五氯酚及其代謝產物四氯對苯二酚促癌作用之分子機制研究

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告

※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※

※ ※

※

五氯酚及其代謝產物四氯對苯二酚促癌作用之分子機制研究

※

※

※

※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※

計畫類別：

□

個別型計畫

□整合型計畫

計畫編號：NSC 89-2314-B-006-170

執行期間：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日

計畫主持人：

王應然

共同主持人：

何元順

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

執行單位：

國立成功大學醫學院環境醫學研究所暨工業衛生科

中

華

民

國

90

年

10

月

29

日

行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

五氯酚及其代謝產物四氯對苯二酚促癌作用之分子機制研究

計畫編號：NSC 89-2314-B-006-170 執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日 主持人：王應然 國立成功大學醫學院環境醫學研究所暨工業衛生科 一、中文摘要 五氯酚 (Pentachlorophenol, PCP)被廣 泛使用在木材保存劑及生物殺菌劑上，大 量 使 用 的 結 果造 成PCP 在環境中廣泛流 布，成為重要環境污染物。由嚙齒類動物 及人類肝臟酵素代謝的研究中指出PCP會 經 由 氧 化 去 氯 作 用 形 成 四 氯 對 苯 二 酚 (Tetrachlorohydroquinone,TCHQ)。兩階段致 癌模式已被廣泛的用來探討促癌劑的作用 並尋找引起人類癌症的重要共同因子。因 此，在本研究即以小鼠皮膚的兩階段動物 致癌模式來探討PCP及TCHQ的促癌作用 及分子機制，並以TPA做為標準促癌劑， 比較PCP及TCHQ之促癌能力，並研究促癌 過程之早、中、晚期鼠皮、腫瘤組織及血 清中相關促癌基因表現的情形。結果顯示 在促癌週期各組體重變化的趨勢中發現： 只有TCHQ 50µg及1000µg兩組的體重顯著 比控制組低，推測這可能是因持續暴露 TCHQ，對細胞造成氧化性壓力或氧化性傷 害所產生的毒性效應。以腫瘤生成的時間 而言，PCP 1000µg及TCHQ 1000µg的第一 顆腫瘤分別在第六週及第十一週出現，相 對於TPA產生腫瘤的隻數及所誘發的腫瘤 數發現，PCP及TCHQ之促癌能力都遠低於 TPA。以RT-PCR分析鼠皮、腫瘤等相關促 癌基因表現的結果顯示：在腫瘤組織中 TNF-α、IL-1β及ODC的表現量會比控制組 的皮膚組織高；短期以TPA及PCP處理的小 鼠，其皮膚的IL-1β及ODC基因表現量有明 顯上升，但TNF-α的表現量卻較不一致。 以PCP或TCHQ處理後，皆會降低肝臟代謝 酵素－Glutathione Peroxidase、Glutathione Reductase及Catalase的活性。以ELISA定量 分析血清中TNF-α及IL-1β含量，其中，以 TPA處理短時間內血清TNF-α與IL-1β表現 量會上升；但TNF-α在TPA促癌過程的早、 中、晚期表現量並沒有明顯的變化出現； IL-1β卻在促癌20週時呈現很高的表現量； 而在PCP 1000µg或TCHQ 1000µg作用下， 其TNF-α與IL-1β表現量都沒有明顯的變 化。由組織切片的結果中發現：經過TPA、 PCP或TCHQ處理的皮膚會出現增生的情 形，所形成的腫瘤多數為良性乳突瘤，只 有在TPA處理下，發現一例為鱗狀細胞良 性 乳 突 瘤 。 由 本 研 究 的 結 果 推 測PCP 及 TCHQ的促癌能力遠低於TPA的原因，可能 是因藥物誘導各基因表現的時期及其誘導 能力的強弱所造成的差異；而PCP的促癌能 力應比TCHQ高；雖然如此，TCHQ卻會對 全身系統造成較大的毒性。 關鍵字：五氯酚、四氯對苯二酚、兩階段 致癌模式、腫瘤促進作用 Abstr act

Pentachlorophenol (PCP) and its salt are used extensively as biocide and wood preservative. Due to improper disposal, PCP has become an environmental pollutant and is now considered to be ubiquitos. Metabolic studies carried out in rodents or human liver homogenate have indicated that PCP undergoes oxidative dechlorination to form tetrachloro-hydroquinone (TCHQ). Two-stage carcinogenesis experiment was conducted in this study to elucidate the molecular mechanism of PCP and TCHQ in tumor promotion and compare the promoting activity of PCP and TCHQ to 12- ο -tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) (a well-known promoter). The results showed that mice body weight in the TCHQ-treated group was lower than the control group. It might be contributed by the toxic effects of TCHQ accumulated in body from long-term treatment. Mice skin tumor appeared at the sixth and eleventh weeks after PCP and TCHQ treatment, respectively. The tumor

was lower than the positive-control TPA. Dermal hyperplasia and papilloma were observed in the skin treated with TPA, PCP and TCHQ. Besides, promotion-related gene expressions were analyzed by RT-PCR, and results showed that the expressions of tumor necrosis factor-α [TNF-α], Ornithine decarboxylase [ODC] and Interleukin -1β [IL-1β] were higher in tumor tissue than in normal skin tissue. The expression of IL-1β and ODC increased during the short-term treatment of TPA and PCP, however, the expression of TNF-α was more controversy. Several hepatic metabolic enzymes were analysed in mice treated with PCP and TCHQ for 32 weeks, and the results showed the enzyme activities of glutathione peroxidase, glutathione reductase and catalase were all significantly decreased when compared to the control mice.Quantification of serum TNF-α and IL-1β were preformed by ELISA, and the data showed that TPA treatment can increase the serum TNF-αand IL-1β during a short time duration. Serum TNF-α declined to basal level when prolonged the treatment, on the contrary, the serum IL-1β increased dramatically in mice after treated with TPA for 20 weeks. No significant alteration of TNF-α and IL-1β gene expressions in mice treated with high-dose of PCP1000µg and TCHQ1000µg.In summary, we concluded that both PCP and TCHQ possess tumor-promoting ability and the potency was lower than the well-known tumor promoter TPA. One of the reasons may be due to the different induction ability of promotion-related gene expressions between the above tested compounds. The tumor-promoting ability of PCP is higher than TCHQ, however, the systemic toxic effect is higher in TCHQ than in PCP.

Keyword: Pentachlorophenol,

Tetrachloro-hydroquinone, Two-stage carcinogenesis, Tumor promotion

二、緣由與目的 五 氯 酚(Pentachlorophenol, PCP)具有 強效的殺菌力，且具有穩定之物化特性、 不溶水性及價格便宜等優點，因此，自 1936 年起被大量使用於工業上，其應用的範圍 相當廣泛，包括：木材、紙漿、紡織品、 皮革、塗料、繩索等多樣物品的保存劑、 除草劑、落葉劑、殺蟲劑、除黴劑、消毒 劑及土壤薰蒸劑等。長期濫用的結果造成 PCP 在環境中廣泛流布，成為重要環境污 染物，其污染的層面遍及水體、食物、空 氣及土壤；環境中 PCP 之半衰期長達數 年，主要透過食物鏈的方式進入人體之 中，並且 PCP 仍是目前偵測生物體內環境 污染物的普遍性指標，在美國有超過 70% 人口體內可以偵測到 PCP 的存在。 由細菌致突變測試(Ames test)顯示： PCP 並不會造成基因突變及 DNA 損害；但 在動物實驗卻觀察到 PCP 會誘發小鼠產生 肝臟腫瘤、腺瘤及血管肉瘤。流行病學調 查統計結果也顯示：PCP 與白血病及惡性 淋巴腺癌有關；因此，國際癌症研究機構 (IARC)將 PCP 歸類為 Group 2B；美國環保 署(US. EPA)歸類為 B2，意指 PCP 為人類 可能的致癌物質，雖然，動物實驗證實 PCP 會誘發腫瘤形成且 PCP 的暴露與人類癌症 發生率具有相關性存在，但是對於 PCP 致 癌之分子機制仍有待進一步的研究。 由嚙齒類動物及人類肝臟酵素代謝的 研究中指出：PCP 會被代謝成四氯對苯二 酚 (Tetrachlorohydroquinone, TCHQ) 。 而 且，在 TCHQ 代謝過程中又會自發性的產 生 超 氧 自 由 基 及 活 性 中 間 產 物 － Tetrachlorobenzoquinone (TCBQ) ， 造 成 DNA 的損害。研究顯示：TCHQ 會造成人 類纖維母細胞、V79 中國倉鼠細胞及中國 倉鼠卵細胞(CHO)之 DNA 單股斷裂；抑制 CHO 細胞之生長及增加 V79 中國倉鼠細胞 之微核數目。但是 TCHQ 誘發癌症之動物 實驗及其在 PCP 毒性及致癌過程中可能扮 演的角色仍有待進一步釐清。 本研究主要在探討 PCP 及 TCHQ 的促 癌作用及分子機制，以小鼠皮膚的兩階段 動物致癌模式探討，並期望達成以下的目

的: (1) 建立兩階段化學致癌動物模式，以 TPA 做為標準促癌劑，比較 PCP 及 TCHQ 之 促癌能力； (2) 研究促癌過程之早、中及晚期鼠皮及腫 瘤組織中相關促癌基因之表現； (3) 定量分析小鼠血清中 TNF-α及 IL-1β的 含量，以探討皮膚暴露方式是否會造成 全身系統性的影響。 三、結果與討論 為 確 保本 實驗的研究品質，我們以 TPA 作 為 本 實 驗 的 陽 性 對 照 組 (Positive control)。處理的劑量為每 100 µl 之 acetone 中溶 2.5 µg TPA；先以 100 µg 之 DMBA 先 將 小 鼠 皮 膚 始化後，以TPA 處理進行 20 週促癌實驗，並成功地以兩階段的致癌 模式誘導皮膚長出腫瘤，處理 TPA 之小鼠 於促癌第七週，即出現第一顆腫瘤，自第 十四週起已有 90％小鼠長出腫瘤；於 20 週的促癌實驗中，平均每隻小鼠腫瘤數高 達 13.4 顆；另外，本實驗以 Acetone 做為 溶劑，並用 Acetone 處理做為本實驗的控 制組(Control)，在整個促癌實驗的過程中， 都沒有誘發皮膚產生任何腫瘤。 本研究中，以透過兩階段皮膚致癌的 動 物 實 驗 來 探 討 PCP 及 TCHQ 的 致 癌 能 力，雖然經過25週的促癌實驗發現，PCP 與TCHQ所誘發的腫瘤數相對的少於TPA 誘發的腫瘤數，但是這兩種化學物質確實 具有某種程度的促癌能力。在相同劑量 下，PCP出現腫瘤的時間會比TCHQ早；在 促癌能力之比較上，PCP出現較多腫瘤之劑 量 為 PCP (50µg) 、 而 TCHQ 則 為 TCHQ (1000µg)。雖然以TCHQ (1000µg)處理會產 生較多的腫瘤數，平均每隻小鼠的腫瘤數 為0.7顆，主要是因其中一隻小鼠之腫瘤數 達6顆所致；而PCP (50µg)平均每隻小鼠形 成的腫瘤數為0.3顆；但是TCHQ (1000µg) 所形成的腫瘤顆粒都< 3 mm，PCP (50µg) 形成的腫瘤則可達到8-9 mm左右；因此， 誘導腫瘤生長的能力似乎以PCP較高。另 外，除了PCP (50µg)在皮膚出現腫瘤以外， 還有一隻小鼠的肝臟、腎臟及脾臟都明顯 出現病變的情形，而在PCP (1000µg)亦出現 一隻在非處理藥物部位-耳朵長出腫瘤的 例子。因此，我們推測PCP的促癌能力應該 高於TCHQ；PCP之促癌能力應該主要是來 自於該化合物本身具有的特性，而非經由 代謝產物-TCHQ的作用。 在病理組織切片的結果上，經DMBA 始 再以TPA處理之皮膚與完全沒有處理 任何藥物之皮膚比較，可明顯觀察到皮膚 增生的現象，若只在局部皮膚細胞出現增 生情形，就會形成瘜肉組織；當該部位細 胞持續不斷地增生，就會在皮膚形成良性 乳突瘤 papilloma)，在20週TPA的刺激 下，只有一例鱗狀細胞良性乳突瘤。經 DMBA 始 再 以PCP 或 TCHQ 處 理 的 皮 膚，同樣會促使細胞出現增生的情形，誘 導形成的腫瘤組織都是屬於良性乳突瘤， 並沒有觀察到鱗狀細胞乳突瘤的產生。 在促癌實驗開始前TCHQ (50µg)的平 均體重顯著較控制組低的可能原因是這一 組 小 鼠 在 開 始 進 行 實 驗 時 的 週 齡 只 有7 週，而其他組別的小鼠大約都在8週齡開始 進行實驗，所以才造成平均體重較低的情 形。 TCHQ (50µg)有一隻小鼠於促癌第28 週死亡，TCHQ (100µg)同樣有一隻小鼠於 促癌第31週死亡；另外，在促癌週期中 TCHQ (50µg)與TCHQ (1000µg)的體重亦 顯 著 比 控 制 組 低 ； 而 且 TCHQ (50µg) 與 TCHQ (1000µg)的肝臟重量及TCHQ (50µg) 在脾臟重量部份均比控制組低。因此，在 毒性方面，TCHQ應該高於PCP，推測這現 象可能是透過活性氧物種(ROS)所造成的 結果。這項推論可以以本實驗室早期進行 相關研究佐證，將PCP及TCHQ注射於大鼠 腹腔，均會增加大鼠尿液中8-epi-PGF 2α的 含量，8-epi-PGF 2α 是脂質過氧化的一種 生物指標，用以監測體內氧化性傷害的情 形；除此以外，有文獻也曾指出在注射PCP 及TCHQ 24小時以後，會顯著地增加血清 中AST及ALT的含量，以TCHQ處理造成 8-epi-PGF 2α、AST及ALT的增加情形會比

PCP嚴重，若以TCHQ合併使用維他命E， 則 可 顯 著 地 降 低 8-epi-PGF 2α的 產 量 及 AST及ALT的含量。 在處理PCP (50µg)的組別中，出現兩個 較特別的例子-編號為PCP 50 A2及PCP 50 A5的小鼠在肝臟、脾臟或腎臟出現明顯病 變的現象，尤其PCP 50 A2脾臟部份腫大的 情形相當嚴重，約是控制組脾臟的30-40 倍；由於這兩例在PCP50組別中，屬於特殊 的例子，並不是每隻小鼠的臟器都出現病 變的現象，因而造成同組內小鼠變異性過 大，在與控制組進行檢定時，便無法呈現 出顯著的差異性。雖然如此，我們仍然不 能忽略PCP具有會造成此病變的能力。 有 文 獻 報 導 PCP 會 抑 制 肝 臟 S-9 fraction 代 謝 酵 素 的 活 性 ， 如 ： sulfotransferase及細胞色素P 450等。而1985 年Juhl等人的研究中亦指出，以0.01 mM PCP 與 S-9 fraction 混 合 ， 可 快 速 形 成 TCHQ；但隨著PCP劑量增加，TCHQ之產 量反而會降低，當以1 mM PCP作用，則完 全抑制TCHQ的形成。因此，可想而知在暴 露較低劑量的PCP下，才有可能會很快被酵 素代謝；在高劑量的暴露，反而會抑制酵 素的活性。在本研究以PCP或TCHQ處理的 濃度分別為0.094 mM、0.187 mM及37.52 mM，每週進行2-3次暴露，共32週促癌實 驗 的 結 果 ， 鼠 肝 微 粒 體 之 代 謝 酵 素 － Glutathione Peroxidase 、 Glutathione Reductase及Catalase的活性，均明顯低於控 制組，但是與處理的劑量並沒有相關性存 在。推測這樣的現象與測試藥物之持續累 積有關；因為PCP吸收能力很好，吸收後會 廣泛分佈在多種器官中；它在小鼠血漿中 吸收的半生期為1.3小時，排泄半生期為5.8 小時；[14 C] PCP由尿液中排泄的半衰期為 4.5天。因此，持續處理藥物就可能會使之 不斷累積在體內而造成更大毒性，代謝酵 素被抑制情形就更加嚴重。此外，在1997 年Wang等人的研究亦有類似的發現，在 TCHQ作用下，會產生細胞毒性及GSH消耗 的情況。 在PCP及TCHQ之代謝過程會產生自 由基，造成細胞氧化性壓力及傷害。由於 高劑量之PCP會抑制酵素的代謝，進而減少 自由基的產量及細胞氧化性壓力或傷害； 因此，推測以PCP (2.5µg)之劑量處理的組 別中，由於PCP會被迅速代謝，而造成血清 IL-1β 的 表 現 量 較 PCP (50µg) 及 PCP (1000µg)兩組高。TCHQ引起細胞死亡的方 式 可 能 是 透 過 細 胞 凋 亡 (Apoptosis) 的 程 序，不同於壞死的程序，在細胞凋亡的過 程中並不會引起發炎反應。有文獻指出， IL-1具有保護性的作用，可以對抗由氧化性 壓力所造成的傷害。在TCHQ(1000µg)組別 中，IL-1β的表現一直維持著低量的表現， 推測可能是急性氧化性傷害而導致細胞凋 亡；但TCHQ (2.5µg)及TCHQ (50µg)在32 週促癌實驗過程中，IL-1β有持續增加表現 量的情形，推測可能的原因是氧化性壓力 誘導IL-1β基因的表現，以提供細胞保護作 用。 TNF-α和IL- 1β在宿主體內，扮演著多 種生物性角色。在發炎反應中，它們會被 活化，增加體內種種防禦機制，尤其是免 疫反應和血液反應。TNF-α會由啟始細胞 或其周圍細胞分泌出來(例如：淋巴球)，而 TPA也可以誘導標的器官TNF-α基因的表 現來誘導腫瘤的生長，並推測TNF-α在腫 瘤促進過程中是一必要的細胞激素，且在 促癌過程中扮演著很重要的角色。雖然， 在 臨 床 上 或 動 物 實 驗 中 ， 以 高 濃 度 的 TNF-α處理腫瘤周圍，可以選擇性的破壞 腫瘤上新生的血管，但內生性且慢性生成 的TNF-α卻可能會促使啟始細胞發展成表 皮惡性腫瘤；TNF-α能影響上皮細胞及真 皮 細 胞 ， 特 別 是 由 角 質 細 胞 產 生 的 TNF-α，在促癌發展的早期階段扮演著很 重要的角色。TNF-α及IL-1誘導的訊息傳遞 途徑有些相似，而且在動物實驗中，IL-1 會刺激小鼠角質細胞的增生且同樣具有促 癌活性，因此，推測IL-1亦參與在促癌階段 之中。而由本研究的結果，推測在促進皮 膚腫瘤生成的過程中，IL-1β可能扮演著重 要的角色；但是，TNF-α對於促進腫瘤生 長的作用，則沒有呈現較一致的結論。 過去的研究顯示ODC的活性受生長因 子刺激時會有短暫的表現，而在轉形的細

胞中則會持續出現大量的表現，被認為是 一可調控細胞生長和轉形的原致癌基因； 另外，TPA亦會誘導細胞分泌ODC。本研 究以TPA誘導生成的腫瘤組織中，ODC的 表現量確實比控制組皮膚高。在PCP 50 A2 脾臟病變的ODC表現量亦比以PCP (50µg) 處理32週之表現量高。因此，推測ODC可 能亦是參與癌症發的重要因子。 在探討PCP (50µg)脾臟病變的基因表 現中發現：PCP 50 A2脾臟病變之IL-1β表 現量 比 32週控制組及32週PCP (50µg) 與 PCP 50 A5 脾臟腫大的 表現量高， 但 是 TNF-α的表現量反而卻是最低的；而ODC 在PCP 50 A2的表現情形似乎比PCP 50 A5 及32週PCP (50µg)高。另外，在32週控制組 的小鼠脾臟組織中卻觀察到TNF-α及ODC 有高量的表現，推測在Acetone長期作用 下，雖然不會造成癌症的發生，但是卻不 可否認它具有部分潛在的毒性效應。 以 TPA 誘導各基因表現的時期及其誘 導基因表現能力的強弱的觀點，來解釋 TPA 的促癌能力明顯高於 PCP 或 TCHQ 的 情形：短期以 TPA 處理小鼠皮膚，在其血 清中 TNF-α，於 3 小時表現量就增加，且 增加的程度比 PCP (1000µg)高；在 IL-1β的 表現情形是以 TPA 表現較高，由 TPA 誘導 可在 6 小時內引起 IL-1β大量的表現，而 PCP 1000 則會延宕至 24 小時才會出現較 高的表現量；另外，以 TPA、PCP 及 TCHQ 誘導形成的腫瘤中促癌基因的相對表現量 來看，由 TPA 誘導所產生的腫瘤中 IL-1β 基 因 的 表 現 量 明 顯 高 於 PCP (50µg) 及 TCHQ (1000µg)；而 TNF-α與 ODC 的表現 在三者的變化並不明顯。由上述結果可推 測，由於 TPA 誘導基因表現的能力較 PCP 或 TCHQ 高，因此，它具有的促癌能力亦 比較高。 四、計畫成果自評 1.原計畫內容在探討五氯酚及其代謝產物 四氯對苯二酚促癌作用之分子機制，本研 究內容主要在探討五氯酚及四氯對苯二 酚的促癌作用動物致癌，以小鼠皮膚的兩 階段動物致癌模式探討五氯酚及四氯對 苯二酚在鼠體皮膚造成腫瘤及其相關的 基因表現。應已達成原計畫之預期目標。 2.五氯酚及四氯對苯二酚的毒性及致癌性 在小白鼠的實驗中甚為明確，但其致癌的 作用機轉及傷害指標的研究卻甚少。本研 究內容已整理成可供學術期刊發表之格 式。其中有部分內容已發表在 2001 年的 Toxicology Letters. 122: 157-169 (2001). 五、參考文獻

1. Jorens, P.G. and Schepens, P.J. Human pentachlorophenol poisoning. Human & Experimental Toxicology. 12(6):479-95, 1993.

2. Eduljee G. Secondary exposure to dioxins through exposure to PCP and its derivatives. The Science of The Total Environment 232:193-214, 1999

3. Reigner B.G., Bois F.Y. and Tozer T.N. Pentachlorophenol carcinogenicity: extrapolation of risk from mice to humans. Human & Experimental Toxicology. 12(3):215-25, 1993

4. Qiao GL., Brooks JD. and Riviere JE. Pentachlorophenol dermal absorption and disposition from soil in swine: effects of occlusion and skin microorganism inhibition. Toxicology & Applied Pharmacology. 147(2):234-46, 1997. 5. Ying-Jan Wang, Ching-Chang Lee,

Wen-Ching Chang, Hung-Bin Liou , Yuan-Soon Ho. Oxidative stress and liver toxicity in rats and human hepatoma cell line induced by pentachlorophenol and its

major metabolite

tetrachloro-hydroquinoue. Toxicology Letters. 122: 157-169, 2001.