小蘗鹼與吳茱萸鹼抑制 TPA 誘發的肝細胞轉形

評估小蘗鹼與吳茱萸鹼抑制 TPA 所誘發的肝細胞轉形是使用 anchorage-dependent growth assays. 轉形的細胞株生長時不受細胞外 基質的影響；生長的能力與癌化程度有關 ¹⁶¹。因此抑制轉形的 anchorage-independent 生長，代表有效的化療抗癌策略。圖 4.1.8.，

以100 nM 小蘗鹼和吳茱萸鹼可抑制 TPA 刺激後的 HepG2 細胞株生 長，分別為 25% 和 26 %。歸納結論是：小蘗鹼與吳茱萸鹼分別是 黃連和吳茱萸的有效活性化合物，在肝細胞株中可抑制 AP-1 和/或 NF-κB 活性，具有抗腫瘤轉形的有效。

第二節吳茱萸抑制肝癌細胞轉形之機轉 4.2.1. TPA 在人類肝細胞可活化 AP-1 的活性

欲探究是否TPA 在人類肝細胞可活化 AP-1 的活性，需建構穩定的含 有AP-1 結合序列/冷光酵素轉殖細胞株。如圖 4.2.1.，TPA 明顯增加 AP-1 的活性且呈劑量反應。在 TPA 刺激的過程中細胞活力維持一致。

當TPA 濃度達 25 ng/mL，AP-1 活性可增加 4.1 倍。結果指出：在人 類肝細胞TPA 可誘發 AP-1 的活性。吳茱萸的甲醇萃取物可抑制 TPA 所誘發人類肝細胞的AP-1 活性及肝細胞的轉形。

圖 4.1. 8.小蘗鹼與吳茱萸鹼抑制 TPA 誘發 HepG2 細胞株細胞轉形的 效果

HepG2 細胞株以 20 ng/ml TPA 及/或小蘗鹼(A) 和吳茱萸鹼依圖示濃 度。採三重複的平均值 ± 標準差。與只以 TPA 處理，但沒有小蘗鹼 和吳茱萸鹼比較時， *p<0.05 表有統計上的顯著差異。

圖 4.2. 1.TPA 對肝細胞內 AP‐1 活性的效果

TPA 處理後冷光酵素與細胞活性的表現，柱狀圖表示相對性的 AP-1 活性，並與溶劑處理後的結果比較RLU。線狀表示細胞活性。採三 重複的平均值 ± 標準差，與控制組比較 *p<0.05 表有統計上的顯著 差異。

4.2.2.為了評估吳茱萸能否抑制細胞轉形，以各種溶劑萃取吳茱萸，

並找出有效活性成份。

分析各種溶劑的吳茱萸的萃取物對TPA 引起的 AP-1 活性，發現 甲醇的萃取物內存在最強的成份。吳茱萸的甲醇萃取物的阻斷TPA 引起的AP-1 活化 EC₅₀值為 24.72 µg/mL(表 2.1.3.)⁹²。而圖4.2.2A.：

甲醇萃取物濃度25 µg/mL 明顯抑制 TPA 誘發的 AP-1 活性，且沒有 細胞毒性。結果建議：吳茱萸的甲醇萃取物可在Chang liver cells 中

抑制TPA 引起 AP-1 活性。另外也發現吳茱萸的甲醇萃取物濃度在 0.2–5 µg/mL 間，有輕微地活化 AP-1 活性。由於中藥萃取物的成份 複雜使然；此活化可能是細胞對環境壓力的反應。因為AP-1 可調控 細胞轉形與癌化過程。進一步分析吳茱萸的甲醇萃取物是否因可抑制 AP-1 活性而阻斷細胞轉形。如圖 4.2.2B.，吳茱萸的甲醇萃取物濃度 越高抑制TPA 所誘發的細胞轉形功能越佳，以濃度成正相關. 結果顯 示: 吳茱萸的甲醇萃取物可抑制 AP-1 活性，並且可在 Chang liver 細 胞株上抑制細胞轉形。

圖 4.2.2. 吳茱萸的甲醇萃取物作用在 TPA 所誘發的 AP‐1 活性和 TPA 引起的肝細胞 anchorage‐independent transformation

圖 4.2. 2A. AP‐1 活性分析⁹²。Chang/AP‐1 細胞株先以圖示的吳 茱萸甲醇萃取物濃度處理 1 小時，再以 20 ng/mL TPA 處理。

圖 4.2. 2B. Anchorage‐independent transformation 分析。Chang/AP‐1 細 胞株同時以20 ng/mL TPA 和圖示濃度的吳茱萸甲醇萃取物處理。採 三重複的平均值 ± 標準差。與只以 TPA 處理控制組比較時， *p<0.05 表有統計上的顯著差異。

4.2.3. 吳茱萸鹼下調肝細胞內 TPA 所引起的 AP-1 活化

吳茱萸鹼、吳茱萸次鹼和檸檬苦素是吳茱萸的甲醇萃取物的主要 活性組成(圖 4.2.3A.)。所以，進一步研究要找到吳茱萸抗腫瘤的主要 活性。在圖 4.2.3B.，吳茱萸鹼有效阻斷 TPA 引起的 AP-1 活性，且 為劑量反應。在吳茱萸鹼濃度10 µM 時，AP-1 活性減少約 40%。吳 茱萸鹼的EC 值為 82 µM。而在吳茱萸次鹼濃度 10 µM 時，AP-1 活

性上升2.5 倍；要到吳茱萸次鹼濃度達 100 µM，AP-1 活性才會回到 basal level (圖 4.2.3C.)。另外，檸檬苦素處理過程則沒有明顯的變化(圖 4.2.3D.)。因此吳茱萸的活性化合物，吳茱萸鹼可阻斷 TPA 誘發的 AP-1 活性，也是吳茱萸的活性化合物。

圖 4.2.3.吳茱萸鹼、吳茱萸次鹼和檸檬苦素對肝細胞中 TPA 所引起的 AP-1 活化的效果

(A) 本研究所使用化合物的結構式。 Chang/AP‐1 細胞株先以圖 示濃度的吳茱萸鹼先處理1 小時。(B)，吳茱萸次鹼 (C)，或檸檬苦素 (D)，然後再以 20 ng/mL TPA 處理。採三重複的平均值 ± 標準差。

與只以TPA 處理控制組比較時， *p<0.05 表有統計上的顯著差異。

4.2.4. 吳茱萸鹼經 ERKs 路徑抑制肝細胞轉形暨 TPA 引起的 AP-1 活 化

為確認吳茱萸鹼的抗腫瘤效果，使用細胞 anchorage‐independent assay 法分析。圖 4.2.4A.，吳茱萸鹼以劑量反應減少群落產生。吳茱 萸鹼在 Chang/AP-1 cells 抑制 TPA 引起的細胞群落產生的 EC₅₀值是 8.2 µM。所以吳茱萸鹼可抑制 TPA 誘發的人類肝細胞活體外的轉形。

此外，反應細胞外訊息而調整AP-1 表現，與三種 MAP kinase cascades 有關，包括ERKs、JNK 和 p38 pathways ¹⁶²。因此必須了解吳茱萸鹼 抑制那一條個路徑。使用西方墨點法分析(western blotting)分析肝細胞 的MAP kinase proteins 和個別的磷酸化形態(活化) (圖 4.2.4B.)。TPA 處理後引起 ERKs、p38 和 JNK 的磷酸化。然而，吳茱萸鹼明顯減 少 TPA 誘發的 ERK kinases 磷酸化；輕微抑制 p38 的磷酸化；JNK 的磷酸化則沒有影響。結果指出吳茱萸鹼的標的是ERKs，透過 ERKs 可阻斷肝細胞內TPA 誘發的 AP-1 活化。

圖 4.2.4. 吳茱萸鹼在 TPA 誘發的細胞群落生成與 MAP kinase 活化的 效果

(A) Anchorage‐independent transformation，Chang/AP‐1 細胞株以 20 ng/mL TPA 和圖所示之吳茱萸濃度處理，採三重複的平均值 ± 標 準差。與只以 TPA 處理控制組比較時， *p<0.05 表有統計上的顯著 差異。 (B) 西方墨點分析，Chang/AP‐1 細胞株以含 0.1%胎牛血清的 DMEM 培養 24 小時，再以 20 ng/mL TPA 與各濃度的吳茱萸鹼培養 30 分鐘。重複實驗三次且選具代表性的照片。

第五章討論

第一節左金丸抑制肝癌細胞轉形之效應

中醫藥是越來越受人們重視與喜愛，是眾多替代醫學中非常重要 的一支，應用在人體健康的維護以超過三千年，累積大量的臨床成果，

惜其機轉與現代研究未能有效結合，影響力仍以亞洲地區為主。所以 如何將過去的臨床經驗轉化成現代研究，讓更多的研究人員投入中醫 藥的研究，是推廣中醫藥的重要方向。例如：過去的研究中，應用小 柴胡湯在肝腫瘤兼有腹水的病人，特別是沒有B 型肝炎表面抗原的病 人¹⁶³。輔助療法應用中藥處方 MSSM-002 在治療過敏性氣喘¹⁶⁴。白 虎湯原用在治療糖尿病病人，研究顯示可強化 3T3-L1 脂肪細胞經胰 島 素 刺 激 的 葡 萄 糖 攝 取 乃 透 過 peroxisome proliferator-activated receptors-γ 訊息傳遞路徑¹⁶⁵。左金丸，屬於傳統的中醫藥處方，過去 都用來治療腸胃病及肝病72, 74, 133。本研究左金丸用在抗肝腫瘤的化學 治療效果。研究結果顯示：左金丸可在肝母細胞瘤細胞株 HepG2 阻 止 TPA 所 誘 發 的 AP-1 和 NF-κB 活 性 、 細 胞 的 anchorage-independentcellular growth，且呈劑量反應。結果提示左金 丸 可 以 抑 制 肝 癌 細 胞 轉 形 。 從 過 去 研 究 發 現 AP-1 的 轉 活 化 (transactivation)對 tumor promotion 是必需；阻斷 tumor promotor 上 AP-1 的活性，可抑制腫瘤轉形^{37, 40, 66}。NF-κB 可以調控參與發炎反 應(inflammatory responses ) 的 基 因 表 現 ¹⁶⁶。 另 外 在 細 胞 凋 亡 (apoptosis)、血管新生(angiogenesis)、細胞增殖(cell proliferation)及細 胞轉形(cellular transformation)都可偵測到 NF-κB 的活化，顯示 NF-κB 是發炎與癌症重要聯結15, 50, 167。因此有效對抗肝癌癌症形成的策略可 透過抑制AP-1 和/或 NF-κB 活性。進一步的研究需分析左金丸可治 療抗肝細胞腫瘤成份活性化物。我們的發現指出小蘗鹼與吳茱萸鹼分 別屬於黃連與吳茱萸的主要生物鹼成份，可阻斷AP-1 和/或 NF-κB，

又可以抑制肝癌細胞的anchorage-independentgrowth 方式。吳茱萸鹼

與小蘗鹼皆屬於多樣性的藥物(pleiotropic agents)；如：促細胞凋亡 (apoptotic)、抗分化(anti-differential)、抗增生(anti-proliferative)等特點

168, 169。同時也有治療中樞神經系統疾病的作用^{170, 171}。在此我們發現

兩種藥物同時有效地減少 AP-1 活化、影響肝癌細胞的轉形，且都呈 現劑量反應。

第二節吳茱萸抑制肝癌細胞轉形之機轉

吳茱萸應用在消化道疾病與肝病已超過千年 72, 74, 113, 182, 183。先前 的研究指出吳茱萸及其主要成份吳茱萸鹼(EVO)和吳茱萸次鹼可有 效抑制IgE 誘發的過敏性疾病，如：異位性皮膚炎和鼻炎¹⁷²。吳茱萸 的乙醇萃取物對脂多醣(lipopolysaccharide)引起小膠質細胞的一氧化 氮合成增加與一氧化氮合成酶的活性上升 ¹⁷³。然而，沒有直接證據 顯示吳茱萸及吳茱萸鹼與抗腫瘤或者抗細胞轉形間的關聯性。本部份 研究是第一次提出吳茱萸的甲醇萃取物可以經抑制 AP-1 轉錄活化，

阻斷 TPA 誘發的人類肝細胞轉形。此外，吳茱萸的活性有效化物:

吳茱萸鹼亦能隨著濃度的上升增加抑制 ERKs 路徑而達到阻斷 AP-1 活性的效果。AP-1 是關鍵的轉錄因素，可調控多種生物性功能；諸 如：細胞增殖、分化、細胞凋亡及癌細胞轉形 ¹⁷⁴。之前的研究曾提 出 AP-1 的轉活化(transactivation)對 tumor promotion 是必需；阻斷 tumor promotor 上 AP-1 的活性，可抑制腫瘤轉形¹⁶。本部份的研究指 出經吳茱萸的甲醇萃取物處理後，TPA 引起 AP-1 活性上升與肝細胞 的轉形都會減少。既然 TPA 引起 AP-1 活化與細胞的轉形可被吳茱萸 的甲醇萃取物所抑制，那麼吳茱萸的活性組成份；吳茱萸鹼、吳茱萸 次鹼及檸檬苦素(limonin)¹⁷⁵最有可能為有效成份。結果發現，吳茱萸 鹼可抑制TPA 引起 AP-1 活化，並呈劑量反應；而吳茱萸次鹼隨濃度 上升先活化AP-1，當濃度到達 100 µM 降到 basal level。由於吳茱萸 鹼與吳茱萸次鹼在TPA 誘發 AP-1 活化上展現相反的效果，我們推測 吳茱萸鹼才是主要吳茱萸的抗腫瘤效果的主要活性藥物，因為兩者的 效果雷同。過去的研究指出吳茱萸鹼、吳茱萸次鹼及檸檬苦素具有抗

腫瘤、抗發炎、抗過敏、及抗血管新生的效果 ^174-176。但是這些化合 物都沒有發現與 AP-1 活性的關聯性。本研究揭諸吳茱萸鹼可抑制 AP-1 活性，且呈劑量反應，是吳茱萸主要的生物活性化物，而非吳 茱萸次鹼或檸檬苦素。Ogasawara 等，曾提出吳茱萸鹼比吳茱萸次鹼 有更強的 antimigratory 活性 ¹⁷⁷。另外，吳茱萸鹼可抑制細胞增殖與

腫瘤、抗發炎、抗過敏、及抗血管新生的效果 ^174-176。但是這些化合 物都沒有發現與 AP-1 活性的關聯性。本研究揭諸吳茱萸鹼可抑制 AP-1 活性，且呈劑量反應，是吳茱萸主要的生物活性化物，而非吳 茱萸次鹼或檸檬苦素。Ogasawara 等，曾提出吳茱萸鹼比吳茱萸次鹼 有更強的 antimigratory 活性 ¹⁷⁷。另外，吳茱萸鹼可抑制細胞增殖與