實驗材料、試藥與儀器

一、外部形態鑑定部分 1. 植物採集

本實驗採集新鮮野甘草，標本存放在台中市國立自然科學博物館 ( TNM )，採集記錄如表 5 所示：

表 5：採集地點、時間、經緯度、採集編號

採集時間 採集地點 經緯度 採集編號

2004.12.30 台中縣沙鹿 120° 33’ 51” E 24° 12’ 50” N

TNM C.Y. Lee 185

2005.3.18 中國醫藥大學 前柳川河堤

120° 33’ 43.8” E 24° 13’ 27.3” N 2005.11.24 台中縣沙鹿鎮

北勢里福至路

120° 33’ 43.8” E 24° 12’ 50” N

2. 實驗材料 (1) 植物體 (2) 花

(3) 果皮、種子 (4) 花粉粒

3. 實驗試劑

(1) Acetolysis 所需試藥

①. 10% HCl

②. 10% KOH

③. H²SO⁴ (concentrated)

④. Acetolysis solution：是由 10 ml 的 sulphuric acid 和 90 ml 的 acetic anhydride 混合而成

⑤. Hydrofluoric acid

⑥. 95% Ethanol

4. 儀器

(1) 顯微鏡 Olympus (2) 數位相機 Nikon 4500

(3) 鍍金機 JFC-1100E，日本 Jeol (4) 電子式掃描顯微鏡 JSM-5400，日本 Jeol (5) Acetolysis 所需器材

①. 離心管

②. 水浴鍋

③. 10 ml 和 100 ml 量筒

④. 攪拌棒

二、植物組織切片部分 １、實驗試劑：

(1) Chloral hydrate solution (2) Glycerin : water（1 : 1）

(3) Glycerin : alcohol : water（1 : 1 : 1）

(4) Phloroglucinol solution (5) Potassium chlorate (6) Iodine test solution (7) Hydrochloric acid（12 N）

(8) Potassium hydroxide（50 ％）

(9) Safranine

(10) SudanⅢ solution

２、儀器：

(1) 顯微鏡（OPTIMA G303）及照相設備

(2) 立體顯微鏡（OPTIMA ZM160AT）及照相設備 (3) 顯微測微計（Erma 0.01 mm Micrometer）

(4) 照相機（Nikon COOLPIX 5900）電腦及其周邊設備與相關軟體

三、成分分離部份 １、實驗試劑

(1) 正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等溶媒(以上購自 Merck)。

(2) 測核磁共振(NMR)光譜所用之溶媒 CDCl³ (Deuterium chloroform)、

MeOD (Deuterium methanol)、DMSO (dimethyl- sulfoxide)等 均為光譜級(以上購自 Merck)。

(3) 顯色劑：10 % Sulfuric acid spray reagent。

2. 薄層層析(Thin Layer Chromatography)

TLC plate：Kieselgel 60 F²⁵⁴ silica gel pre-coated aluminium plate，

厚度 2 mm (Merck)。

3. 管柱色層層析(Column Chromatography) 以 Pyrex 或 Merck 公司生產之不同型號管柱

填充物質：Kieselgel 60 70~230 mesh (Merck)，

Sephadex LH-20 ２、儀器：

(1) 迴轉式濃縮機： EYELA, 日本 (2) 烘箱：MEMMERT

(3) 電子天平：SHIMADZU LIBROR AEG-120 (4) 電熱板：CORONING MODEL PC-320。

(5) 超音波震盪器：Transsonic-TP690，Elma，德國 (6) 玻璃展開槽：120 mm x 150 mm 及 220 mm x 70mm (7) 紫外線燈 (波長 254nm 及 366nm)：CAMAG UV-CABINET (8) 微量熔點測定器

Electrothermal’s Series IA 9100 and IA9200 Digital Melting point，測定範圍 50.00~500.0℃之間，其溫度未經校正。

(9) 紅外線分光光譜儀 (Infared Spectrophotometer)

使用 Nicolet Impact 400 FT-IR Spectrophotometer 測定，固體以 乾的 KBr 粉未混合均勻，在真空下加壓成透明薄片測定之，光譜單位 為波數(cm^-1)(中國醫藥大學)。

(10)質譜儀(MS) JOEL JMS-SX/SX 102A Tandem Mass Spectrometer (中 興大學)。

(11)核磁共振光譜儀 Bruker DPX-200 FT-NMR (中國醫藥大學)。

Internal standard 為 Tetramethy Silane (TMS)，化學位移(Chemical shift)以 δ 表示，單位 ppm，以 J 表示偶合常數(coupling constant)，

單位 Hz 峰線訊號以“s”表示單峰(singlet)，“d”表示雙重峰 (doublet)，“t”表示三重峰(triplet)，“q”表示四重峰，“m”表 示多重峰(multiplet)。

四、Luteolin 定量部分（液相層析部分）

１、實驗試劑：

(1) Luteolin：日本和光純藥工業株式會社（Wako）

(2) 內部標準品（I.S.）： piroxaicam (3) 丙腈（acetonitril）：德國 Merck 公司 (4) 磷酸（phosphoric acid）：德國 Merck 公司

(5) 水（water）： Milli Q system (6) 其他試劑：分析試藥級或 HPLC 級 ２、材料：

(1) 分離管： Rp-18，德國 Merck 公司 LiChroCART 250-4 Purospher® STAR (2) 0.22μm 濾膜： minipore PVDF 25 mm

(3) 流速 1 ml/min.

(4) 檢測條件： UV 350 nm (5) 注射量： 20 μl (6) 溫度：室溫（25 ℃）

３、儀器：

(1) 純水製造機（Water purification equipment）： Milli Q system Milli-Q-Academic，Minipore，美國

(2) 高效液相層析儀（High-performance Liquid Chromatography；

HPLC）：

本裝置由下列組成：

①.液相層析溶劑輸送系統（Solvent Delivery Pump）：L-7100

②.紫外光可見光檢測器（UV-Visible Detector）：L-7400

③.二極體列陣檢測器（Diode Array Detector）：L-7455

④.自動注射器（Auto-sampler）： L-7200

⑤.除氣系統（Degas）： DG-2410

(3) 酸鹼度計（pH meter）： Model 6071，Jenco，台灣

(4) 水壓抽氣機（Aspirator）： Aspirator A-3S，Eyla，日本 (5) 電子分析天平︰ CP 224S，Sartorius，德國

(6) 超音波震盪器（Ultrasonic）： Transsonic-TP690，Elma，德國 (7) 抽氣過濾器： EYELA Aspirator A-3S

(8) 觸動式震盪器（Minishaker）：MS1，IKA^® Works（Asia），馬來西

亞

(9) 高速離心機： Hettich Zentrifugen D-7200，Tuttlingen，德國 (10) 可調式定量吸管： Pipetman 20、100、200、1000 μl，GILSON，

美國

五、PCR 部分 １、實驗試劑：

(1) Liquid nitrogen (2) 20% SDS

(3) Extraction buffer，EB

100 mM Tris-HCl pH＝8.0，50 mM EDTA-Na pH＝8.0 500 mM NaCl，10 mM beta-mercaptoethanol

(4) K-solution： galatic acetic acid 11.5 ml 5M potassium acetate 60.0 ml Milli-Q 28.5 ml (5) Phenol

(6) Isopropanol

(7) Chloroform: isoamylalcohol=24:1 (8) TE buffer（Buffer B, TE＝5: 1）

(9) Ammonium acetate(7.5M) (10) Absolute EtOH

(11) RNase A（10 mg/ml; Sigma）

(12) Template DNA

(13) Primers : 18D（5'-CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA-3'）

28CC（5'-ACTCGCCGTTACTAGGTGAA-3'）

(14) 10X buffer（Promega, Madison, USA）

(15) MgCl²（25mM）

(16) Taq polymerase (Promega,Madison, USA) (17) dNTPs (2mM stock)

(18) Markers Lambda/HindIII (Invitrogen/Life Technologies) (19) Ethidium bromide solution 10 mg/ml

(20) l5X loading Dyes50X

(21) TBE [5X stock solution1(liter):

54 g Tris base, 27.5 g boric acid, 20 ml 0.5 M, EDTA, pH 8.0]

(22) Sterile ddH²0 (23) Agarose (powder)

２、儀器：

(1) 離心管

(2) 微量離心管(microfuge tube) (3) 瑪瑙研缽

(4) 水浴鍋

(5) PCR 反應器：GeneAmp PCR System 9600 (PERKIN ELMER) (6) 膠體電泳槽及電源：APELEX PS-305

(7) UV trans-illuminator and camera system：KODAK EDAS 290 (8) 微波爐

(9) 計時器

(10) 固定式/可調式微量吸管：RAININ 美國