吳茱萸抑制肝癌細胞轉形之機轉

乾燥的未成熟吳茱萸果實分讓自順天堂藥廠股份有限公司。

3.2.2. 吳茱萸各種溶劑的萃取⁹²

1. 酸性乙醇萃取物：將吳茱萸 30 公克加入 100 毫升的酸性乙醇 中，在室溫中萃取24 小時，再經-30℃冷凍解凍一次，此即酸性乙醇 萃取物後，烘乾並測量其溶質乾重。

2. 乙醇萃取物：將吳茱萸 30 公克加入 100 毫升的酸性乙醇中，

在室溫中萃取24 小時，再經-30℃冷凍解凍一次，此即酸性乙醇萃取 物後，烘乾並測量其溶質乾重。

3. 甲醇萃取物：將吳茱萸 30 公克加入 100 毫升的甲醇中，在室 溫中萃取24 小時，再經-30℃冷凍解凍一次，此即甲醇萃取物後，烘 乾並測量其溶質乾重。

4. 水萃取物：將吳茱萸 30 公克加入 100 毫升的水中，在室溫中 萃取24 小時，再經-30℃冷凍解凍一次，此即水萃取物，烘乾並測量 其溶質乾重。

5. 熱水萃取物：將水 100 毫升加熱至 60℃，10 分鐘後再加入吳 茱萸30 公克，置於室溫中萃取 24 小時，-30℃冷凍解凍一次，此即 得沸水萃取物，烘乾並測量其溶質乾重。

3.2.3. 細胞培養

肝細胞株為Chang/AP-1 重組細胞株，這株細胞分別為含有 AP-1 結合序列/報導基因(luciferase)的 Chang liver 細胞^{36, 155}，因此可藉由 測定luciferase 的活性，評估 AP-1 的活性。重組細胞主要培養在含有 10%胎牛血清(HyCloneR)的 DMEM (Life Technologies)中。

3.2.4. Stable transfection 和 G418 selection

將上游含有AP-1 序列及 TATA box，下游帶有 luciferase 為報導基 因之質體¹⁵⁷，與帶有 Neomycin（G418）抗藥性基因之質體─pSV3 neo¹⁵⁸，利用 Superfect（QIAGEN）送進 Chang liver 和 HepG2 細胞，

48 小時後，持續於細胞培養基中加入 400 µg/ml G418 進行篩選。最 後藉由luciferase assay 選出 luciferase 活性最強者為實驗細胞株，並 重新命名為Chang/AP-1 和 HepG2/AP-1 重組細胞。

3.2.5. 穩定的轉殖 Stable transfection

質體pAP1-Luc 包含冷光基因和 AP-1 結合序列，都以 AlwNI 限 制酵素處理後重組^[61]。細胞同時 transfected 2.5 µg linear pAP1-Luc DNA 和 2.5 µg EcoRI linearizedpSV3-neo DNA 使用 SuperFectR transfection 試劑(Qiagen)。經 48 小時後，以 G-418 (400 µg/mL)篩選 細胞。單一clone 可以經有限稀釋及冷光酵素測驗。選出 clone 具表 現度高的冷光活性，即為 Chang/AP-1 細胞株。重組細胞株以含 10%

胎牛血清及400 µg/mL G-418 的 DMEM 培養。

3.2.6. Anchorage-independent transformation assay

Anchorage-independent growth assays 的操作過程如下：取 96 孔培 養皿，分別在各孔中加入濃度5 mg/ml 體積 50 µl poly (2-hydroxyethyl methacrylate) [poly-(HEMA)]溶液，在 37℃下乾燥至少兩天。亦即在 培養皿上塗上poly-(HEMA)，觀察缺乏細胞外基質的狀況下，細胞生 長的情形。將平均每孔1×10³-2.5×10³個細胞分讓至 poly-(HEMA)培 養皿中培養在37℃、5% CO₂ 24 小時。再加入藥物處理。經 24 小時 後，加入MTT (5 mg/ml)，在 37℃、5% CO₂下培養4 小時。再加入 0.04 N HCl 的 isopropanol 溶液，以 570 NM 測吸光值，相對的細胞群

形成(colony formation)可以公式(藥品處理後細胞的 OD 值 / 溶劑處 理過的OD 值)×100 計算 ¹⁵⁶。

3.2.7.冷光酵素活性的測定

Chang/AP-1 細胞 (1×10⁴) 培養在 96 孔培養盤，37 °C 24 小時，

以DMEM 清洗後，再以 0.1% FBS 的 DMEM 培養 24 小時。加入各 種劑量的化合物在37 °C for 48 小時。再以 4 毫升的冰冷的磷酸鹽緩 充液PBS(137 mM NaCl, 1.4 mM KH2PO4, 4.3 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, pH 7.2)沖洗細胞，加上融解緩沖液 350 微升 (50 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100 和 1 mM dithiothreitol, pH 7.8) 12000 × g，4 °C 離心 2 分鐘。取細胞萃取液 20 微升、混合冷光酵素的受質 (Promega, Madison, WI, USA) 100 微升，隨即以冷光儀(FB15, Zylux, Huntsville, AL, USA)，測定冷光酵素活性。相對的 AP-1 活性以 relative light unit (RLU) 表示，等於藥物處理的細胞吸光值除以溶劑吸光值的商。50%

抑制濃度(EC₅₀) 的計算是藥物抑制 50%冷光酵素活性時的濃度。

3.2.8. 毒性測試 (Cytotoxicity Assay)

將細胞繼代到96 孔培養皿中，置於 5% CO2、37℃培養箱中，培 養24 小時後呈單層 confluent cell 時，再加入各種濃度的藥物，再培 養24 小時。細胞的毒殺作用是測量

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)比 色法判讀。在培養液內加入體積的1/10 的 5 mg/ml MTT，在 37℃培 養4 小時，加入等體積濃度 0.04 N HCl 的 isopropanol 溶液，以分光 比色儀測定570 nm 的吸光值。細胞存活率% (Cell viability)的計算是 (化合物處理後細胞的 OD 值 /溶劑處理後細胞的 OD)×100。

3.2.9. 細胞存活率試驗

將細胞培養在96 孔培養盤中置於 37℃、5% CO₂培養箱中24 小 時，加入中藥刺激，再分別加入MTT 染料及 0.1% SDS-HCl，最後利 用570 nm 波長偵測吸光值量的變化，若是吸光度愈高，表示細胞活 性愈佳，反之則表示細胞活性愈低。

3.2.10. 西方墨點分析法(Western blotting)

在37 °C 下，將 Chang/AP-1 細胞培養在 25 cm²錐形瓶24 小時，

以DMEM 清洗，再加入含 0.1% FBS 的 DMEM 後，再培養 24 小時。

在不同的時段加入 TPA 處理，再以 PBS 清洗後，以 250 µL sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10% glycerol, 50 mM dithiothreitol 和 0.1% bromophenol blue)解離細 胞。細胞均質液(cell lysate)的蛋白質濃度以 Bradford 法測定。蛋白質 (15–20 µg) 以 10% SDS -polyacrylamide 膠 體 電 泳 且 電 轉 至 nitrocellulose 膜(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)。

膜先用blocking buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.1%

Tween-20 和 5% skim milk powder) 處 理 ， 再 以 anti-JNK 、 anti-phospho-JNK 、 anti-p38 、 anti-phospho-p38 、 anti-ERK 及 anti-phospho-ERK 等抗體探測 (Cell Signaling, Beverly, MA, USA)。

這 些 已 結 合 的 抗 體 用 horseradish 的 過 氧 化 酵 素 結 合 anti-mouse antibody 偵 測 。 接 著 用 化 學 冷 光 (ECL System, Amersham, Buckinghamshire, UK) 和 X 光片曝光顯影。

3.2.11. 統計分析

數據的呈現以平均值±標準差。Student’s t test 用來比較各組間的 差異。當 p 值小於 0.05 為統計學的顯著差異。