力下降甚至無尿，這些都和腎臟功能相關(Brownlee,2001)。在腎臟 功能的指標主要有兩項一是腎過濾率，本實驗使用非侵入性的肌酐酸清除率(Ccr) 代替，結果看到糖尿病大鼠的腎過濾率有顯著下降。另一個指標是尿中白蛋白，
尿中白蛋白有兩種算法一種是將尿中白蛋白以尿中肌酐酸校正為白蛋白肌酐酸比 值(ACR)，部份的研究使用此一方法做為其判定糖尿病腎病變嚴重程度之依據，本 實驗糖尿病大鼠其白蛋白肌酐酸比值(ACR)從暴露第 0 週開始即顯著高於控制 組，且隨著時間白蛋白肌酐酸比值(ACR)增高。Hertner 等人所做的研究施打 STZ 70mg/kg body weight 於健康大鼠，於第五周犧牲大鼠，其第五周的糖尿病大鼠之
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白蛋白肌酐酸比值(ACR) (約 1g/g)高於本實驗(約 0.1g/g)，可能原因為其施打高劑 量STZ 導致胰島 beta 細胞破壞更多，進而使血糖在第五周高於本實驗同週數值，
其平均約多出本實驗100mg/dL 因此推斷多出之高血糖造成腎臟功能更加的惡化 (Hartner et al.,2007)。
另一種表達腎病變程度的指標為蒐集 24 小時老鼠尿液，測其中的 24 小時總 白蛋白量，Mima 等人將 SD 大鼠施打 STZ 55mg/kg body weight 約四週後犧牲，並 測量其尿液中總白蛋白其值和本實驗相仿，此實驗並沒有測量大鼠的血糖變化而 是以其HbA1c 表示，HbA1c 是一個代表近三個月內體內血糖變化的指標，也和本 實驗相仿(Mima et al.,2006)。可以推測 STZ 的多寡和血糖高低有相關性且會影響到 腎功能。
在肝功能的部分，糖尿病大鼠的 GPT 和 GOT 都高於健康大鼠，(140.1±104.0 vs.
44.4±13.4IU/L,p<0.05 and 204.6±165.3 vs. 105.3±52.8IU/L)，GPT/GOT 參與體內的 糖質新生作用，Mori 等人推測由於肝臟的肝醣儲存量消失導致 GPT/GOT 為了要 補償而大量轉譯(Mori et al.,2003)。Salimuddin 等人從事實驗證實，若是 Insulin 的 治療可以讓GPT/GOT 恢復正常，證實異常的新陳代謝會導致肝功能指數上升 (Salimuddin et al.,1996) 。但也有科學家認為肝功能指數的增加和 STZ 引發的肝臟 發炎相關(Jeong et al.,2010)，由於本實驗沒有對肝臟發炎作進一步研究所以這方面 機制仍不清楚。因此可以推斷本實驗符合其他實驗的結果。
血球資料部分，紅血球的總數糖尿病大鼠較健康大鼠低(7.9±0.7 vs.
8.3±4.5106/mm3)，可能和血球製造量不足有關，但機制仍然不清楚。同樣的現象在 血小板也看到。白血球部分，淋巴球數量濃度糖尿病大鼠顯著低於健康大鼠(1.7±1.1 vs. 2.6±1.8 103/mm3,p<0.05)，根據 Tabata 等人發現在施打高劑量 STZ 於大鼠體內 會導致胸腺的萎縮，而使淋巴球的製造產生問題，但是STZ 本身的不穩定性所以 不易產生慢性毒害，加上使用胰島素治療就可使胸腺萎縮情況減緩，推斷胸腺萎 縮和淋巴球數量下降和低胰島素相關，但是相關機制仍然不清楚(Tabata et
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al.,1984)。因此本實驗由於淋巴球數目低導致整體白血球數量糖尿病大鼠顯著低於
健康大控制組(3.4±2.2 vs. 4.0±2.4 103/mm3,p<0.05)，這樣的現象也在暴露組看見。
脂質的部分，總膽固醇、三酸甘油脂糖尿病大鼠高於健康大鼠，而高密度脂 蛋白和總膽固醇比值兩組之間沒有差異。高總膽固醇和高三酸甘油脂和糖尿病病 症有高度相關，因此本實驗也有觀察到這樣的現象(Jeong et al.,2010)。從上述的生 理指標推斷，實驗的第一部分糖尿病大鼠模式建立是成功的。
實驗暴露大氣微粒部分，本實驗連續暴露了16週，使用IVC系統，此系統原做 為飼養動物的空氣循環機，將進氣處接到外界，外界的空氣便可以穩定流入IVC系 統本次實驗大鼠暴露。暴露實驗過去會使用氣管灌注，氣管灌注的好處是可以控 制濃度，方便易操作，缺點是局限於急性暴露，若要進行慢性暴露實驗勢必得做 數次氣管灌注，可能會產生死亡率。除了氣管灌注實驗之外，毒理實驗也使用大 氣微粒濃縮器，濃縮機的好處是可以將大氣中所需粒徑的微粒濃縮數倍導引進暴 露室中，優點是其暴露方式較符合微粒呼吸暴露的途徑(route)，且可以提高暴露濃 度，其缺點是維持儀器需要較高的人力和財力支持，暴露時間也有限制。Sirivelu 等人研究，使用卵巢白蛋白(OVAs)引發呼吸道過敏大鼠，此大鼠暴露於濃縮大氣 微粒(CAPs)，結果發現在吸入CAPs這組或是單卵巢白蛋白所引發呼吸道過敏大鼠 下視丘室旁核(PVN)均顯著的產生腎上腺素，甚至大鼠血漿中的可體松也顯著上 升。鄭等人研究指出，將自發性高血壓大鼠暴露於CAPs五小時候，大鼠的RMSSD 從原本下降15%變成下降60%，此研究證實CAPs會改變自發性高血壓大鼠的心跳 變異性(Chang,2005) 。Sun等人發表在2009研究，使用C57BL/6J小鼠動物模式，本 研究探討汙染源為CAPs，將小鼠暴露24週後進行犧牲，此實驗的結果發現，實驗 動物出現全身性的胰島素阻抗現象，系統性的發炎現象，腹部脂肪肥大；此外，
進一步測量內皮細胞對於胰島素的敏感度，結果發現胰島素訊息傳遞鏈出現對胰 島素的阻抗現象(Sun Q, 2009 )。以濃縮大氣微粒為架構的實驗下均看到健康效 應，而IVC暴露實驗優點是可以進行全天候24小時一整周的暴露，且暴露濃度與外
