薄層層析(TLC)之指標成分鑑定

一、檢液之製備

方法一、中華中藥典 2004：取粉末 2.0 g，加甲醇 10 mL，置水 鍋上加熱三十分鐘。冷後，過濾，取濾液作為檢品溶液。

方法二、中華人民共和國藥典 2010 年版

^[2]

：取粉末 0.5 g，加甲 醇 10 mL，超音波振盪二十分鐘，濾液蒸乾，殘渣加甲醇 0.5 mL 使 溶解，作為檢品溶液。

方法三、臺灣中藥典 2013 年版

^[1]

：取粉末 1.0 g，加入甲醇 10 mL，

超音波震盪器(400 W)於室溫下震盪 30 分鐘，過濾，作為檢品溶液。

二、標準品之製備

取 naringin(柚皮苷) (Sigma，95%) 1 mg 溶於 1 mL 之甲醇中。

取 hesperidin(橙皮苷) (Sigma，95%)1 mg 溶於 1 mL 之甲醇中。

取 neohesperdin(新橙皮苷) (ICN Biomedicals Inc.) 1 mg 溶於 1 mL 之甲醇中。

取 synephrine(辛弗林) (中國藥品生物製品檢定所) 1 mg 溶於 1 mL 之甲醇中。

三、層析條件

（p-anisaldehyde/H

₂

SO

₄

）

中藥檢驗方法

層析板 TLC plate, pre-coated with silica gel F

₂₅₄

展開距離 8 cm

第四節 高效液相層析之指標成分測定

一、檢液之製備

取粉末 0.2 g，分別置 50-mL 離心管中，加 50% 乙醇 20 mL，超 音波（400 W） 處理 30 分鐘，離心 5 分鐘（約 3000 rpm），用 0.45-μm 微孔濾膜（PTFE）濾過，即得

^[46]

。

二、標準品配製

以電子天平精確秤取藥材之對照標準品，

取 naringin(柚皮苷) (Sigma，95%) 30 mg，溶於 10 mL 之甲醇中。

取 hesperidin(橙皮苷) (Sigma，95%) 10 mg，溶於 10 mL 之甲醇中。

取 neohesperidin(新橙皮苷) (ICN Biomedicals Inc.)20 mg，溶於 10 mL 之甲醇中。

取 synephrine(辛弗林) (中國藥品生物製品檢定所)10 mg 溶於，10 mL 之甲醇中。

圖 九、標準品結構

^[47]

三、檢量線

取配置好濃度之標準品儲備溶液，再依比例稀釋成以下濃度：

Naringin(柚皮苷)：

3000 μg/mL、1500 μg/mL、750 μg/mL、375 μg/mL、187.5 μg/mL、

93.75 μg/mL、46.875 μg/mL。

Hesperidin(橙皮苷)：

1000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、

31.25 μg/mL、15.625 μg/mL。

Neohesperidin(新橙皮苷)：

2000 μg/mL、1000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、

62.5 μg/mL、31.25μg/mL。

Synephrine(辛弗林)：

1000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、

31.25 μg/mL、15.625 μg/mL。

四、使用儀器

層析管：Altima C

18

column, 4.6 × 250 mm, 5 μm Detector：Waters 2996 Photodiode Array Detector

Waters 2695 Separation Module with autosampler 717+

SDS：十二烷基硫酸鈉 六、藥材指標成分定量

分別取 naringin (柚皮苷)、hesperidin(橙皮苷)、neohesperidin(新橙皮 苷)、synephrine(辛弗林)之混合對照標準品溶液及檢品溶液各 10 µL，

注入高效液相層析儀。就標準品溶液與檢品溶液之滯留時間及 UV-Vis 最大吸收波長比較鑑定之。另以標準品之波峰面積製作檢量線，並由 檢品溶液所得之波峰面積，利用檢量線分別求出濃度後，換算該成分 在檢品之含量。

第五節 枳實之黃麴毒素檢驗

一、化學試劑

氯化鈉採用試藥級(analytical grade)；甲醇液相層析級(LC grade)；

黃麴毒素(B

1

、B

2

、G

1

及 G

2

) 之對照用混合標準品，濃度分別為 1000 ng/mL、300 ng/mL、1000 ng/mL 及 300 ng/mL。

二、實驗儀器

離心管：50 mL，附 PP 材質螺旋蓋。

褐色定量瓶：2 mL、10 mL 及 20 mL

濾膜：直徑 47 mm，孔徑 0.22 μm，Nylon 材質。

濾紙：Whatman No.1，直徑 11 cm。

玻璃纖維濾紙：直徑 9 cm。

免疫親和性管柱 (Immunoaffinity column)：採用內含對黃麴毒素 B

1

、B

2

、G

1

及 G

2

具專一性單株抗體之 AflaTest-P 管柱。

針筒過濾器 (Syringe filter)：直徑 13 mm，濾膜孔徑 0.22 μm，

PTFE 材質。

高 效 液 相 層 析 儀 ： WATERS 2695 Separation Module with autosampler 717+

偵測器：WATERS 2475 Multi λ fluorescence Detector 螢光檢出器。

層析管：Cosmosil 5C

18

-AR，5 μm，內徑 4.6 mm × 250 mm、光化 學反應器：Knitted reactor coils (KRC) 25-25。

均質機 粉碎機

三、實驗方法

A、檢體前處理方法：

取 25 g 已磨碎之檢體+ 5 g NaCl + 125 mL 60% MeOH。

↓均質 2 分鐘( 15000 rpm ) 。

↓以 pH 試紙測 pH 值 ( pH 4~7 皆可) 。

↓ 用 Whatman 1 號，直徑 11 cm 濾紙做初過濾。

↓ 精確量取濾液 20 mL+ 20 mL 甲醇混勻，以玻璃纖維直徑 9 cm 濾紙過濾。

↓ 精確量取濾液 10 mL 以 1 滴/秒之流速通過 Afla-Test affinity column。

↓ 待濾液完全通過管柱後，取 10 mL 純水以 2 滴/秒之流速 通過 column（重複二次）。

↓ 取 1 mL HPLC 級甲醇以 1 滴/秒之流速洗出黃麴毒素。

↓ 收集洗出液加純水混合定容至 2 mL。

↓ 以針筒過濾器，直徑 13 mm，濾膜孔徑 0.22 μm，PTFE 材質，過濾，取濾液供作檢液。

↓ 取 50 μL 注入高效液相層析儀分析。

B

、

標準曲線之製作：

取黃麴毒素原液 0.4 mL (B

1

：400 ng、B

2

：120 ng、G

1

：400 ng、

G

2

：120 ng) 溶於 50%甲醇 10 mL 後，用 50%甲醇稀釋調配 成一系列濃度為: B

1

及 G

1

(20、10、5、2.5、1.0 ng/mL)， B

2

及 G

2

(6、3、1.5、0.75、0.3 ng/mL)分別注入於高效液相層析 儀分析，以各標準品濃度為 X 軸，以各標準品波峰面積為 Y 軸作圖並求出標準曲線之迴歸方程式 (y=ax+b)及相關係數 (R

²

)。

第六節 枳實之抗氧化含量評估

一、化學試劑

Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), sodium bicarbonate (NaHCO

3

), gallic acid, (+)-catechin, aluminum chloride hexahydrate (AlCl

3

．6H

2

O), rutin 皆購自 Sigma-Aldrich。

Folin-Ciocalteu’s reagent 則購自 Merck.

二、實驗儀器

酵素免疫分析儀 (Power Wave X 340 Microplate Spectro- photometer, Bio-Tek, USA)

離心機 (HermLe Z300, Germany)

電子分析天平 (Mettler Toledo AT 201, Hamilton Instrument)

超純水製造機 (TK-5/FM-120D/ZROS6016Y/ZMQS600, Millipore Milli-Q, USA)

震盪混合器 (Vortex-genie 2, Scientific industries, USA) 微量分注器 (BOECO/GILSON, Germany/France) 96 孔微量盤 (96-well microplates, NUNC, Denmark) 微量吸管尖 (Tips, Axygen, USA)

超音波震盪器 (Ultrasonic cleanser, DC400H , Delta)

電動連續分注器 (Handystep® electronic, BRAND, Germany)

微量離心管 (Microtubes, Axygen, USA)

三、實驗方法

A、總多酚含量測定

用比色分析法，以磷酸鉬磷酸鎢試劑 Folin-Ciocalteu`s phenol reagent 簡稱 FCP 試劑檢測樣品中酚類化合物含量。試劑的濃度為 2N，使用 前將其稀釋 1 倍。多酚類化合物在鹼性溶液中，可以將鎢鉬酸還原(使 W

⁶⁺

變為 W

⁵⁺

)生成藍色化合物，顏色的深淺與多酚的含量成正比，利 用 ELISA 測量吸收值，化合物在 760nm 處有最大吸收，用 gallic acid 作為參照標準標準品，做出檢量線，檢測未知物與指示劑反應後之吸 收值，對應其檢量線則可測得其分類化合物的含量。總多酚的含量等 同於 gallic acid/sample (mg/g)的表示。

取 20 µL 樣品溶液或 gallic acid 標準品，接著加入 100 µL FCP 試 劑，再加入 80 µL 之 5% 碳酸鈉 (sodium carbonate ，Na

₂

CO

3

)溶液，

靜置 30 分鐘，再以分光光度計於 760 nm 測其吸光值並計算總多酚含 量，以 gallic acid 為標準品，做成檢量線，再利用標準曲線方程式算 出測驗樣品總多酚類的含量，結果以[gallic acid/sample (mg/g)]表示。

B、總黃酮類含量測定

總黃酮含量一般以 rutin 為參照標準品，經由 ELISA 測定，含黃酮之 檢品經甲醇萃取後，可以與鋁鹽(三氯化鋁, AlCl

₃

)產生螯合，經 ELISA 在 430 nm 波長下，測定其吸光值。萃取物中之總黃酮類的含量以等 同於[rutin/sample (mg/g)]的表示。黃酮類化合物可以與鋁鹽(三氯化鋁) 產生螯合呈現黃色的螯合物反應，可經 ELISA 在 430 nm 波長下，測 定其吸光值。

取 100 µL 溶液或 rutin 標準品溶液，加入 100 µL 之 AlCl

₃

．6H

₂

O 甲醇溶液，靜置 10 分鐘，再以 430 nm 測其吸光值，並以 rutin 為標 準品做成檢量線計算總黃酮的含量。

總黃酮含量以[rutin/sample (mg/g)]表示。

第七節 枳實之抗氧化活性評估

一、化學試劑

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), BHT , 2,2’-azino -bis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic aicd), potassium peroxodisulfate (K

2

S

2

O

8

), 皆購自 Sigma-Aldrich。

二、實驗儀器

酵素免疫分析儀 (Power Wave X 340 Microplate Spectrophotometer, Bio-Tek, USA)

離心機 (HermLe Z300, Germany)

電子分析天平 (Mettler Toledo AT 201, Hamilton Instrument)

超純水製造機 (TK-5/FM-120D/ZROS6016Y/ZMQS600, Millipore Milli-Q, USA)

震盪混合器 (Vortex-genie 2, Scientific industries, USA) 微量分注器 (BOECO/GILSON, Germany/France) 96 孔微量盤 (96-well microplates, NUNC, Denmark) 微量吸管尖 (Tips, Axygen, USA)

超音波震盪器 (Ultrasonic cleanser, DC400H , Delta)

電動連續分注器 (Handystep® electronic, BRAND, Germany) 微量離心管 (Microtubes, Axygen, USA)

三、實驗方法

A、DPPH 自由基清除能力：

抗氧化的研究上常使用 DPPH 來評估抗氧化物的供氫能力，

DPPH 自由基是一種相當穩定的自由基，其甲醇溶液在 517 nm 下 有較強的吸光值，被抗氧化物還原時吸光值會降低，吸光值越低(反 應後顏色越淡)，表示抗氧化物的供氫能力愈強。

取 20 µL 不同濃度的樣品之溶液與正對照組 (BHT)，再加入 180 µL 0.3 mM DPPH 甲醇溶液。震盪均勻混合，室溫下避光靜置 30 分鐘，隨即加入 96 孔微量盤，以 ELISA 在 517 nm 下，測定其吸 光值。當 DPPH 自由基被清除越多時，其吸光值會下降越多，利用 相對於空白對照組的吸光值下降百分比，可判斷樣品清除 DPPH 自 由基能力之強弱，亦即表示樣品提供氫能力之強弱。本實驗以抗氧 化劑 BHT 為標準品做成檢量線，再利用標準曲線方程式，計算出 同濃度樣品相當於多少 BHT 的含量，結果用 BHT/ sample ( µg / mg) 表示。自由基清除能力計算公式如下：

清除率計算公式 (%) = [ 1-(ABS sample / ABS control) ] × 100%

第四章 結果

第一節 顯微鑑別

一、酸橙

1. 表皮細胞 1 列，多角形，外被 角質層。

2. 油室卵圓形或長圓形，斷續排 成 1~2 環 。

3. 中果皮發達，薄壁細胞細胞壁 不均勻增厚，細胞間隙較大。

4. 草酸鈣結晶多，分布於中果皮 外側及近瓢囊處。

5. 維管束縱向或橫向散布。

圖

略字

^[48]

術語 中文名

ep

epidermis 表皮

or

oil reservoir 油室

mec

mesocarp 中果皮

維管束 圖 十、酸橙組織橫切面

圖 十一、酸橙粉末鑑別特徵 A：導管 B：氣孔 C：表皮細胞 D：導管 E：方晶 F：方晶在偏光下觀察

A B

C D

E

F

二、甜橙

圖 十三、甜橙粉末鑑別特徵

A：表皮細胞 B：油室碎片 C：導管 D：方晶 E：扇形狀橙皮苷結晶 F：扇形狀橙皮苷結晶(hesperidin)在偏光下觀察

A B

C D

E

F

三、綠衣枳實

1. 表皮細胞 1 列，多角形，

外被角質層及非腺毛。

2. 油室卵圓形或長圓形，斷 續排成 1 環 。

3. 中果皮發達，薄壁細胞細 胞壁不均勻增厚，細胞間 隙大。

4. 草酸鈣結晶少，多分布於 中果皮外側。

5. 維管束縱向或橫向散 布。

略字

^[48]

術語 中文名

h hair 毛

mec mesocarp 中果皮

or oil reservoir 油室

vb vascular bundle 維管束

圖 十四、綠衣枳實組織橫切面

圖 十五、綠衣枳實粉末鑑別特徵

A：油室碎片 B：非腺毛 C：表皮細胞 D：螺紋導管 E：方晶 F：方晶在偏光下觀察

A B

C D

E

F

第二節 枳實與其混淆藥材薄層層析之指標成分鑑定

此實驗使用了三種萃取方法與三種展開溶媒系統，再經由一再的比較 選擇較好的分析方法。

一、萃取方法之比較

用來選擇較好之萃取方法所使用的溶媒系統，為臺灣中藥典

^[1]

之展 開溶媒。

【正丁醇：冰醋酸：水 (4：1：5)混液之上層溶液】

萃取方法一

修飾中華中藥典 2004－1%茚三酮 (Ninhydrin)/可見光 檢出

1: Synephrine (辛弗林) (0.5 mg/mL)，5μL 2: CS sample 1，5μL

3: CA sample 2，5μL 4: CA sample 3，5μL 5: CA sample 4，5μL 6: CA sample 5，5μL 1 2 3 4 5 6

萃取方法二

中華人民共和國藥典 2010－1%茚三酮 (Ninhydrin)/可見光 檢出

萃取方法三(建議之萃取方法)

自行開發－1%茚三酮 (Ninhydrin)/可見光 檢出

圖 十六、自行開發萃取方法之薄層層析圖

1: Synephrine (辛弗林) (0.5 mg/mL)，5μL 2: CS sample 1，5μL

3: CA sample 2，5μL 4: CA sample 3，5μL 5: CA sample 4，5μL 6: CA sample 5，5μL

1: Synephrine (辛弗林) (0.5 mg/mL)，5μL 2: CS sample 1，5μL

由上三圖可知：

1. 對照標準品 synephrine (辛弗林) R

f

= 0.36。

2. 方法三 萃取法所跑出的薄層層析圖(如圖十六)不拖尾，比方法一、

方法二萃取法有較好之展現；且方法三萃取僅經超音波震盪後取 其濾液，較其他二法簡便，因此選擇用方法三的萃取方法。

以方法三萃取 萃得本實驗三種品項各三批，以 synephrine (辛弗林) 為對照標準品，臺灣中藥典

^[1]

之展開溶媒：

【正丁醇：冰醋酸：水(4：1：5)混液之上層溶液】

圖 十七、綠衣枳實、酸橙及甜橙各三批之薄層層析圖

1：Synephrine (辛弗林) (1 mg/mL)，5μL 2、3、4： 綠衣枳實①、②、③，5μL 5、6、7： 酸橙①、②、③，5μL 8、9、10：甜橙①、②、③，5μL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

以方法三萃取 萃得臺灣產甜橙一批及本實驗甜橙各三批，以 synephrine (辛弗林)為對照標準品，臺灣中藥典

^[1]

之展開溶媒：

【正丁醇：冰醋酸：水(4：1：5)混液之上層溶液】

圖 十八、臺灣產甜橙與本實驗甜橙三批比較之薄層層析圖

由圖十八可知：臺灣產甜橙與三批甜橙主要斑點一致，推測臺灣產甜 橙應符合臺灣中藥典枳實之鑑別規範。

1：synephrine (辛弗林) (1 mg/mL)，5μL 2： 臺灣產甜橙，5μL

3、4、5：甜橙①、②、③，5μL

1 2 3 4 5

二、展開溶媒系統之比較

使用方法三之萃取方法來試另外三種溶媒系統(以黃酮類成分為指標) 展開溶媒一 【二氯甲烷：甲醇：水（13：7：2）之下層溶液】

呈色劑：香莢蘭醛-硫酸（Vanillin/H

2

SO

4

）

圖 十九、萃取樣品在展開溶媒一之薄層層析圖 (R

f

約 0.4) 1：naringin (柚皮苷) (1 mg/mL)，5μL

5：neohesperidin (新橙皮苷) (1 mg/mL)，5μL 9：hesperidin (橙皮苷) (1 mg/mL)，5μL 2、3、4： 綠衣枳實①、②、③，5μL 6、7、8： 酸橙①、②、③，5μL 10、11、12：甜橙①、②、③，5μL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

展開溶媒二 【乙酸乙酯：甲醇：水 (10：2：3)】

呈色劑：茴香醛-硫酸（p-anisaldehyde/H

2

SO

4

）

圖 二十、萃取樣品在展開溶媒二之薄層層析圖 (R

f

約 0.2) 1：naringin (柚皮苷) (1 mg/mL)，5μL

5：neohesperidin (新橙皮苷) (1 mg/mL)，5μL 9：hesperidin (橙皮苷) (1 mg/mL)，5μL 2、3、4： 綠衣枳實①、②、③，5μL 6、7、8： 酸橙①、②、③，5μL 10、11、12：甜橙①、②、③，5μL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

溶媒系統三 【正丁醇：水：冰醋酸（7：2：1）】(建議之展開溶媒)

溶媒系統三 【正丁醇：水：冰醋酸（7：2：1）】(建議之展開溶媒)

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