第三章 材料與方法
第八節 乳酸菌拮抗病原菌之吸附試驗
8-1 乳酸菌預防腸炎沙門氏菌侵襲腸道細胞之試驗(prophylactic effect) 此試驗乃參考Wadström 等(1997)之方法來進行。將試驗之乳酸菌株預 先吸附於Caco-2 cells 上，試驗其阻止 S. enteritidis 侵襲感染腸黏膜之能力。
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先將Caco-2 cell monolayer 以 0.25% (v/v) glutaraldehyde 固定 15 min 之後，
再以PBS buffer 清洗二次，接著添加不含抗生素的 DMEM，經 1.5 hr 培養
後作為試驗之用。將試驗之乳酸菌液離心後，以PBS buffer 沖洗菌體沈澱
物二次，再重新懸浮於不含抗生素的DMEM 中。另外將 S. enteritidis 菌液 混合等體積的fluorescein isothiocyanate (FITC, Sigma)螢光染劑(2 mg/ml)，
於室溫下作用 20 min，然後離心去除過量的 FITC，菌體沈澱物再以 PBS buffer 沖洗三次，並重新懸浮於不含抗生素的 DMEM 中。將 1 ml 的各乳酸 菌液(約 108 CFU/ml)加入含有 Caco-2 cell monolayer 之 well 中，以 37 , 5% ℃ CO2培養 2 hr 後，吸除 DMEM 培養液並以 PBS buffer 清洗 well 五次，以 移除未吸附於 cell monolayer 上之菌株，接著加入 1 ml FITC-labeled S.
enteritidis (108 CFU/ml)，在 37 , 5% CO℃ 2下培養2 hr 後，吸除培養液並以 PBS buffer 清洗五次，以移除未附著之菌體。然後使用螢光檢測器(Bio-Tek, FLX-800, USA)以 485 nm 激發波長和 528 nm 散發波長偵測其樣品的螢光強 度(fluorescence density)，並且以螢光顯微鏡拍照觀察。同時以未預先用試 驗乳酸菌株處理的樣品作為控制組，計算試驗組和控制組的螢光強度比 值，計算方式為試驗組之螢光強度值除以控制組之螢光強度值，再乘以 100，接著將控制組之螢光強度值定為 100%，若螢光強度比值減弱，則表 示預先以試驗乳酸菌株吸附於Caco-2 cells 上，可有效降低 S. enteritidis 對
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Caco-2 cells 的侵襲。
另外也將各試驗乳酸菌株進行FITC 螢光染色，之後吸附於 Caco-2 cells 上，接著於well 中加入濃度為 108 CFU/ml 的 S. enteritidis 菌液 1 ml，以 37 , ℃ 5% CO2培養2 hr，觀察 S. enteritidis 加入前後 Caco-2 cells 上各試驗菌株螢 光強度之變化。若螢光強度不變，則表示各試驗乳酸菌株不會受到 S.
enteritidis 的影響而降低對 Caco-2 cells 的吸附與定殖，所得結果與其控制 組(未以 S. enteritidis 處理者)進行比較。
8-2 乳酸菌及其培養基上清液抑制腸炎沙門氏菌吸附於腸道細胞之試驗 (therapeutic effect)
本試驗以Caco-2 cells 模擬腸道上層黏膜細胞。參照前述 8-1 之方法，
將FITC-labeled S. enteritidis 吸附於 Caco-2 cells 上，接著於 well 中加入 1 ml 濃度為108 CFU/ml 之各試驗乳酸菌株或其培養基上清液，以 37 , 5% CO℃ 2
培養2 hr 之後，偵測樣品螢光強度並以螢光顯微鏡拍照觀察。同時以未加
入試驗菌株或其培養基上清液之樣品作為控制組，計算試驗組和控制組的 螢光強度比值，計算方式為試驗組之螢光強度值除以控制組之螢光強度
值，再乘以100，接著將控制組之螢光強度值定為 100%，若螢光強度比值
減弱，則代表乳酸菌菌體或其培養基上清液能有效抑制 S. enteritidis 對 Caco-2 cells 之吸附。
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經抗生素處理後存活之菌數 添加於含細胞單層膜之 well 中的菌數 第九節 細胞侵入性試驗
各試驗乳酸菌株對人類腸道細胞之安全性評估，乃以生體外模式之侵 入性試驗為之(Tang et al., 1993)，試驗流程如圖 3.2 所示。先以 0.25% (v/v) glutaraldehyde 固定 Caco-2 cell monolayer 之後，再以 PBS buffer 清洗二次，
接著添加不含抗生素的DMEM 培養 1.5 hr。各試驗菌株則先接種於液體培
養基，以 37℃培養 48 hr，之後離心並以 PBS buffer 沖洗菌體沈澱物二次，
再將其重新懸浮於不含抗生素的DMEM 中。添加已知菌數之試驗菌株(103
～109 CFU/ml)於含有 Caco-2 cell monolayer 之 well 中，培養 2 hr，接著吸 除well 中之培養液，以 PBS buffer 清洗五次，去除未附著之菌株，然後於 well 中加入含有抗生素(100 μg/ml tetracycline, MDBio, Frederick, MD, USA) 的DMEM，於 37℃，5% CO2下作用 2 hr，以殺死吸附於 Caco-2 cells 表面 之試驗菌株，之後以PBS buffer 洗除 tetracycline 及溶液中死亡的菌體。接 著使用 1% Triton X-100 溶液分解 Caco-2 cell monolayer，釋出可能侵入 Caco-2 cells 內部之試驗菌株。將 well 中之溶液以連續稀釋法進行標準平板 計數，計算侵入百分比，其計算公式如下：
侵入百分比(%) ＝ × 100%
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# bacteria surviving tetracycline treatment
# bacteria added to cell monolayer
1. Infect Caco-2 cells with bacteria (103 to 109 CFU/ml).
2. Incubate at 37 , 5% CO℃ 2 for 2 hr.
3. Add 100 μg/ml tetracycline for 2 hr to kill extracellular bacteria.
4. Wash and add 1% Triton X-100 to release internalized bacteria.
5. Perform plate count of intracellular bacteria.
% INVASION =
圖3.2、乳酸菌之侵入性試驗流程
Fig. 3.2. Flow chart of LAB invasion assay
× 100%
(Tang et al., 1993)
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侵入百分比越低，表示試驗之乳酸菌株使用於人體的安全性越高。若 其不具侵入性，則當其作為益生菌使用時，不會有侵襲人體腸道細胞之危 險。
第十節 貯藏安定性試驗
將含有活化菌株之菌液及孢子懸浮液以 8000 xg 離心 15 min 之後，去 除上清液並以PBS buffer 沖洗菌體沈澱物二次，再重新懸浮於無菌的 11%
脫脂牛乳(Anchor, Wellington, New Zealand)中，將上述脫脂乳菌液分裝至冷 凍乾燥瓶中，每瓶分裝5 ml，再以冷凍乾燥機(EYELA, FDU-2000, Japan) 乾燥之。完成乾燥後的樣品移置恆溫恆濕箱(YOUNG CHENN, HG-40, Taiwan)中進行貯藏試驗，貯藏條件為 25 ± 2℃，60 ± 5% RH。分別計數冷 凍乾燥前及冷凍乾燥後貯藏第0, 4, 8, 12, 16, 20 週回溶為液態樣品時的活 菌數(以 log CFU/ml 表示)。
第十一節 統計分析
本 實 驗 利 用 Microsoft Excel 軟體(Microsoft Excel 2003, Microsoft Corporation, 2003, USA)計算試驗三重複數據之平均值與標準差(standard deviation)，並以 SigmaPlot 繪圖軟體(SigmaPlot 2000 for Windows, ver 6.00, USA)繪製柱狀圖與曲線圖。另外也採用 SAS 軟體(Statistical Analysis System,
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Version 6.12, 1996)，利用 GLM 程序之 Duncan’s new multiple range test 及 Dunnett’s test 進行數據之間的差異顯著性比較。
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第四章 結果與討論
第一節 菊糖有孢子乳桿菌之孢子誘導培養
將營養細胞形態之 S. inulinus 塗抺於產孢培養基上，其產孢培養基組 成 為 1.0 ～ 2.0% methyl-α-D-glucopyranoside; 0.5% yeast extract; 0.5%
peptone; 3.0% CaCO3; 1.5% agar，以 37℃厭氧培養 14～21 天，使其形成孢 子形態之 S. inulinus。由於 S. inulinus 在營養充裕的狀態下不易形成孢子，
故在產孢培養基中添加 methyl-α-D-glucopyranoside 取代 glucose 作為菌株 生長之碳源，藉此增強菌株孢子的形成(Doores and Westhoff, 1981; 1983)。
圖4.1 為 S. inulinus 的營養細胞(A)及其孢子形態(B)，由 B 圖可觀察到孢子 形態的 S. inulinus 其桿狀菌體的末端有黑色圓點出現，當中亦可看到有單 獨分離出來的黑色圓點，其為菌株所形成的孢子，此兩種形態的 S. inulinus 皆為光學顯微鏡下觀察之結果。
第二節 乳酸菌耐酸、耐膽鹽與模擬腸道吸附性 2-1 耐酸性試驗結果
試驗乳酸菌株以pH 2, 3, 4 酸液分別處理 1.5 和 3.0 hr 之菌株存活率如 表4.1 所示。由表 4.1 中可看到在相同處理條件之下，孢子形態之 S. inulinus 比營養細胞形態的 S. inulinus、B. bifidum 及 B. longum 具有較高的存活率(p
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A
B
圖4.1、孢子染色 S. inulinus 之光學顯微照相圖。(A)營養細胞形態；(B)孢 子形態(放大倍率 2,000×)
Fig. 4.1. Vegetative cells (A) and spores (B) of S. inulinus. The former (A) were Gram stained and the spores (B) were stained by spore-staining. Both were observed under a light microscope (magnification 2,000×)
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表4.1、試驗乳酸菌株以 pH 2, 3, 4 酸液分別處理 1.5 和 3.0 hr 後之存活率
Table 4.1. Survival rates (%) of tested strains treated with acid in different incubation times (1.5, 3.0 hr) at the same pH values of pH 2, pH 3 and pH 4, respectively
S: Spore form, V: Vegetative cell form.
** a-f Different letters within a column significantly differ at 5% level, n = 3.
** x-y Different letters within a row of the same pH value significantly differ at 5% level, n = 3.
pH 2 pH 3 pH 4
Strain
1.5 hr 3.0 hr 1.5 hr 3.0 hr 1.5 hr 3.0 hr
S. inulinus (S)* 64.5 ± 2.0 cx** 44.8 ± 0.2 cy 88.3 ± 1.0 bx 78.9 ± 0.8 cy 94.2 ± 0.6 bx 91.7 ± 1.3 by S. inulinus (V) 15.4 ± 1.0 fx 0.0 ± 0.0 ey 27.6 ± 0.3 ex 19.5 ± 1.6 ey 71.2 ± 1.3 cx 55.0 ± 1.3 ey
L. acidophilus 90.3 ± 1.5 ax 68.8 ± 1.0 ay 98.1 ± 1.0 ax 95.6 ± 0.9 ay 98.2 ± 1.3 ax 97.0 ± 0.3 ax
L. bulgaricus 78.3 ± 3.4 bx 52.1± 1.4 by 88.7 ± 2.3 bx 83.9 ± 1.1 by 95.2 ± 2.9 abx 90.0 ± 1.4 bx
B. bifidum 42.5 ± 4.9 ex 0.0 ± 0.0 ey 65.9 ± 1.5 cx 0.0 ± 0.0 fy 74.5 ± 1.6 cx 58.1 ± 1.3 dy
B. longum 49.7 ± 1.9 dx 29.0 ± 2.6 dy 62.6 ± 1.7 dx 32.5 ± 0.8 dy 94.6 ± 3.9 abx 74.2 ± 3.2 cy
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< 0.05)，然而在所有試驗菌株中，以 L. acidophilus 和 L. bulgaricus 呈現高
度的耐酸性。在同一 pH 值之下，較長的作用時間(3.0 hr)均會使各試驗菌
株的存活率明顯降低(p < 0.05)，而在 pH 4 的酸液中無論作用 1.5 或 3.0 hr，
L. acidophilus (98.2% vs 97.0%)和 L. bulgaricus (95.2% vs 90.0%)的存活率並 無明顯變化，由此可知本研究所使用之 Lactobacillus spp.的耐酸性比其他試 驗菌株佳。
在 Hyronimus et al. (2000)的研究曾探討多種產孢性乳酸菌－S. inulinus CIP103279, NCFB1839, DSM30348 等對酸液的耐受性，其結果與本研究所 使用的營養細胞形態之 S. inulinus 的耐酸性試驗結果相似。多篇文獻證實 L. acidophilus 對酸具有抵抗性(Gupta et al., 1996; Prasad et al., 1998;
Fernández et al., 2003)。在 Laroia and Martin (1991)的研究中也指出 L.
acidophilus 確實可生長於較低的 pH 值下(3.9～4.6)，而 B. bifidum 則無法在 低pH 值的環境中存活；Dunne et al. (1999)也發現 bifidobacteria 菌株對酸的 耐受性明顯比 L. acidophilus 差，而在本研究中的耐酸性試驗結果與上述作 者之試驗結果相似。另一方面，有文獻指出 L. bulgaricus 的耐酸性不佳 (Lindwall and Fondén, 1984; Conway et al., 1987)，但在本研究中卻發現該菌 株具有極佳的胃酸耐受性，甚至比 bifidobacteria 菌株的存活率高，不同試 驗結果之間的差異性可能與菌株的不同有關，不同的菌株來源會造成相異
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的試驗結果(Charteris et al., 1998; Xanthopoulos et al., 2000; Zárate et al., 2000)。
2-2 耐膽鹽試驗結果
各試驗乳酸菌株對於膽鹽耐受性之試驗結果如表 4.2 所示。由表中可
知菌株的存活情形相似於耐酸性試驗，孢子形態的 S. inulinus 比營養細胞 形態的 S. inulinus、B. bifidum、B. longum 及 L. bulgaricus 具有較高的存活 率(p < 0.05)，而在所有試驗菌株中，L. acidophilus 具有良好的膽鹽耐受性。
此外，在相同膽鹽濃度之下，較長的作用時間(3.0 hr)，其各試驗菌株的存 活率也都明顯的降低(p < 0.05)。
在 Hyronimus et al. (2000)的研究曾提出產孢性乳酸菌－S. inulinus CIP103279, NCFB1839, DSM30348 對膽鹽的耐受性極低，其結果亦與本研 究所使用的營養細胞形態之 S. inulinus 的耐膽鹽試驗結果相似。具膽鹽耐 受能力是 L. acidophilus 的一項重要特質(Walker and Gilliland, 1993)，在許 多文獻中均證實該菌株具有極佳的膽鹽耐受性(Walker and Gilliland, 1993;
Gupta et al., 1996; Jin et al., 1998; Fernández et al., 2003)，本研究結果亦發現 L. acidophilus 確實具有良好的膽鹽耐受能力；而在 Krasaekoopt et al. (2003) 的研究則發現 L. bulgaricus 對膽鹽的耐受性很差，並推論該菌株無法存活 與生長於腸道中，本研究結果也與其相同。
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表4.2、試驗乳酸菌株以 0.1, 0.2, 0.4%膽鹽濃度分別處理 1.5 和 3.0 hr 後之存活率 Table 4.2. Survival rates (%) of tested strains treated with oxgall bile salt in different
incubation times (1.5, 3.0 hr) at the same bile salt concentrations of 0.1%, 0.2%, and 0.4%, respectively
oxgall bile salt
0.1% 0.2% 0.4%
Strain
1.5 hr 3.0 hr 1.5 hr 3.0 hr 1.5 hr 3.0 hr
S. inulinus (S)* 61.1 ± 0.6 bx** 36.8 ± 2.3 by 57.4 ± 1.7 ax 33.5 ± 0.8 by 36.5 ± 1.6 bx 14.0 ± 2.1 by S. inulinus (V) 43.1 ± 0.7 dx 19.3 ± 1.0 dy 30.0 ± 1.0 cx 0.0 ± 0.0 cy 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx
L. acidophilus 71.2 ± 2.0 ax 42.1 ± 2.1 ay 48.7 ± 2.0 bx 38.8 ± 0.4 ay 47.6 ± 3.0 ax 32.6 ± 3.7 ay
L. bulgaricus 42.9 ± 2.1 dx 24.1 ± 2.3 cy 0.0 ± 0.0 ex 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx
B. bifidum 53.6 ± 6.3 cx 13.8 ± 3.2 ey 18.0 ± 1.4 dx 0.0 ± 0.0 cy 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx
B. longum 69.2 ± 0.9 ax 35.9 ± 2.7 by 28.1 ± 1.4 cx 0.0 ± 0.0 cy 0.0 ± 0.0 cx 0.0 ± 0.0 cx
S: Spore form, V: Vegetative cell form.
** a-e Different letters within a column significantly differ at 5% level, n = 3.
** x-y Different letters within a row at the same oxgall concentration significantly differ at 5% level, n = 3.
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益生菌必須能存活於不適宜生長的腸胃道中，方能表現益生菌對宿主 的健康功效(Gilliland, 1989; Prasad et al., 1998)，而探討菌體對胃酸與膽鹽的 耐受性可用來評估益生菌株是否能存活並通過胃腸道(Prasad et al., 1998;
Hyronimus et al., 2000; Park et al., 2002; Michida et al., 2006)。在胃中含有低 pH 值的胃液，這是因為所分泌的胃酸中含有高濃度的鹽酸所致(Holzapfel et al., 1998)，而如此低的 pH 值易造成大多數的微生物死亡(Kimoto et al., 2000)；在腸道中存有膽鹽，高濃度的膽鹽會快速溶解菌體細胞膜的脂質，
這些對微生物而言亦是一生長抑制因子(Keele and Neil, 1965; Floch et al., 1972; Le Vay, 1988)，故胃酸與膽鹽是決定各種益生菌在腸胃道中存活與定 殖的關鍵性影響要素(Walker and Gilliland,1993; Jin et al., 1998; Succi et al.,
這些對微生物而言亦是一生長抑制因子(Keele and Neil, 1965; Floch et al., 1972; Le Vay, 1988)，故胃酸與膽鹽是決定各種益生菌在腸胃道中存活與定 殖的關鍵性影響要素(Walker and Gilliland,1993; Jin et al., 1998; Succi et al.,