乳酸菌拮抗病原菌之吸附試驗結果

第四章結果與討論

第四節乳酸菌拮抗病原菌之吸附試驗結果

4-1 乳酸菌預防腸炎沙門氏菌侵襲腸道細胞之潛在功效

將乳酸菌預先吸附於Caco-2 cells 上，再加入螢光染色之 S. enteritidis，

所得乳酸菌預防 S. enteritidis 吸附之結果如圖 4.14 所示。由結果得知 S.

inulinus 及其各試驗菌株皆可顯著地預防 S. enteritidis 對 Caco-2 cells 的吸 附，因此可推論 S. inulinus 和各試驗菌株應能有效預防 S. enteritidis 對腸道

細胞之侵襲，圖4.15 為其螢光染色之觀察圖，可看到預先以乳酸菌定殖者

其 S. enteritidis 螢光強度皆減弱。

此外，另將螢光染色之試驗乳酸菌株先行吸附於 Caco-2 cells 上，之後 再加入病原菌 S. enteritidis，以探討 S. enteritidis 對乳酸菌吸附性之影響，

其結果如圖 4.16 所示。由圖中可看到已吸附於 Caco-2 cells 的試驗乳酸菌 株，S. inulinus、L. acidophilus 及 B. bifidum 並不會因為 S. enteritidis 的加入 而影響其吸附性，而 L. bulgaricus、B. longum 則因加入 S. enteritidis 而使其 吸附性與控制組(未加入 S. enteritidis 者)相較有顯著性的降低，在所有試驗 乳酸菌株中又以 L. bulgaricus 的吸附性降低最為顯著，由此可知 S.

inulinus、L. acidophilus 及 B. bifidum 不會受到病原菌 S. enteritidis 的影響而 降低其對腸道細胞的定殖。另外，在圖 4.17 亦可觀察到 S. inulinus、L.

acidophilus 及 B. bifidum 在加入 S. enteritidis 前後之螢光強度並無變化。

Pre-adhered LAB Adhesion of S. enteritidis (%)

圖4.14、預先吸附於 Caco-2 cells 上之乳酸菌預防螢光染色之 S. enteritidis 對Caco-2 cells 吸附之試驗結果。*為各試驗組與控制組(未預先吸附乳酸菌者)相比後達到統計上之顯著性差異(p < 0.05)；各試驗組標示之字母a，表示彼此之間不具顯著性差異 (p > 0.05)

Fig. 4.14. Preventive effects of the tested LAB pre-adhered to Caco-2 cells upon the FITC-labeled S. enteritidis adhesion. * Significantly different from the control (not pretreated with LAB) (p < 0.05). All tested LAB do not differ significantly with each other and are all marked with the letter of “a” (p > 0.05)

A

C

B

F D

E

圖4.15、預先吸附於 Caco-2 cells 上的乳酸菌預防螢光染色 S. enteritidis 吸附之螢光顯微照像圖。

(A)為控制組，未預先以乳酸菌處理；(B)預先以 S. inulinus 處理；(C)預先以 L. acidophilus 處理；(D)預先以 L. bulgaricus 處理；(E)預先以 B. bifidum 處理；(F)預先以 B. longum 處理

Fig. 4.15. Fluorescent microscopic schemes representing the preventive effects of the tested LAB pre-adhered to Caco-2 cells upon the S. enteritidis adhesion. (A) control, not pretreated with LAB; and LAB pre-adhered to Caco-2 cells with (B) S. inulinus; (C) L. acidophilus; (D) L.

bulgaricus; (E) B. bifidum; (E) B. longum, respectively

FITC -labeled LA B

Adhesion of LAB (%)

control S. inulinus L. acidophilus L. bulgaricus B. bifidum B. longum

ab a

ab ab

圖 4.16、S. enteritidis 對螢光染色乳酸菌吸附性的影響。*為各試驗組與控 制組相比後達到統計上之顯著性差異(p < 0.05)；試驗組標示字母不同者表示彼此間有顯著性差異(p < 0.05)

Fig. 4.16. Influence of S. enteritidis on the adhesion of FITC-labeled LAB.

Tested LAB not marked with the same letter differ significantly with each other (p < 0.05). * Significantly different from the control (not treatred with S. enteritidis) (p < 0.05)

A1 A2

B1 B2

C1 C2

圖4.17、S. enteritidis對預先吸附於Caco-2 cells上之螢光染色乳酸菌吸附性影響之螢光顯微照相圖。(A1), (A2)：FITC-labeled S. inulinus；(B1), (B2)：FITC-labeled L. acidophilus；(C1), (C2)：FITC-labeled L. bulgaricus；左圖：(A1)～(C1)為未加入S. enteritidis之控制組，右圖 (A2)～(C2)為加入S. enteritidis處理之試驗組

Fig. 4.17. Fluorescent microscopic schemes representing the influence of S. enteritidis on the adhesion of the pre-adhered LAB to Caco-2 cells. (A1), (A2): FITC-labeled S. inulinus; (B1), (B2):

FITC-labeled L. acidophilus; (C1), (C2): FITC-labeled L. bulgaricus. Schemes on the left side of (A1)~(C1): the control (not added in S. enteritidis); schemes on the right side of (A2)~(C2): the treatment group (added in S. enteritidis)

續圖4.17、S. enteritidis對預先吸附於Caco-2 cells上之螢光染色乳酸菌吸附性影響之螢光顯微照相圖。(D1), (D2)：FITC-labeled B. bifidum；(E1), (E2)：FITC-labeled B. longum；左圖：(D1), (E1)為未加入S. enteritidis之控制組，右圖(D2), (E2)為加入S. enteritidis處理之試驗組

Continued Fig. 4.17. Fluorescent microscopic schemes representing the influence of S. enteritidis on the adhesion of the pre-adhered LAB to Caco-2 cells. (D1), (D2)：

FITC-labeled B. bifidum; (E1), (E2)：FITC-labeled B. longum. Schemes on the left side of (D1), (E1): the control (not added in S. enteritidis); schemes on the right side of (D2), (E2): the treatment group (added in S. enteritidis)

B D1

E2 E1

D2

病原菌沙門氏菌會吸附並侵入腸道細胞(Finlay and Falkow, 1990;

Gahring et al., 1990; Giannasca et al., 1996)，而該菌株在侵襲腸道細胞之前，會先吸附於腸道細胞上再侵入其中進而造成致病性(Beachey, 1981;

Finlay and Falkow, 1997)，因此若是能抑制沙門氏菌的吸附，當能有效預防沙門氏菌感染 (Lehto and Salminen, 1997)。在本研究中發現事先定殖 S.

inulinus 及其他所試驗之乳酸菌於 Caco-2 cells 上皆能有效預防 S. enteritidis 對模擬腸道細胞之侵襲。

乳酸菌因可以抑制許多腸病原菌的生長，目前已廣泛應用於人體及動物用以治療胃腸道的疾病(Rolfe, 2000)。在生體外試驗，Coconnier et al.

(1992) 觀察到 lactobacilli 會排斥腸毒素型大腸桿菌 (enterotoxigenic Escherichia coli)對 Caco-2 cells 的吸附；Fernández et al. (2003)和 Matijašic et al. (2006)的研究中預先將 L. gasseri 吸附於 Caco-2 cells 上，也能大幅的降 低 E. coli 對 Caco-2 cells 的吸附；而在生體內試驗方面，Asahara et al. (2005) 預先給予無特定病原菌的小鼠口服 B. breve strain Yakult (1×10⁸～3×10⁸ CFU/day)，之後再以腸毒素型 E. coli O157: H7 處理，結果發現預先以 B.

breve 菌株定殖的小鼠，其存活率良好且腸道毒素產量與未預先以 B. breve 定殖的控制組相比也都有顯著性的降低，這些證據皆顯示乳酸菌的預先定殖可減少病原菌的感染機會，對宿主腸道具有防禦之功能。

4-2 乳酸菌及其培養基上清液抑制腸炎沙門氏菌吸附於腸道細胞之結果 先將螢光染色之病原菌 S. enteritidis 預先吸附於 Caco-2 cells 上，再加 入各試驗乳酸菌的培養基上清液或其菌體，探討上述二者對 S. enteritidis 吸附性的影響，結果如 4.18、4.19 所示。圖 4.18 為以培養基上清液處理者，

而圖4.19 則是以乳酸菌之菌體處理者，結果可發現不論是各試驗之乳酸菌

培養基上清液或其菌體處理，皆可顯著降低 S. enteritidis 對 Caco-2 cells 的 吸附。在圖4.19 更發現到 S. inulinus 比其他試驗乳酸菌株更能有效地抑制 S. enteritidis 吸附於 Caco-2 cells 上，而 L. acidophilus、B. bifidum、B. longum 等菌株也都有不錯的抑制吸附能力，其中 L. bulgaricus 雖然也能有效抑制 S. enteritidis 的吸附，但其效果不如其他試驗菌株來得好，由圖 4.18、4.19 亦發現 L. bulgaricus 之培養基上清液抑制 S. enteritidis 吸附於 Caco-2 cells 之能力比其菌體的作用效果為佳(p < 0.05)。圖 4.20～4.24 則是各試驗乳酸 菌的培養基上清液或其菌體干擾 S. enteritidis 吸附性結果之螢光顯微照相 圖，各圖的結果均顯示不論是乳酸菌培養基上清液(B)或菌體處理組(C)，

都可使螢光染色的 S. enteritidis (A)螢光強度減弱。

當感染沙門氏菌時，該菌會先吸附而後侵入腸道細胞中(Finlay and Falkow, 1990; Gahring et al., 1990; Giannasca et al., 1996)，因此益生菌若是能干擾沙門氏菌的吸附，可能就能用以治療因沙門氏菌所造成的感染。而

SCS of tested LAB

Adhesion of S. enteritidis (%)

圖4.18、乳酸菌培養基上清液對螢光染色之 S. enteritidis 吸附性的影響。*

為各試驗組與控制組相比後達到統計上之顯著性差異(p < 0.05)；

各試驗組標示之字母a，表示彼此之間不具顯著性差異 (p > 0.05) Fig. 4.18. Effects of the tested LAB-SCS on the adhesion of pre-adhered

FITC-labeled S. enteritidis. * Significantly different from the control (not treated with the LAB-SCS) (p < 0.05). All tested LAB do not differ significantly with each other and are all marked with the letter of “a” (p > 0.05)

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圖4.24、B. longum 及其培養基上清液降低 S. enteritidis 對 Caco-2 cells 吸附性之螢光顯微照 相圖。(A) 為 S. enteritidis ( 未添加 B. bifidum-SCS 或其菌體 ) ； (B) 添加 B.

longum-SCS；(C)添加 B. longum 菌體

Fig. 4.24. Fluorescent microscopic schemes representing the inhibition effects of the SCS and cells of B. longum on the adhesion of S. enteritidis. (A) FITC-labeled S. enteritidis (control), (B) FITC-labeled S. enteritidis treated with B. longum-SCS, and (C) FITC-labeled S. enteritidis treated with cells of B. longum

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在本研究中發現 S. inulinus 及其所有試驗乳酸菌株不論是培養基上清液抑 或是菌體本身都能顯著地抑制 S. enteritidis 對 Caco-2 cells 的吸附，因此於 臨床應用具有治療 S. enteritidis 感染的潛力。

許多文獻指出乳酸菌或其培養基上清液具有抑制病原菌吸附及防止其侵襲腸道上皮細胞的能力(Blomberg et al., 1993; Bernet et al., 1994; Spencer and Chesson, 1994; Ouwehand and Conway, 1996; Tuomola et al., 1999;

Fujiwara et al., 2001) 。在生體外試驗中， Tasi et al. (2004) 提出 E.

faeciumTM39 不論是菌體本身或是其培養基上清液皆可有效抑制 Helicobacter pylori (BCRC 17021, OUI 141)對胃腺癌細胞(TSGH 9201)的吸 附，而Gopal et al. (2001)則是以 L. acidophilus HN017、L. rhamnosus DR20、

B. lactis DR10 之培養基上清液處理吸附於模擬腸道黏膜細胞 (HT-29, Caco-2, HT29-MTX)上的 E. coli O157: H7，結果亦發現上述上清液皆能有 效降低該病原菌對細胞的吸附與侵入性，另外Sgouras et al. (2004)從生體內 試驗亦發現口服益生菌 L. casei strain Shirota 可有效降低定殖於胃黏膜上 H. pylori SS1 的量。由本研究以及前人的文獻可知，乳酸菌如應用於臨床 上應可藉由改善腸胃道菌相而有助於疾病的緩解與治療。

在文檔中菊糖有孢子乳桿菌潛在益生功效的研究; Studies on the Potential Probiotic Effects of Sporolactobacillus inulinus BCRC 14647 (頁 107-122)

第四章 結果與討論

第四節 乳酸菌拮抗病原菌之吸附試驗結果

A

C

B

F D

E