１、植物材料與 DNA 之抽取
本實驗之材料採集臺灣產野甘草植物新鮮葉子，標本存放在國立自然科學博 物館植物標本館(TNM)。 實驗所得 DNA 之序列登錄於 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene bank 中。
葉片組織在液氮中研磨粉碎後貯藏於 -20 ℃下備用。DNA 之抽取使用 Dellaporta method51。
(1) 磨碎萃取：
①. 取 1~4 g 幼嫩葉於研缽內，以液態氮研磨成粉末，移置於離心管中。
②. 加入 15 ml 之 Extraction buffer 及 1 ml 20 % SDS，強力搖晃 50 次 使之混合，接著以 65oC 水浴 10 分鐘。
③. 加入 5 ml 之 potassium acetate solution， 強力搖晃約 50 次後冰浴 20 分鐘。
(2) 異丙醇沉澱：
①. 在 12 krpm（4 oC）離心 20 分鐘，取上清液至新離心管，加入 10 ml 之 異丙醇在–20 ℃下約 5~10 分鐘，使之沉澱。
②. 在 12 krpm（4 oC）離心 15 分鐘，去掉上清液，倒立 10 分鐘，呈乾燥凝 膠。
③. 加入 0.5 ml 之 TE buffer，重新將凝膠溶出呈懸浮液。
(3) 酚清洗：
①. 將懸浮液倒入收集管，加入等量（0.5 ml）phenol（pH 8.0）混勻，在 10 krpm（4 ℃）離心 5 分鐘。
②. 將 上 清 液 倒 入 新 收 集 管 ， 加 入 0.25 ml chloroform （ chloroform ： isoamylalcohol=24：1）和 0.25 ml phenol 混勻，在 10 krpm（4 ℃）
離心 5 分鐘。
③. 將上清液倒入新收集管，加入 0.5 ml chloroform 混勻，在 10 krpm（4 ℃
下）離心 5 分鐘。
(4) 酒精沉澱：
①. 將上清液倒入新收集管，加入 0.9 ml absolute EtOH 和 0.15 ml ammonium acetate（7.5 M）。
②. 將混合液置於–20 ℃下 30 分鐘加強沉澱作用，在 10 krpm（4 ℃下）離 心 15 分鐘，去掉上清液，倒立 5~10 分鐘。
③. 再以 70 % EtOH 清洗，置於室溫下 15 分鐘。
(5) 真空乾燥：
在 10 krpm（4 ℃下）離心 5 分鐘，去掉上清液，抽氣至完全乾燥。
(6) TE 溶解：
①. 加入 TE 緩衝液（10：1）0.2 ml 溶解產物。
②. 酌量加入 RNase A（10 mg/ml），分解及處理 RNA。
③. 保存於–20 ℃以供使用。
２、聚合酶連鎖反應( PCR )
DNA 通常為雙股，呈相反方向結合。其中一股為 5'（指核苷酸（Nucleotide）
分子中五碳醣的第五個碳的方位）→ 3'， 另一股為 3'→ 5'。DNA 係由核苷酸 包括：腺嘌呤（adenine）（A）、鳥糞嘌呤（guanosine）（G）與胞嘧啶（cytosine）
（C）及胸腺嘧啶（thymine）（T）所組成。且在配對氫鍵結合時均為 A 對 T，G 對 C。
選取特定引子 18D 和 28CC，利用 PCR 複製核糖體核酸基因間隔區(ITS)，這 組 ITS1-5.8S-ITS2 引子序列是：
18D（5'- CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA-3'）和 28CC（5'-ACTCGCCGTTACTAGGTGAA-3'）
PCR 複製核糖體核酸基因間隔區的反應物及濃度如下：在 0.6 ml 的微量離 心管內加入 10 µl of 10 X reaction buffer，10 µl MgCl2（25 mM），2 µl dNTP
mix (8 mM)，25 uM 的 18D 和 28CC 引子各 4 µl，和 10 U of Taq polymerase，
最後加入 4 ul 的範本 DNA，加無菌水使總體積成 100 ul，將微量離心管置入熱 循環器。反應的熱循環溫度及時間如下，先以 94 ℃反應 5 分鐘，然後 94 ℃反 應 1 分鐘，60 ℃反應 1 分鐘，72 ℃反應 1 分 30 秒的三個步驟進行 40 個循環，
最後 72 ℃反應 10 分鐘後，將 PCR 複製產物維持在 4 ℃下備用。
３、電泳分析
將 PCR 複製產物進行電泳分析,操作步驟如下:
(1) 取 0.6 g 瓊膠加入 40 ml 0.5 X TBE 緩衝液中。
(2) 在微波爐中加熱 2 分鐘。
(3) 迅速加入 2 ul ethidium bromide （7.5 mg/ml），小心振搖,倒入膠盤。
(4) 瓊膠在 10〜15 分鐘內凝結。
(5) 加 Marker 5 ul（事先加入 2 ul dye）。 (6) 加 PCR 複製產物 5 ul（事先加入 2 ul dye）。 (7) 在 50 V/100 V 電泳槽內進行電泳分離，約 30 分鐘。
(8) 以紫外燈箱上觀察，並拍照電腦存檔，以便作為判讀與分析之依據。
４、定序
在 UV 燈下觀察，以確定其 PCR 擴增長度正確，於 700〜900 bps 下得一清 晰環帶，再將之交給源資國際生物科技股份有限公司定序(附圖 24)。