第四章 實驗結果與討論
第四節 野甘草( Scoparia dulcis )植物中木犀草素 (luteolin)的定量
在 Masaru Kawasaki5等發表的研究中，曾經在巴拉圭產的野甘草中，經由 管柱分離得到木犀草素﹝luteolin （3',4',5,7-Tetrahydroxyflavone）﹞，據
文獻指出(6,61-63)，luteolin 是很強的自由基清除劑，具有抑制 nitric oxide (NO)
合成的作用，肝纖維化過程中自由基和 NO 合成增加被認為是肝星狀細胞
（hepatic stellate cell,HSC）活化和細胞外基質(ECM)合成增加的重要因素之 一，luteolin 可能是經由此種機轉，在體外抑制增殖及其膠原合成，作用在低 濃度即顯著，使得在體內容易達到有效濃度，而干擾素在體外降低 HSC 活化及其 ECM 的合成，在體內有治療肝纖維化的作用，因此 luteolin 可能具有預防或治 療肝纖維化的作用。本研究即針對台灣產野甘草中 luteolin 這個成分進行定 量，以確定其在此植物中的含量。
Luteolin 為一個黃酮類化合物，結構如圖 29 所示，分子式為 C15H10O6，分子 量為 286.23，微溶於水64。
一、 分析條件的選擇
分析的條件我們以幾個方向來討論：(1) 管柱種類；(2) 移動相；(3) UV 值；(4) 內部標準品（以下簡稱 I.S.）
首先，luteolin 的極性偏高，在逆向的管柱中較容易被洗脫，所以管柱的 選擇以 RP-18 管柱為主，在參考文獻中關於管柱的使用後（表 17），因為本實驗 室中即有 RP-18（Merck LiChroCART 250-4）的管柱，故以此作為分析的管柱，
所以在條件的選擇以移動相條件以及 UV 檢測波長為主。
表 17：不同管柱不同條件下 luteolin 的滯留時間
Column Mobile phase
Flowrate
Methanol：H2O (5：45 v/v，水用
乙酸調pH = 2.7) 1 約 12 350 66 伊利特-C18
(25 cm)
Methanol：H2O (50：50)，以磷酸
調整pH值至3.0 0.8 11.8 360 67
Spherisorb 5μm ODS2
(25cm)
solvent A：water with 1% glacial acetic acid
solvent B：water with 6% glacial acetic acid
solvent C：water/acetonitrile (65:30 v/v)with 5% glacial acetic acid 100% A，0~10 min；100% B，10~30 min；
90% B/10% C, 30~50 min；80% B/20% C，
50~60 min；70% B/30% C，60~70 min；
100% C，70~105 min；100% A，105~110 min
0.5 280 68
由表 17 可見，文獻中所用的移動相大部分為 MeOH 與水的比例來作為移動相 條件，因此我們也以 MeOH 與 0.05% 磷酸做為移動相，調整其比例，但是實際操 作之後，發現以 MeOH 與 0.05% 磷酸在野甘草植物中並無法使 luteolin 與其他 peak 完全分離(表 18 )，因此將有機溶媒改為 Acetonitril，以 Acetonitril 與 0.05% 磷酸比例之不同來尋找最佳移動相條件。
圖 30：Luteolin 之 UV 圖
表 18： HPLC 不同移動相條件之比較
移動相比例 GA Rt（min） 結果與討論
(1)
ACN：0.05﹪H3PO4 = 25：75（pH=2）
19.97 夾雜於其他的 peak 中
(2) ACN：0.05﹪H3PO4 = 24：76（pH=2）
25.31 仍然和其他 peak 重疊
(3) ACN：0.05﹪H3PO4 = 23:77（pH=2）
29.57 雖然 peak 位於較令人滿意的位 置，但仍然和其他 peak 重疊 (4) ACN：0.05﹪H3PO4 =
22:78（pH=2）
33.53
雖然 peak 位於較令人滿意的位 置，但仍然和其他 peak 重疊且
時間稍晚
(5)
ACN：0.05﹪H3PO4 = 0 min 22：78 36 min 28：72 40 min 28：72
23.52
無重疊，分離度佳，luteolin 的出現位置又不會太晚
當確立了移動相的條件之後，接下來便是要確立內標，以上述的移動相(5) 將野甘草萃取液進樣到 HPLC，得到其圖譜，如圖 31，做為參考依據來選擇 I.S.。
圖 31：野甘草之 HPLC 層析圖
由此張 HPLC 圖可以大約發現，在這個移動相條件之下，要得到好的內標物 的 Rt 值，大約位於 20~22 min、28~31 min、33~36 min 或 39 min 以後，因為 在這些區域內受到其他成分的干擾較小，但是詳細觀察之後發現，在 20~22 min 的 Rt 位置似乎仍不是十分的平整，可能有一些較微量的物質，若以此段時間為 考量，可能產生誤差，並且 39 min 之後出現的時間，已經和 luteolin 的 Rt 值 相差太多，故將找尋的焦點放在 28~31 min、33~36 min 上。表 19 為內標的測試 結果，由表中可知，imipramine，anthnone 及 piroxicam 在時間點上較為適合，
則有夾雜著其他較小的 peak 產生，此化合物似乎不純，若要作為內部標準品可 能需要經過再結晶的處理，較為麻煩，而 piroxicam 除了時間點剛好之外，與其 他 peak 之分離度也良好，且無拖尾情況產生，因此選擇此化合物做為內部標準 品。
表 19： 不同內部標準品之滯留時間比較
成分 Retention Time Description
Berberine 14.59 太早
Ferulic acid 7.55 太早
Propyl paraben X 40 分鐘內不出現
Methyl paraben 5.41 太早 Hydroflumethazide 7.66 太早
Doxepine 17.52 有 peak 夾雜，拖尾
Trimipramine X 40 分鐘內不出現
Imipramine 30.77 時間剛好，但有嚴重拖尾
Theophylline X 40 分鐘內不出現
α-methylprednisolone 37.15 有 peak 夾雜 Prednisolone 19.09 有 peak 夾雜
Cortisone 21.20 有 peak 夾雜
Indomethacin X 40 分鐘內不出現
ÁPiroxicam 如圖 32 30.53 時間剛好，分離度良好
Mefenamic acid X 40 分鐘內不出現
Anthnone 30.99 時間剛好，但似乎不純
Benzoic acid 12.21 太早
Flavone X 40 分鐘內不出現
5,6,7-trihydroxyflavone X 40 分鐘內不出現 Chlorogenic aicd X 40 分鐘內不出現
圖 32：Luteolin 標準品與內部標準品 ( I.S. ) 之 HPLC 層析圖