第四章 結果與討論
第三節 乳酸菌培養基上清液抑制腸炎沙門氏菌生長之試驗結
各試驗乳酸菌株於培養期間之pH 值變化如圖 4.6 所示。在圖 4.6 顯示
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圖4.6、各試驗乳酸菌株培養基上清液之 pH 值變化曲線圖。*為各試驗天
數之pH 值與第 0 天之 pH 值相比後達到統計上之顯著性差異( p <
0.05)
Fig. 4.6. pH change curves of the tested LAB-SCS during one weeks’
cultivation. * Significantly different from day 0 (p < 0.05) Time (days)
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菌株在培養後的第 1 天，其 pH 值即顯著下降(p < 0.05)，其中以 L.
bulgaricus、L. acidophlius、B. bifidum 下降較快，而到了第 3 天後，各試驗 菌株的 pH 值都已完全下降且趨於穩定。另外亦可發現在 S. inulinus
、
L.bulgaricus 及 L. acidophilus 的生長培養基所測得的 pH 值是最低的，且 S.
inulinus 生長培養基測得的 pH 值與 Lactobacillus spp.最為接近。
3-2 乳酸菌生長之乳酸產量變化
乳酸菌生長時會分泌有機酸，其中以乳酸的含量最多，將不同培養天
數之乳酸菌培養基上清液以0.1 N NaOH 標準溶液滴定，並計算所得之有機
酸量(%)，以乳酸表示之，其結果如圖 4.7 所示。由圖 4.7 可知大部份的試
驗菌株在培養後第 2～3 天其乳酸產量即達最高峯，之後便趨於穩定，而
L. acidophilus 則是在培養後第 4 天其乳酸量才逹最高。另外也發現 S.
inulinus、L. bulgaricus 和 L. acidophilus 有最高的乳酸產量，且 S. inulinus 的乳酸產量與 Lactobacillus spp.最接近。L. bulgaricus 在培養後第 1 天即有 高量的乳酸產生，故該菌常於乳品工業發酵中作為菌酛使用(Kitazawa et al., 2003; Ravin and Alatossava, 2003; Serror et al., 2003)。
3-3 乳酸菌培養基上清液之抑菌圈試驗結果
收集各試驗乳酸菌株於生長培養期間的培養基上清液，之後進行well
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Time (days)
0 1 2 3 4 5 6 7
Lactic acid content (%)
0.0
Fig. 4.7. Changes in lactic acid production of the tested LAB during one weeks’
cultivation. * Significantly different from day 0 (p < 0.05)
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diffusion assay，觀察其抑制 S. enteritidis 生長所形成的抑菌圈大小(mm)，
結果如表 4.3 和圖 4.8、4.9 所示。由結果可看到 L. acidophilus、L. bulgaricus 及 Bifidum 在培養後第 1 天所收集的上清液即有抑菌圈產生，S. inulinus 和 B. longum 則是在第 2 天所收集的上清液才開始有抑菌圈的形成，然而由表 4.3 可發現所有試驗之乳酸菌株培養第 4～5 天所收集的上清液，其所形成 的抑菌圈即開始維持固定的最大值，故在之後的抑菌實驗中，皆使用培養 5 天後的上清液；另外本試驗也發現 S. inulinus、L. bulgaricus、L. acidophilus 所收集的培養基上清液具有較佳的抑菌效果。
3-4 乳酸菌培養基上清液之抑菌成份探討
為了瞭解各試驗乳酸菌的培養基上清液之抑菌成份，是菌株所分泌之 乳酸的作用亦或者是所分泌抑菌素(bacteriocins)的影響，故分別進行上清液 中和試驗、酵素作用及加熱處理試驗。
3-4-1 培養基上清液經 NaOH 中和後之抑菌圈大小
將收集的培養基上清液，以 NaOH 中和之後，其抑菌圈的大小(mm)
顯示在表4.4。由結果可發現在經 NaOH 中和後的培養基上清液皆失去抑制
S. enteritidis 生長的效果，因此推測影響培養基上清液抑菌效果的因素，即
有可能是培養基上清液中所含的乳酸或是其 pH 值的降低所造成的抑菌效
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表4.3、各試驗乳酸菌株於培養期間之培養基上清液抑制 S. enteritidis 生長 所形成的抑菌圈大小
Table 4.3. Diameter of inhibition zone of tested LAB-SCS revealing the inhibition activity toward the growth of S. enteritidis during 7 days’
cultivation
* Inhibition zone (mm) (9 mm: the diameter of the punctured hole).
a-d Different letters within a column significantly differ at 5% level, n = 3.
Time (day) Strain
0 1 2 3 4 5 6 7 S. inulinus 9.0 a* 9.0 d 14.4 b 16.1 a 16.4 a 16.5 a 16.4 a 16.4 a L. acidophilus 9.0 a 13.4 b 14.3 b 15.1 b 15.1 b 15.1 b 15.0 b 15.0 b L. bulgaricus 9.0 a 15.2 a 16.4 a 16.4 a 16.4 a 16.4 a 16.4 a 16.3 a B. bifidum 9.0 a 12.9 c 13.0 c 12.9 c 12.9 c 12.9 c 12.8 c 12.9 c B. longum 9.0 a 9.0 d 12.8 d 12.8 c 12.8 c 13.0 c 12.8 c 13.0 c
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圖4.8、各試驗乳酸菌株 0～3 天之培養基上清液抑制 S. enteritidis 生長之情 形(A)第 0 天；(B)第 1 天；(C)第 2 天；(D)第 3 天之培養基上清液。
透明區域為上清液所形成之抑菌圈
Fig. 4.8. Inhibition zones (clear areas) of the tested LAB-SCS revealing the inhibition activity toward the growth of S. enteritidis during 3 days’
cultivation. A-D indicates the SCS obtained at (A) day 0; (B) day 1;
(C) day 2; (D) day 3
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圖4.9、各試驗乳酸菌株 4～7 天之培養基上清液抑制 S. enteritidis 生長之情 形(A)第 4 天；(B)第 5 天；(C)第 6 天；(D)第 7 天之培養基上清液。
透明區域為上清液所形成之抑菌圈
Fig. 4.9. Inhibition zones (clear areas) of the tested LAB-SCS revealing the inhibition activity toward the growth of S. enteritidis during 3 days’
cultivation. A-D indicates the SCS obtained at (A) day 4; (B) day 5;
(C) day 6; (D) day 7
L. acidophilus L. acidophilus
S. inulinus
L. bulgaricus L. bulgaricus
L. bulgaricus
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表4.4、各試驗乳酸菌株之培養基上清液經 NaOH 中和後之抑制 S. enteritidis 生長所形成的抑菌圈大小
Table 4.4. Diameter of inhibition zone of the 5 days’ cultivated LAB-SCS revealing the inhibition activity toward the growth of S. enteritidis before and after neutralized by the NaOH solution
* 9 mm: the diameter of the punctured hole. No clear area of inhibition zone was found.
Inhibition zone (mm) Strain
SCS before neutralization Neutralized SCS
S. inulinus 16.5 9 *
L. acidophilus 15.1 9
L. bulgaricus 16.4 9
B. bifidum 12.9 9
B. longum 13.0 9
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果。
3-4-2 培養基上清液經蛋白酶作用後之抑菌圈大小
圖4.10 為各試驗乳酸菌株的培養基上清液經各種蛋白酶作用後之抑制
S. enteritidis 生長的抑菌圈大小，結果發現各培養基上清液經酵素作用後其 抑制效果與控制組(未以蛋白酶處理者)比並無明顯改變，因此推測其培養 基上清液的抑菌成份可能是非胜肽類的抑菌素(bacteriocins)或是其他非胜 肽類的抑菌物質。
3-4-3 培養基上清液經加熱處理後之抑菌圈大小
各試驗乳酸菌之培養基上清液經加熱處理後其抑制 S. enteritidis 生長
的抑菌圈大小變化顯示在圖 4.11、4.12。由結果可知各乳酸菌之培養基上
清液經各種不同溫度條件加熱處理後，其上清液的抑菌效果仍然存在，且 與未經加熱處理的控制組相較，其抑菌圈大小並無顯著性差異存在，因此 推 測 培 養 基 上 清 液 中 所 含 的 抑 菌 成 份 應 為 熱 安 定 性 物 質(heat-stable substance)。
3-4-4 培養基上清液之乳酸成份抑菌試驗結果
由結果 3-4-1, 3-4-2, 3-4-3 可知乳酸菌培養基上清液經 NaOH 中和後其 抑菌效果即消失，而當以蛋白酶或是加熱處理之後，其培養基上清液的抑
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圖 4.10、各試驗乳酸菌株之培養基上清液以蛋白酶作用後其抑制 S.
enteritidis 生長的抑菌圈大小。* NS 為試驗組與控制組之間無顯 著性差異
Fig. 4.10. Diameter of inhibition zone of the LAB-SCS after the protease treatment. * NS: not significantly different from the control
SCS of various strains
S. inulinus L.acidophilus L. bulgaricus B. bifidum B. longum
Inhibition zone (mm)
10 12 14 16
18 control
chymotrypsin trypsin proteinase K pepsin
NS*
NS
NS
NS NS
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SCS of various strains
Inhibition zone (mm)
圖4.11、各試驗乳酸菌株之培養基上清液經加熱處理後其抑制 S. enteritidis 生長的抑菌圈大小。NS 為試驗組與控制組之間無顯著性差異 Fig. 4.11. Diameter of inhibition zone of the LAB-SCS after the heat treatment.
* NS: not significantly different from the control
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C D
A B
E
圖4.12、各試驗乳酸菌株之培養基上清液經不同溫度條件處理後抑制 S. enteritidis 生長
之情形(A) S. inulinus; (B) L. acidophilus; (C) L. bulgaricus; (D) B. bifidum; (E) B.longum
Fig. 4.12. Inhibition zones (clear areas) of the tested LAB-SCS reavaling the inhibition activity toward S. enteritidis (A) S. inulinus; (B) L. acidophilus; (C) L.
bulgaricus; (D) B. bifidum; (E) B. longum
121℃, 15 min
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菌效果卻不受影響，故由以上的實驗證據顯示各試驗乳酸菌株之培養基上
清液中的抑菌成份可能為乳酸或是 pH 值的降低所致。為了進一步探討抑
菌效果是乳酸亦或是 pH 值(H+)的作用，故比較(1)培養基上清液(pH 3.69) 與(2)單獨添加乳酸於培養基(其添加量等於控制組培養基上清液中的乳酸 含量，pH 3.69)以及(3)使用 HCl 調酸至 pH 3.69 的培養基(相當於培養基上 清液中的pH 值)，試驗其抑制 S. enteritidis 生長的效果，並以 pH 6.8 的 MRS broth 作為控制組，其結果如圖 4.13 所示。
由圖4.13 發現控制組(MRS broth, pH 6.8)完全無法抑制 S. enteritidis 的 生長，而不論是培養基上清液(SCS, 0.192 mmole lactate/ml, pH 3.69)或是單 獨添加乳酸的培養基(0.192 mmole L(+)或 D (-)-lactate/ml, pH 3.69)都可以在 培養l hr 之後完全抑制 S. enteritidis 的生長，而以 HCl 調酸的培養基(pH 3.69) 雖然也可抑制 S. enteritidis 的生長，但其抑制效果並不如培養基上清液或是 單獨添加乳酸的培養基來得好，因此推測影響培養基上清液的抑菌成份不
單純只是pH 值的降低(H+的作用)而已，而可能是該菌株所分泌的乳酸發揮
其抑菌效果；另外，本試驗亦推論有機酸(如乳酸)的抑菌效果比鹽酸等無 機酸來得好。
乳酸菌在腸胃道中可抑制有害微生物或是食物中毒菌(如沙門氏菌、李 斯特菌)的生長(Huges and Hoover, 1991; Lim et al., 1993; Hudault et al., 1997
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Time (hr)
0 1 2 3 4
Log viable counts CFU / ml
0 (control, pH 6.8)；○：MRS broth (pH 3.69)；▼：MRS broth〔0.192 mmole L (+)-lactate/ml, pH 3.69〕；▽：MRS broth〔0.192 mmole D (-)-lactate/ml, pH 3.69〕；▓：S. inulinus 之培養基上清液(SCS) (0.192 mmole/ml lactate, pH 3.69)。*表 S. enteritidis 之存活菌數與啟始(0 hr)菌數比較時逹顯著性差異(p < 0.01)
Fig. 4.13. LAB-SCS factors affecting the growth of S. enteritidis. ●: MRS broth (control, pH 6.8); ○: MRS broth (pH 3.69); ▼: MRS broth〔0.192 mmole L (+)-lactate/ml, pH 3.69〕; ▽: MRS broth〔0.192 mmole D (-)-lactate/ml, pH 3.69〕; ▓: S. inulinus-SCS) (0.192 mmole lactate/ml, pH 3.69). * Differ significantly compared with the initial (0 hr) viable count (p < 0.01)
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; Tsai et al., 2005; de Carvalho et al., 2006)，此種功效乃歸因於菌株代謝所產 生的酸(Midolo et al., 1995; Røssland et al., 2005)、抑菌素(bacteriocins) (Tagg et al., 1976; Cleveland et al., 2001; Forestier et al., 2001)或是乳酸菌與病原菌 競爭生長(Gurr, 1987; Chauviere et al., 1992)及增強宿主免疫力(Fuller, 1992) 等的作用。
乳酸菌代謝產生乳酸、醋酸等有機酸，有文獻指出有機酸比無機酸具 有更強的殺菌能力(Asahara et al., 2004)，其原因為這些有機酸的蓄積會導致 pH 值的下降，如此可降低腸道微生物的活性(Rasic and Kurmann, 1983;
Gilliland, 1989; Vandenbergh et al., 1993)，但是 pH 值的下降並非抑菌的主要 因素，其最主要抑菌機制乃是因為屬於弱酸的有機酸只有部份解離，在細 菌細胞外之未解離酸因不帶電荷，故可穿透過細胞膜進入細胞中，當在進
入 pH 值較高的細胞質中即進行解離作用，釋出大量的質子(proton)，使細
菌細胞質酸化，進而達到抑菌作用(Ogawa et al., 2001b; Asahara et al., 2004)。另有文獻指出解離態有機酸陰離子(anion)的蓄積也可能對菌體造成 毒性，導致有害微生物的死滅(Russell, 1991)，而未解離的有機酸其抑菌效
力是解離有機酸的 10～600 倍，因此未解離的乳酸、醋酸具有高度的抗菌
能力(Eklund, 1983; Brocklehurst and Lund, 1990; Helander et al., 1997)。
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