1、野甘草植物 luteolin 提取方法之選擇
在樣品處理方法的選擇上，我們分別以下列方法提取：
(1) methanol 萃取
(2) 0.1% phosphoric acid 和 methanol 萃取 (3) methanol 和 H2O
(4) H2O 萃取
(5) 0.1% phosphoric acid 萃取
比較上述提取方法，發現以 methanol 萃取所得 luteolin 含量最高，因 此我們選擇以 methanol 作為樣品處理的溶媒。
另外，選擇好溶媒之後，接下來便是萃取方法，我們以下列四種方法來 提取：
(1) 超音波萃取法 30 分鐘
(2) 冷浸法（並用磁石攪拌）在室溫下，18 小時 (3) 加熱法 20 分鐘
(4) 超音波加熱 50 ℃，20 分鐘
結果發現在相同狀況之下(野甘草粉末 1 g) 所提取出來 luteolin 的含
量(4) > (3) > (1) > (2)。故選用超音波加熱法，可以使萃取時間短，效 率高。
為了確保 luteolin 的提取完全，我們將野甘草的粉末 1 g，以 10 ml MeOH 重複提取 4 次之後，將第 4 次所得萃取液進樣 HPLC(重複三次)，發現 第 4 次的萃取液裡已不到偵測 luteolin 的存在。因此由此實驗可知：
luteolin 可以利用 10 ml MeOH 提取三次的方法，完全提取。
2、luteolin 的定量：
在本研究中，由於所採集的野甘草均是在中部地區採集到，因此無法比 較各地區野甘草的含量。
如表 21 所示，可以發現 2004 年 12 月 30 所採集的野甘草，其 luteolin 含量遠低於另外兩次採集的含量，其正確原因仍須進一步探討。
3、不同部位的 luteolin 含量
野甘草各部位的 luteolin 含量測定，我們將野甘草各部位分開來，各 取 1 g ，依上述提取方法處理，所得結果如圖 34 及表 23。可以顯示出，
在野甘草各個部位的樣品中，luteolin 含量最高的為果的部份，而根部則 因含量太少而無法偵測其含量。各部位的含量比較則為：果 > 葉 > 莖 >
根。
表 23：野甘草中各部位每克中 luteolin 含量 Parts Contents（μg） Contents（%）
Root 0 0
Stem 2.17155 0.00022 Leaf 9.84021 0.00098 fruit 86.3601 0.0086
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
Root Stem Leaf fruit
Parts
Content (%)
圖 34：野甘草中各部位 luteolin 含量比較
第五節 野甘草( Scoparia dulcis )植物的指紋圖譜研究
一、野甘草植物之層析圖譜
如圖11，我們選取的10個 peak（表24） ，以luteolin(peak 8)之波峰為基 準，計算這10個波峰的高度與luteolin波峰的高度比，得其比值（表25），繪製 成折線圖（圖35），比較各波峰之間的關係。
表24：野甘草各peak 之滯留時間 波峰
標號
Retention Time
（min）
波峰 標號
Retention Time
（min）
1 9.41 6 18.69 2 10.11 7 19.39 3 13.12 8 22.75 4 14.80 9 24.85 5 16.32 10 27.44
表25：野甘草在HPLC中各peak高度與luteolin peak之高度比
Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5 Peak 6 Peak 7 Peak 8 Peak 9 Peak 10 5.45 2.98 2.55 0.66 0.91 2.28 2.51 1.00 0.34 0.40
計算所有樣品中這10個滯留時間的波峰高度（intensity (AU)）比，來制定 標準的野甘草圖形。將所有的資料繪成圖表(圖35)，比較所選取的波峰之間的關 係。一般，相同品種的植物其成分比應該類似。
0 1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
peak 編號
與luteolin peak之高度比
圖35：野甘草之HPLC指紋圖譜
二、野甘草植物 PCR 之研究
rDNA ITS序列是近年來用於探討植物種內變異和種間、近緣屬間分子系統關 係的重要分子標記之一，隨著時代的進步，利用基因體定序資料庫來鑑別植物基 原成為一個新的趨勢。高等植物的核糖體DNA( nuclear ribosomal DNA ，rDNA) 是由串聯重複排列的單位組成，每個單位包括編碼區和內轉錄間隔區，編碼區包 括18S、5.8S 及 26S rRNA等三個基因 (圖36)，序列高度保守；編碼區之間為內 轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)，依順序分為第一轉錄間隔區 (ITS1)和第二轉錄間隔區(ITS2)69-71。 在轉錄過程中，當rDNA初轉錄形成一個轉 錄單位（transcription unit）時，經過一系列製程（processing）後，上述2 個轉錄間隔區會在製程中除去，形成成熟的rRNA（mature RNA）。成熟的rRNA包 含18S、5.8S 和 26S rRNA，會與核糖體蛋白組成核糖體（ribosome），而核糖體 即是蛋白質合成的地點。因此， rDNA在蛋白質合成、生物生長、發育與生殖上 扮演重要角色72。
Luteolin
圖 36：高等植物 ribosomal DNA 結構圖，圖示為 internal transcribed spacer （ITS）區域與 18S、5.8S 及 26S rDNA 之相對位置以及 intergenic spacer （IGS）之位置
另外，在 rDNA 之序列結構中，在 18S、5.8S 和 26S rRNA 基因區中之序列，
在不同物種間相當一致；但在 ITS 和 IGS 的區域中，不同物種間之長度及序列常 有很大變異，可以用來鑑別不同的物種。ITS 區序列進化速度較快,其速度恰與 近緣種進化較一致,因此被廣泛用於高等植物近緣種的鑑別。
台灣產野甘草在民間廣泛的使用，為了建立此植物的鑑定基礎，本研究利用 基因體 DNA 萃取技術，萃取野甘草之 DNA，採用一組引子：18D 及 28CC (圖 37)。
引子長度 18D 為 24 mer, 28CC 為 20 mer。經過 DNA 的萃取、PCR 擴增，將台灣 產野甘草 rDNA 的 ITS 區域加以複製，並進一步分析該序列，希望能用於品種鑑 定、育種及親緣研究等方面。
8D：5'CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA-3’
28CC：5'ACTCGCCGTTACTAGGTGAA-3’
圖 37：野甘草之 PCR 引子
利用上述這組引子可以有效將野甘草 rDNA 之 ITS 區域複製，經過進一步定序 18S rDNA 5.8s rDNA 28s RNA
primer: 18D
primer: 28CC
ITS1 ITS2
5’CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA3
ITS region
5’ ACTCGCCGTTACTAGGTGAA 3’
後，序列長為 821 bp (圖 38)。將此序列送入基因庫進行比對，證實此 DNA 片段 為 rDNA 之 ITS 區域，其中有 142 bp 屬於 18S rDNA 基因 3’端，66 bp 屬於 26S rDNA 基因 5’端，真正屬於 ITS 區域的序列有 613 bp，其中有 196 bp 為 ITS1
18S rDNA gene 3’端：
TCCCGTGTCG GAGTGTTCGG ATCGCGACGA CGTGAGCGGT TCGCTGCCCG CGACGTCGCG AGAAGTCCAC TGAACCTTAT CATTTAGAGG AAGGAGAAGT CGTAACAAGG TTTCCGTAGG TGAACCTGCG GAAGGATCAT TG
ITS 1：
TCGAAACCTT CAAATCAGAC CCGCGAACAC GTTTCAAAAC AAGATCCGCC GCCCGGCGTG CGCCCCGTGC GTCCGTCCGG TGCGGTCTAA CAAACCCCGG CGCAAACGCG CCAAGGAAAA CTATGAAAGA AGCGCCGGCC CTCCCGAGAC CCGTCCGCGG TGTGCGAGGG GGGAACCGTG CGTCTCTTGA AATGTC
5.8S rDNA gene：
TAAACGACTC TCGGCAACGG ATATCTCGGC TCTCGCATCG ATGAAGAACG TAGCGAAATG CGATACTTGG TGTGAATTGC AGAATCCCGT GAACCATCGA GTCTTTGAAC GCAAGTTGCG CCCGAAGCCA TTAGGCCGAG GGCACGTCTG CCTGGGCGTC ACGC
ITS 2：
ATCGCGTCGC CCCCCTCCCC ATCCCTCTCG AAAGAAGGGG TGAGGCCGCA GGTGGGGCGG AGATTGGCCT CCCGTGGTAT TCTATCCCGC GGCCGGCCCA AATGCGATCC CGCACCGGCG GAAGTCACGA CTAGTGGTGG TTGAACCCTC AACGCGCGTG CTGTCGTGGC GGACTCCGTC CGGTGTACGG GCATCATATC GACCCAACGG CCCTTTGTCT CTCTCTCACG AGCGTAGCGA AGAGCCTCCG ACC
26S rDNA gene 5’端：
GCGACCCCAG GTCAGCGGGA CTACCCGCTG AGTTTAAGCA TATCATAAGC GGAGGAAAGG AACTAC
圖 38：台灣產野甘草之序列
序列，164 bp 為 5.8S rDNA 基因，253 bp 為 ITS2 序列。此結果登錄於 NCBI(The National Center for Biotechnology Information)的 GenBank 中，登錄碼為 AY963776。
得到野甘草植物的序列之後，查看NCBI的Genbank發現澳洲也有學者針對此 依植物進行rDNA序列的鑑定，其登錄碼為AY49211973，將兩種序列進行比對，結 果如圖39發現澳洲產與台灣產有著些許的差異，是因產地而引起，或因品種不同 而引起，有待進一步檢討。
1 50 台灣產 1 TCCCGTGTCG GAGTGTTCGG ATCGCGACGA CGTGAGCGGT TCGCTGCCCG 澳洲產 2 ...
Consensus ... ... ... ... ...
51 100 1 CGACGTCGCG AGAAGTCCAC TGAACCTTAT CATTTAGAGG AAGGAGAAGT 2 ... ... ... ... ...
Consensus ... ... ... ... ...
101 150 1 CGTAACAAGG TTTCCGTAGG TGAACCTGCG GAAGGATCAT TGTCGAAACC 2 ... ... ... ... ...
Consensus ... ... ... ... ...
151 200 1 TTCAAATCAG ACCCGCGAAC ACGTTTCAAA ACAAGATCCG CCGCCCGGCG 2 ... ... ...CT... ....C... ...
Consensus ... ... ...CC... ....C.... ...
201 250 1 TGCGCCCCGT GCGTCCGTCC GGTGCGGTCT AACAAACCCC GGCGCAAACG 2 ... ... ... ... ...
Consensus ... ... ... ... ...
圖 39：台灣產野甘草與澳洲產野甘草之比對。1.台灣產，2.澳洲產
251 300 1 CGCCAAGGAA AACTATGAAA GAAGCGCCGG CCCTCCCGAG ACCCGTCCGC 2 ... ... ... ... ...
Consensus ... ... ... ... ...
301 350 1 GGTGTGCGAG GGGGGAACCG TGCGTCTCTT GAAATGTCTA AACGACTCTC 2 ... ... ... ....C... ...
Consensus ... ... ... ....C... ...
351 400 1 GGCAACGGAT ATCTCGGCTC TCGCATCGAT GAAGAACGTA GCGAAATGCG 2 ... ... ... ... ...
Consensus ... ... ... ... ...
401 450 1 ATACTTGGTG TGAATTGCAG AATCCCGTGA ACCATCGAGT CTTTGAACGC 2 ... ... ... ... ...
Consensus ... ... ... ... ...
451 500 1 AAGTTGCGCC CGAAGCCATT AGGCCGAGGG CACGTCTGCC TGGGCGTCAC 2 ... ... ... ... ...
Consensus ... ... ... ... ...
501 550 1 GCATCGCGTC GCCCCCCTCC CCATCCCTCT CGAAAGAAGG GGTGAGGCCG 2 ... ... ... T... ...
Consensus ... ... ... C... ...
551 600 1 CAGGTGGGGC GGAGATTGGC CTCCCGTGGT ATTCTATCCC GCGGCCGGCC 2 ... ... ... ....C... ...
Consensus ... ... ... ....C... ...
圖 39(續)
601 650 1 CAAATGCGAT CCCGCACCGG CGGAAGTCAC GACTAGTGGT GGTTGAACCC 2 ... ... ... ... ....T...
Consensus ... ... ... ... ....G...
651 700 1 TCAACGCGCG TGCTGTCGTG GCGGACTCCG TCCGGTGTAC GGGCATCATA 2 ... ...T... ... ...GN ...G. Consensus ... ...C... ... ...AN ...G. 701 750 1 TCGACCCAAC GGCCCTTTGT CTCTCTCTCA CGAGCGTAGC GAAGAGCCTC 2 ... ... ... ...N ...
Consensus ... ... ... ...N ...
751 800 1 CGACCGCGAC CCCAGGTCAG CGGGACTACC CGCTGAGTTT AAGCATATCA 2 ... ...
Consensus ... ... ... ... ...
801 821 1 TAAGCGGAGG AAAGGAACTA C 2 Consensus ... ... . 圖 39(續)
另外，在本研究中，參考小蘗科八角蓮屬（Dysosma species）之DNA定序，
採用一組引子74，18D 及28CC，利用基因體DNA萃取技術，萃取臺灣產野甘草植物 新鮮葉子之DNA，結果發現，臺灣產野甘草之ITS1、5.8S rRNA 基因及ITS2 之長 度與G+C百分比和其他高等植物類似。野甘草植物之5.8S rRNA基因長度為164 bp，G+C百分比為54.9 %。ITS1之G+C百分比為62.2 %，ITS2區域之G+C百分比為 64.8 %（表26）。綜合已發表之高等植物 rDNA 之ITS 各區的長度與 G+C 百分 比75 (表27 )，5.8S rRNA基因之長度可於162〜167 bp之間，但多為163 或164 bp；
ITS區域在長度及G+C百分比上並無特別之處。
>18S ：TCCCGTGTCGGAGTGTTCGGATCGCGACGACGTGAGCGGTTCGCTGCCCGCGACGTCGCG AGAAGTCCACTGAACCTTATCATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG TGAACCTGCGGAAGGATCATTG 中，還是可以發現序列保留區，GGCRY-(4to7n)- GYGYC AAGGAA （Y表C或T，R 表G或A）。因此推測此保留區在rDNA初轉錄形成一個轉錄單位時，扮演著將之修 飾形成成熟的rRNA（mature RNA）的重要角色。在本研究中，野甘草植物的序列 保留區為GGCGC【AAAC】GCGCCAAGGAA。與其他高等植物序列保留區比對發現結果 一致 (圖40)76。 但是其他高等植物有些與序列保留區中會有一些不吻合之處，
因此在高等植物中ITS1序列保留區的研究方面，需累積更多資料方能找出真正序 列保留區。
表27：野甘草rDNA之ITS各區長度與G+C百分比及與其他高等植物之比較
ITS1 5.8S rDNA ITS2
Length G+C Length G+C Length G+C Taxa, reference Family
bp % bp % bp %
Monocots
Oryza sativa Gramineae 196 72.7 163 59.5 232 59.5
Imperata cylindrica* Gramineae 205 65.9 163 57.1 216
Triticum aestivum Gramineae 222 62.2 163 59.5 217 61.3
Agave dasylirioides Gramineae 250 65.2 239 70.2
Oncidium vokelati Agavaceae 211 54.5 163 58.3 247 56.3
Dicots
Scoparia dulcis Scrophulariaceae 196 62.2 164 54.9 253 64.8 Mimulus glaucescens Scrophulariaceae 206 44.0 162 50.6 225 47.0 Paeonia Ranunculaceae 267 54.3~56.6 164 53.7 220 57.2~59.5
Sinapis alba Cruciferae 265 50.6 163 52.8 188 54.3
Canella winterana Canellaceae 272 62.5 163 55.8 209 62.6 Arceuthobium americanum Viscaceae 209 34.0 167 41.9 227 30.4
Vicia faba Leguminosae 235 51.9 164 50.6 208 49.6
Vigna radiata Leguminosae 205 60.0 163 52.8 220 59.1
Gossypium Malvaceae 293-294 58.0 210-226 61.0
Daucus carota Apiaceae 215 49.4 164 54.2 224 52.3
Apioideae Apiaceae 204~221 49.1~57.7 216~226 42.7~59.6
Osmanthus fragrans Oleaceae 237 57.4 163 52.1 217 56.2
Nicotiana rustica Solanaceae 216 69.4 163 55.2 217 65.4 Lycopersicon esculentum Solanaceae 236 62.3 163 55.2 224 68.3 Populus deltoides) Salicaceae 214 66.8 164 55.4 207 69.5
Many higher plants GGCRY-(4 to 7n)-GYGYCAAGGAA Scoparia dulcis GGCGC AA --- AC GCGCCAAGGAA Amica mollis： GGCAC AAC -- AT GTGCCAAGGAA Arabidopsis thaliana： GGCAC GAA -- AA GTGTCAAGGAA Sinapis alba（mustard）： GGCAC GAA -- AA GTGTCAAGGAA Tasmannia laceolata： GGCGC AAC -- GG GCGCCAAGGAA Drimys winteri： GGCGC AAT -- GG GCGCCAAGGAA Oryza sativas（rice）： GGCGC CGA -- CG GCGTCAAGGAA Lycopersicon esculentum（tomato）： GGCGC GGA -- AA GCGCCAAGGAA Triticum aestivum（wheat）： GGCGC CGA -- AG GCGTCAAGGAA Daucus carota（carrot）： GGCGC TAG -- AT GCGCCAAGGAA Vicia faba（broad bean）： GGCGC TGA -- AA GCGTCAAGGAA 圖 40：許多高等植物 rDNA 的 ITS1 之序列保留區與野甘草之相對應序列 比較。序列中 R 表示 G 或 A；Y 表示 C 或 T
綜合以上所述，ITS 序列是鑑定植物近緣種非常理想的指標，通過序列 測定、同源性的比較，可成為一種很好的分子標記、可用於植物品種的鑑定及與 其外觀相似品種的鑑定，供應用於野甘草植物品種鑑定、育種及品種專利，可做 為未來市售標準檢驗之準則。
第五章 結論
第一節 野甘草( Scoparia dulcis )植物的形態鑑定
野甘草屬(Scoparia)植物，在世界約有 20 種，在臺灣只有一種，即為野甘
草( Scoparia dulcis )，在台灣民間廣泛使用，常有混用誤用的情形發生，為
了確立其形態，本研究利用光學顯微鏡及掃描式電子顯微鏡，觀察野甘草植物 的外部形態，包括根、莖、葉、花、果實、種子以及花粉的形態，已確立形態 鑑定的基礎。
在本研究中所看到的植物特徵與文獻大部分均相符，只有花冠的顏色，據 Flora of Taiwan2的描述為淡紫色，但其他的文獻(1,7~9,10,11)
所描述均為白色，而 本研究所看到的花冠亦為白色。
第二節 野甘草( Scoparia dulcis )植物的生藥組織學研究
生藥鑑定的方法有許多種，例如：組織切片，色層分析法（GC，HPLC，…
等）、光譜法（UV，IR，…等）與 X 射線繞射法，對植物所含成分進行分析等，
而其中組織切片法是最經濟實惠且信賴度高的一種方法。花費不多即能鑑別植 物特徵。
本研究依生藥組織學原則，記述其內部組織構造，包括莖的橫切，縱切，葉 的橫切，縱切，並以光學顯微鏡觀察其組織，如圖 20，此結果可為野甘草屬植 物鑑定或臨床使用等進一步研究之參考。
第三節 野甘草( Scoparia dulcis )植物的成分分離
本實驗由野甘草甲醇萃取物之正己烷得到 2 個純化合物、氯仿層中得 2 個純 化合物，乙酸乙酯層得到 1 個純化合物，經證實為下列化合物：
(1)正己烷層 Glutinol Friedelin (2)氯仿層
Betulinic acid
Coixol(6-Methoxybenzoxazolinone) (3)乙酸乙酯
Luteolin
上述化合物中均為野甘草已知之成分，其中，glutinol 可能發展為生技之 產品，將進一步探討其含量。
第四節 野甘草( Scoparia dulcis )植物中木犀草素 (luteolin)的定量
１、野甘草植物 luteolin 提取方法之選擇
luteolin 可以利用 10 ml MEOH 提取三次的方法，完全提取。
２、野甘草植物 luteolin 之定量
本研究所採集之野甘草其含量約在 0.00197 ~ 0.00563 % 之間
３、不同部位的 luteolin 含量：
野甘草的各個部位中， luteolin 含量最高的部位是在果的部份，而根部則 因含量太少而無法偵測其含量。各部位的含量比較則為：果 > 葉 > 莖 > 根。
第五節 野甘草( Scoparia dulcis )植物的指紋圖譜研究
一、野甘草植物之層析圖譜
對於 HPLC 波峰的分析結果如表 24，本研究建立野甘草的層析圖譜，可以作
對於 HPLC 波峰的分析結果如表 24，本研究建立野甘草的層析圖譜，可以作