第四章 結果與討論
第二節 乳酸菌耐酸、耐膽鹽與模擬腸道吸附性
試驗乳酸菌株以pH 2, 3, 4 酸液分別處理 1.5 和 3.0 hr 之菌株存活率如 表4.1 所示。由表 4.1 中可看到在相同處理條件之下，孢子形態之 S. inulinus 比營養細胞形態的 S. inulinus、B. bifidum 及 B. longum 具有較高的存活率(p
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A
B
圖4.1、孢子染色 S. inulinus 之光學顯微照相圖。(A)營養細胞形態；(B)孢 子形態(放大倍率 2,000×)
Fig. 4.1. Vegetative cells (A) and spores (B) of S. inulinus. The former (A) were Gram stained and the spores (B) were stained by spore-staining. Both were observed under a light microscope (magnification 2,000×)
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表4.1、試驗乳酸菌株以 pH 2, 3, 4 酸液分別處理 1.5 和 3.0 hr 後之存活率
Table 4.1. Survival rates (%) of tested strains treated with acid in different incubation times (1.5, 3.0 hr) at the same pH values of pH 2, pH 3 and pH 4, respectively
S: Spore form, V: Vegetative cell form.
** a-f Different letters within a column significantly differ at 5% level, n = 3.
** x-y Different letters within a row of the same pH value significantly differ at 5% level, n = 3.
pH 2 pH 3 pH 4
Strain
1.5 hr 3.0 hr 1.5 hr 3.0 hr 1.5 hr 3.0 hr
S. inulinus (S)* 64.5 ± 2.0 cx** 44.8 ± 0.2 cy 88.3 ± 1.0 bx 78.9 ± 0.8 cy 94.2 ± 0.6 bx 91.7 ± 1.3 by S. inulinus (V) 15.4 ± 1.0 fx 0.0 ± 0.0 ey 27.6 ± 0.3 ex 19.5 ± 1.6 ey 71.2 ± 1.3 cx 55.0 ± 1.3 ey
L. acidophilus 90.3 ± 1.5 ax 68.8 ± 1.0 ay 98.1 ± 1.0 ax 95.6 ± 0.9 ay 98.2 ± 1.3 ax 97.0 ± 0.3 ax
L. bulgaricus 78.3 ± 3.4 bx 52.1± 1.4 by 88.7 ± 2.3 bx 83.9 ± 1.1 by 95.2 ± 2.9 abx 90.0 ± 1.4 bx
B. bifidum 42.5 ± 4.9 ex 0.0 ± 0.0 ey 65.9 ± 1.5 cx 0.0 ± 0.0 fy 74.5 ± 1.6 cx 58.1 ± 1.3 dy
B. longum 49.7 ± 1.9 dx 29.0 ± 2.6 dy 62.6 ± 1.7 dx 32.5 ± 0.8 dy 94.6 ± 3.9 abx 74.2 ± 3.2 cy
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< 0.05)，然而在所有試驗菌株中，以 L. acidophilus 和 L. bulgaricus 呈現高
度的耐酸性。在同一 pH 值之下，較長的作用時間(3.0 hr)均會使各試驗菌
株的存活率明顯降低(p < 0.05)，而在 pH 4 的酸液中無論作用 1.5 或 3.0 hr，
L. acidophilus (98.2% vs 97.0%)和 L. bulgaricus (95.2% vs 90.0%)的存活率並 無明顯變化，由此可知本研究所使用之 Lactobacillus spp.的耐酸性比其他試 驗菌株佳。
在 Hyronimus et al. (2000)的研究曾探討多種產孢性乳酸菌－S. inulinus CIP103279, NCFB1839, DSM30348 等對酸液的耐受性，其結果與本研究所 使用的營養細胞形態之 S. inulinus 的耐酸性試驗結果相似。多篇文獻證實 L. acidophilus 對酸具有抵抗性(Gupta et al., 1996; Prasad et al., 1998;
Fernández et al., 2003)。在 Laroia and Martin (1991)的研究中也指出 L.
acidophilus 確實可生長於較低的 pH 值下(3.9～4.6)，而 B. bifidum 則無法在 低pH 值的環境中存活；Dunne et al. (1999)也發現 bifidobacteria 菌株對酸的 耐受性明顯比 L. acidophilus 差，而在本研究中的耐酸性試驗結果與上述作 者之試驗結果相似。另一方面，有文獻指出 L. bulgaricus 的耐酸性不佳 (Lindwall and Fondén, 1984; Conway et al., 1987)，但在本研究中卻發現該菌 株具有極佳的胃酸耐受性，甚至比 bifidobacteria 菌株的存活率高，不同試 驗結果之間的差異性可能與菌株的不同有關，不同的菌株來源會造成相異
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的試驗結果(Charteris et al., 1998; Xanthopoulos et al., 2000; Zárate et al., 2000)。
2-2 耐膽鹽試驗結果
各試驗乳酸菌株對於膽鹽耐受性之試驗結果如表 4.2 所示。由表中可
知菌株的存活情形相似於耐酸性試驗，孢子形態的 S. inulinus 比營養細胞 形態的 S. inulinus、B. bifidum、B. longum 及 L. bulgaricus 具有較高的存活 率(p < 0.05)，而在所有試驗菌株中，L. acidophilus 具有良好的膽鹽耐受性。
此外，在相同膽鹽濃度之下，較長的作用時間(3.0 hr)，其各試驗菌株的存 活率也都明顯的降低(p < 0.05)。
在 Hyronimus et al. (2000)的研究曾提出產孢性乳酸菌－S. inulinus CIP103279, NCFB1839, DSM30348 對膽鹽的耐受性極低，其結果亦與本研 究所使用的營養細胞形態之 S. inulinus 的耐膽鹽試驗結果相似。具膽鹽耐 受能力是 L. acidophilus 的一項重要特質(Walker and Gilliland, 1993)，在許 多文獻中均證實該菌株具有極佳的膽鹽耐受性(Walker and Gilliland, 1993;
Gupta et al., 1996; Jin et al., 1998; Fernández et al., 2003)，本研究結果亦發現 L. acidophilus 確實具有良好的膽鹽耐受能力；而在 Krasaekoopt et al. (2003) 的研究則發現 L. bulgaricus 對膽鹽的耐受性很差，並推論該菌株無法存活 與生長於腸道中，本研究結果也與其相同。
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表4.2、試驗乳酸菌株以 0.1, 0.2, 0.4%膽鹽濃度分別處理 1.5 和 3.0 hr 後之存活率 Table 4.2. Survival rates (%) of tested strains treated with oxgall bile salt in different
incubation times (1.5, 3.0 hr) at the same bile salt concentrations of 0.1%, 0.2%, and 0.4%, respectively
oxgall bile salt
0.1% 0.2% 0.4%
Strain
1.5 hr 3.0 hr 1.5 hr 3.0 hr 1.5 hr 3.0 hr
S. inulinus (S)* 61.1 ± 0.6 bx** 36.8 ± 2.3 by 57.4 ± 1.7 ax 33.5 ± 0.8 by 36.5 ± 1.6 bx 14.0 ± 2.1 by S. inulinus (V) 43.1 ± 0.7 dx 19.3 ± 1.0 dy 30.0 ± 1.0 cx 0.0 ± 0.0 cy 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx
L. acidophilus 71.2 ± 2.0 ax 42.1 ± 2.1 ay 48.7 ± 2.0 bx 38.8 ± 0.4 ay 47.6 ± 3.0 ax 32.6 ± 3.7 ay
L. bulgaricus 42.9 ± 2.1 dx 24.1 ± 2.3 cy 0.0 ± 0.0 ex 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx
B. bifidum 53.6 ± 6.3 cx 13.8 ± 3.2 ey 18.0 ± 1.4 dx 0.0 ± 0.0 cy 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx
B. longum 69.2 ± 0.9 ax 35.9 ± 2.7 by 28.1 ± 1.4 cx 0.0 ± 0.0 cy 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx
S: Spore form, V: Vegetative cell form.
** a-e Different letters within a column significantly differ at 5% level, n = 3.
** x-y Different letters within a row at the same oxgall concentration significantly differ at 5% level, n = 3.
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益生菌必須能存活於不適宜生長的腸胃道中，方能表現益生菌對宿主 的健康功效(Gilliland, 1989; Prasad et al., 1998)，而探討菌體對胃酸與膽鹽的 耐受性可用來評估益生菌株是否能存活並通過胃腸道(Prasad et al., 1998;
Hyronimus et al., 2000; Park et al., 2002; Michida et al., 2006)。在胃中含有低 pH 值的胃液，這是因為所分泌的胃酸中含有高濃度的鹽酸所致(Holzapfel et al., 1998)，而如此低的 pH 值易造成大多數的微生物死亡(Kimoto et al., 2000)；在腸道中存有膽鹽，高濃度的膽鹽會快速溶解菌體細胞膜的脂質，
這些對微生物而言亦是一生長抑制因子(Keele and Neil, 1965; Floch et al., 1972; Le Vay, 1988)，故胃酸與膽鹽是決定各種益生菌在腸胃道中存活與定 殖的關鍵性影響要素(Walker and Gilliland,1993; Jin et al., 1998; Succi et al., 2005)。
2-3 細胞單層膜完整性之觀察
為了觀察Caco-2 cell monolayer 的完整性，從 Caco-2 cells 繼代培養開 始，即以倒立式顯微鏡觀察細胞培養皿中的細胞生長狀況。結果發現在第 0 天(如圖 4.2-A)剛繼代培養後的細胞是呈現完整的圓點形狀，此時尚未貼 附於細胞培養皿上，到了第四天(如圖 4.2-B)時就可以觀察到大多數的細胞 都已貼附於細胞培養皿的壁上，此時細胞呈現扁平狀且有增多的現象，而
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A B
C D
圖4.2、Caco-2 cells 繼代培養後之生長形態(A)繼代培養後第 0 天；(B)第 4 天；(C)第 8 天；(D)第 15 天 (放大倍率 100×)
Fig.4.2. Changes in shape of Caco-2 cells (A) 0 day; (B) 4 days; (C) 8 days; (D) 15 days at after subculture (magnification 100×)
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在第八天(如圖 4.2-C)時細胞已長滿整個細胞培養皿且開始分化，到了第十 五天之後細胞分化完成(如圖 4.2-D)，因此在本研究中的吸附試驗所使用的 cell monolayer，皆為 Caco-2 cells 繼代後培養十五天之 cell monolayer。
2-4 吸附性試驗結果
圖4.3 顯示各試驗乳酸菌株對 Caco-2 cells 的吸附能力，而吸附性由強 至弱之排序為: L. acidophilus (92.3%，圖 4.4-B) > L. bulgaricus (78.7%，圖 4.4-C) > B. bifidum (74.9%，圖 4.4-D) > S. inulinus (營養細胞，65.1%，圖 4.4-A)
> B. longum (52.7%，圖 4.4-E) > S. inulinus (孢子形態，10.5%)。其中 L.
acidophilus 呈現強力的吸附性(strong adhesion)，具有吸附性(adhesion)的包 括有營養細胞形態之 S. inulinus、L. bulgaricus、B. bifidum 及 B. longum，而 孢子形態的 S. inulinus 則是呈現低度的吸附性(weak adhesion)。
腸黏膜(intestinal mucus)是菌株吸附與定殖的重要部位(Mikelsaar et al., 1998)，因此在生體外試驗常使用 Caco-2 cell 作為模擬腸道細胞以探討益生 菌之吸附能力。而菌株若要能定殖在腸道中，前提是須具有吸附於腸道細 胞之能力(Beachey, 1981)，所以欲成為益生菌，首要條件即為菌株應具腸黏 膜吸附性(Ouwehand et al., 1999c)，以延長益生菌持續停留在腸道中，發揮 其有益人體健康之功效(Morelli et al., 1997)。然而有文獻指出，益生菌似乎 無法長久定殖於宿主腸道內，在許多研究中發現當給予益生菌後可在糞便
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Tested LAB strains
S. inulinus (V)
S. inulinus (S)
L. acidophilus
L. bulgaricus B. bifidum B. longum
圖4.3、各試驗乳酸菌株對 Caco-2 cells 之吸附性。S. inulinus (V)：營養細 胞形態；S. inulinus (S)：孢子形態。a-e為各菌株之間相互比較，所 標示的字母不同表示有顯著性差異(p < 0.05)
Fig. 4.3. Adhesion of the tested LAB to Caco-2 cells. S. inulinus (V): vegetative cell form; (S): spore form. a-e Groups with different letters differ significantly (p < 0.05)
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B
C D
E A
圖4.4、各試驗乳酸菌株吸附於 Caco-2 cells 上之光學顯微照相圖(A) S. inulinus；
(B) L. acidophilus；(C) L. bulgaricus；(D) B. bifidum；(E) B. longum (放大 倍率 2, 000×)
Fig. 4.4. Schemes of the tested LAB adhesion to Caco-2 cells in a light microscope (A) S. inulinus；(B) L. acidophilus；(C) L. bulgaricus；(D) B. bifidum；(E) B.
longum (magnification 2, 000×)
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中測得其益生菌數，但一旦停止給予後，其糞便中的菌數即逐漸減少，因 此推論益生菌吸附於腸道中只是短暫的定殖而己(Johansson et al., 1993;
Link-Amster et al., 1994; Saxelin, 1997; Spanhaak et al., 1998)。
此外，前人的研究均曾提到，乳酸菌的腸道吸附具有宿主專一性(host specificity)，亦即人類來源的乳酸菌才會吸附在人類腸道細胞上(Walker and Duffy, 1998; Ouwehand et al., 1999a; Ouwehand et al., 1999c)，而且將其作為 選擇益生菌所依據的標準之一。但是Rinkinen et al. (2003b)的研究發現，來 自於某一宿主的益生菌，亦可能有效地吸附於其他宿主之腸道黏膜，而此 種吸附性主要是奠基於益生菌本身的菌株特性，而非僅取決於其是否為人 類來源之益生菌。
L. acidophilus 為一種典型的益生菌，具有多種能夠助益人體健康的保 健功效(Tejada-Simon et al., 1999; Michetti et al., 1999; Lin and Chen, 2000;
Ogawa et al., 2001b)，之前曾有研究指出，L. acidophilus 具有耐胃酸、耐膽 鹽及可吸附於模擬腸道細胞之能力(Tuomola and Salminen, 1998; Gopal et al., 2001; Fernández et al., 2003)。Kos et al. (2003)也發現 L. acidophilus 具有 吸附於腸道上皮細胞以及預防病原菌定殖之共凝集(coaggregation)的能力。
Coconnier et al. (1992)曾探討 L. acidophilus BG2FO4 的腸道吸附模式，
並提出所謂的胞外蛋白質雙架橋理論，如圖 4.5 所示，L. acidophilus 即藉
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圖4.5、L. acidophilus BG2FO4 對人類腸道細胞之吸附模式
Fig. 4.5. The model of adherence of L. acidophilus BG2FO4 to human intestinal cell
(Coconnier et al., 1992) HUMAN LACTOBACILLUS
Extracellular Bridging Protein Adherence Receptor
for Bacteria
HUMAN ENTEROCYTE
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由此種胞外蛋白連結至人體的腸道細胞受體，達到吸附與定殖的效果。此 外，bifidobacteria 亦為源自人類腸道的另一種益生菌，其對於人體的益生 效果，亦有多篇文獻報告之佐證(Tejada-Simon et al., 1999; Asahara et al., 2004; Lee et al., 2004)。在其吸附模式之探討方面，曾有學者以花生凝集素 (peanut agglutinin; PNA)做為研究素材，探討 B. bifidum EB102 之腸道吸附 機 制 ， 結 果 發 現 此 菌 株 是 以 細 胞 表 面 之 蛋 白 質 成 份(proteinaceous components)結合至模擬腸道細胞株 Caco-2 cells 之醣脂質(glycolipid)的醣部 份(carbohydrate moieties) (Mukai et al., 2004)。
Jacobsen et al. (1999)的研究指出 L. bulgaricus CHCC759, CHCC2164 不 具腸道吸附性，而Gopal et al. (2001)的研究也將 L. bulgaricus LB1 做為吸 附試驗的負控制組，然而在本研究中卻發現 L. bulgaricus BCRC 14009 具有 良 好 腸 道 吸 附 性(78.7%) ， 其 結 果 與 上 述 作 者 之 研 究 論 述 有 差 異 ， 在 Ouwehand et al. (1999b)的研究也指出，常被認為是非腸道定殖菌株的 L.
bulgaricus 可良好的吸附於腸道黏膜上，因此推測試驗結果不同可能是因為 菌株上的差異所致。
第三節 乳酸菌培養基上清液抑制腸炎沙門氏菌生長之試驗結果