左金丸抑制肝癌細胞轉形之效應

人類的肝母細胞瘤細胞株(HepG2)、購自生物資源保存及研究中 心(新竹，臺灣) 培養在含 10% 胎牛血清(FBS) Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Life Technologies)，溫度濕度控置在 37 °C，

5% 二氧化碳的培養箱中。一般化學藥品都購自 Sigma 公司(St. Louis, MO, USA)，其它特殊藥品會另行說明。TPA 溶在乙醇中，濃度 0.5 mg/ml；Neomycin G-418 (Promega, Madison, WI, USA)溶在水中，吳 茱萸鹼(EVO)、吳茱萸次鹼(rutaecarpine) 和檸檬苦素(limonin)溶在 dimethyl sulfoxide (DMSO)，濃度 100 mM；小蘗鹼溶在 50%甲醇，濃 度100 mM。質體(Plasmids) pAP1-Luc 和 pSV3-neo 分別購自

Stratagene (La Jolla, CA, USA) 和 ATCC。備製質體 DNA 的試劑是 Qiagen plasmid kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)。

3.1.2. 備製左金丸、黃連和吳茱萸的水性萃取物

左金丸、黃連和吳茱萸等科學中藥都是購自仙鹿藥品公司(臺灣)。

這些中藥的水萃物的備製是由沸水萃取水溶性且耐熱的化合物。過程 是200 克的藥材浸泡在蒸餾水 2000 毫升放在錐形瓶中加熱，錐形瓶 同時接上迴流裝置，方便冷卻蒸氣及回收藥品。再以715 g 離心 20 分鐘後，收集上清液，在室溫真空乾燥，乾燥粉末以蒸餾水泡成1 mg/ml。

3.1.3. 定性分析左金丸黃連吳茱萸的活性物質

使用Waters 生產的型號 2695 Alliance 高效液相層析儀(HPLC) (Waters, Milford, MA, USA)進行分析，內建有自動取樣及 2996 個光學

二極體探測器。吳茱萸鹼的分離的條件是以流速1 ml/min 和溶劑乙腈 acetonitrile/5 mM phosphoric acid (50:50, v/v)。分離吳茱萸鹼所使用層 析管的型號與廠牌是Merck Purospher STAR RP-18e (250 mm×4.6 mm, 5 µm)，在波長 254 nm 偵測出。分離小蘗鹼的移動相使用

acetonitrile/water (16:84, v/v)，溶液流速 0.8 ml/min，再以波長 280 nm 偵測。將上述條件通入Waters SunFire- C 18 column (150 mm ×4.6 mm, 5 µm)層析管進行分析，所有在吳茱萸鹼及小蘗鹼的比重都在相同的 條件下與標準品的校正曲線比較。

3.1.4. 細胞培養和 TPA 處理

HepG2/AP-1 及 HepG2/NF-κB 為兩組重組的肝母細胞瘤細胞株，

分別含有AP-1 或者 NF-κB 結合序列的冷光報導基因(luciferase)，建 構的方法參之前的文獻^{61, 155}。HepG2/AP-1 和 HepG2/NF-κB 細胞株 培養在含有10% FBS 的 DMEM。為測試 TPA 處理效果，先將細胞 株均勻分配到96 孔的培養皿中，放置在 37℃。24 小時後以 DMEM 清 洗，並單以DMEM 培養另外 24 小時。此時才以不同濃度的 TPA 刺 激上述的肝細胞16 小時或 24 小時。

3.1.5. 冷光酵素分析(Luciferase assay)

肝細胞株HepG2/AP-1 或 HepG2/NF-κB 分別在 25 毫升的培養皿 於37℃，培養 24 小時，用 DMEM 清洗，再以含 0.1%的胎牛血清的 DMEM 培養 24 小時。加入各種劑量或濃度的藥物或 TPA 在 37℃培 養16 小時。再以 4 毫升的冰冷的磷酸鹽緩充液 PBS(137 mM NaCl, 1.4 mM KH2PO4, 4.3 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, pH 7.2)沖洗細胞，加上 融解緩沖液400 微升，12000 xg, 4℃離心 2 分鐘。混合冷光酵素的受 質(Promega, Madison, WI, USA) 100 微升，隨即以冷光儀(FB15, Zylux, Huntsville, AL, USA)測定冷光酵素活性。相對的冷光酵素活性計算 Relative luciferase activity (RLU)等於藥物處理細胞吸光值除以溶劑處

理吸光值的商。50%的抑制濃度(IC₅₀)的計算是藥物抑制 50%冷光酵 素活性時的濃度¹⁵⁵。

3.1.6. 毒性測試 (Cytotoxicity Assay)

將細胞繼代到96 孔培養皿中，置於 5% CO2、37℃培養箱中，培 養24 小時後，再加入各種濃度的藥物，再培養 24 小時。細胞的毒殺 作用是測量3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide (MTT)比色法判讀。在培養液內加入體積的 1/10 的 5 mg/ml MTT，在 37℃培養 4 小時，加入等體積濃度 0.04 N HCl 的 isopropanol 溶液，以分光比色儀測定570 nm 的吸光值。細胞存活率% (Cell viability)的計算是(藥品處理後細胞的 OD 值 / 溶劑處理過的 OD 值)×100 計算。

3.1.7. Anchorage-independent growth assay

Anchorage-independent growth assays¹⁵⁶，操作過程如下：取 96 孔 培養皿，分別在各孔中加入濃度5 mg/ml 體積 50 µl poly

(2-hydroxyethyl methacrylate) [poly-(HEMA)]溶液，在 37℃下乾燥至少 兩天。亦即在培養皿上塗上poly-(HEMA)，觀察缺乏細胞外基質的狀 況下，細胞生長的情形。將平均每孔1×10³-2.5×10³個細胞分讓至 poly-(HEMA)培養皿中培養在 37℃、5% CO2 24 小時。再加入藥物處 理。經24 小時後，加入 MTT (5 mg/ml)，在 37℃、5% CO2下培養4 小時。再加入 0.04 N HCl 的 isopropanol 溶液，以 570 NM 測吸光值，

相對的細胞群形成(colony formation)可以公式(藥品處理後細胞的 OD 值 / 溶劑處理過的 OD 值)×100 計算。

3.1.8. 統計分析

數據的呈現以平均值±標準差。Student’s t test 用來比較各組間的 差異。當 p 值小於 0.05 為統計學的顯著差異。

第二節吳茱萸抑制肝癌細胞轉形之機轉