五種 tau 胜肽、一種有磷酸根的 tau 胜肽及兩種胜肽抑制物的製備

在胜肽合成的部分，我們使用固相合成儀來進行合成，合成出五種 tau 胜肽，

分別為 Ac-²⁷⁵VQIINK²⁸⁰-NH2、Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹-NH2、tau244-280 (R1+PHF6*)、

tau275-305 (PHF6*+R2) 和 tau281-311 (R2+PHF6) (圖 3.21)，一種帶有磷酸根的 tau 胜肽 (圖 3.22) 以及兩種胜肽抑制物分別為 R8-VQIINK 和 R8-VQIVYK (圖 3.23)。

圖 3.21 五種 tau 胜肽序列圖。

圖 3.22 帶有磷酸根的 tau 胜肽。

圖 3.23 兩種胜肽抑制物序列圖。

分別合成出上列八種胜肽之後，並從樹脂上切割下來，將未經純化的初產物 送至分生所質譜室進行分子量的鑑定，並比較胜肽的實際分子量值和理論分子量 質 (theoretical mass) 來判斷合成是否成功，但因使用基質輔助雷射脫附游離質譜 分析時，基質 (matrix) 會釋放帶電質子 (proton, H⁺) 並結合到樣品上，使樣品帶 有電荷以幫助質譜測量，但會導致樣品的分子量會有 1 至 2 的誤差。由結果可 以看出合成出的樣品中均含有目標產物 (圖 3.24)。

(A) Ac-²⁷⁵VQIINK²⁸⁰-NH2

(B) Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹-NH2

(C) tau244-280 (R1+PHF6*)

(D) tau275-305 (PHF6*+R2)

(E) tau281-311 (R2+PHF6)

(F) tau244-280 w/ pSer262

(G) R8-VQIINK

(H) R8-VQIVYK

圖 3.24 八種胜肽初產物的質譜圖。

紅色數字為主產物的分子量；各胜肽的理論分子量標記在質譜圖左上方。(A) Ac-²⁷⁵VQIINK²⁸⁰-NH2，分子量為 755.494 Da。(B) Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹-NH2，分子量 為 790.471 Da。(C) tau244-280 (R1+PHF6*)，分子量為 3993.040 Da。(D) tau275-305 (PHF6*+R2) ， 分 子 量 為 3304.854 Da 。 (E) tau281-311 (R2+PHF6) ， 分 子 量 為 3339.762 Da。(F) tau244-280 w/ pSer262，分子量為 4073.383 Da。(G) R8-VQIINK，

分子量為 2066.235 Da。(H) R8-VQIVYK，分子量為 2101.272 Da。

緊 接 著 將 合 成 完 的 初 產 物 溶 於 水 中 ， 其 中 tau244-280 (R1+PHF6*) 和 tau244-280 w/ pSer262 先用 3K 濃縮離心管將分子量較小的其他胜肽去除，再將 這八種胜肽透過 C18 管柱來純化，利用胜肽親疏水性的不同的特性將目標胜肽和

(A) Ac-²⁷⁵VQIINK²⁸⁰-NH2

(B) Ac-³⁰⁶VQIVYK³¹¹-NH2

(C) tau244-280 (R1+PHF6*)

(D) tau275-305 (PHF6*+R2)

(E) tau281-311 (R2+PHF6)

(F) tau244-280 w/ pSer262

(G) R8-VQIINK

(H) R8-VQIVYK

圖 3.25 八種胜肽的 HPLC 純化圖及純化後的質譜圖。

每一項的上圖為 HPLC 純化圖，縱軸為吸光值，橫軸為時間，藍線代表 UV ，

(R2+PHF6)，以 0-40% buffer B 沖提 30 分鐘。(F) tau244-280 w/ pSer262，以

圖 3.26 p-tau 的 BSA 定量。

膠片上為 (A) 純化後的 p-tau，綠色框線為濃度 0.2 / 0.4 / 0.6 / 0.8 mg/ml 的 BSA。

依 BSA 來為 p-tau 進行定量，以此次為例則得到 8.26 μM 而量為 1 ml 的 p-tau。。

圖 3.27 利用微量盤螢光分光光譜儀測的只含有 buffer 和 ThS 而不含蛋白質 樣品的控制組。

圖 3.28 利用微量盤螢光分光光譜儀測的不含 RNA 的 p-tau aggregation test。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線代表 15 μM w/o p-tau、紅線代表 10 μM p-tau w/o RNA、 綠線代表 6 μM p-tau w/o RNA，培養 48 小時。經過 48 小時，螢光 訊號並沒有明顯增加，而且起始的訊號還先下降，和其他研究的螢光訊號曲線不 同，推測沒有 p-tau 纖維的形成。

圖 3.29 p-tau 經 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 純化結果 圖。

縱軸為吸光值，橫軸為毫升，藍線代表 UV_280nm、紅線代表 UV_254nm、 綠線代表 UV 。以 FPLC buffer 沖提 120 ml，收集 42-66 ml 處的樣品。

圖 3.30 收集下來的樣品 SDS-PAGE 圖。

膠片上由左至右為 marker、(A)-(M) 分別為 fraction 42-66。可以看到 p-tau 位於 fraction 52-58 之中。

圖 3.31 純化 p-tau 的 SDS-PAGE 圖。

膠片上由左至右為 marker、(A) 誘導表現蛋白前、(B) 誘導表現蛋白後、(C) 破菌 完離心後的上清液、(D) 加熱完離心後的上清液、(E) TEV protease 處理後、(F) 純 化完成的 p-tau，綠色框線為濃度 0.2 / 0.4 / 0.6 / 0.8 mg/ml 的 BSA。經純化後可 以得到純的 p-tau，依 BSA 來為 p-tau 進行定量，以此次為例則得到 11 μM 而 量為 600 μl 的 p-tau。

隨即我們將依照原始方法進行純化的 p-tau 和 ThS 混合進行 aggregation test，結果螢光確實有上升，推測 p-tau 確實有成功形成澱粉樣纖維 (圖 3.32)，接 著我們將 p-tau 纖維點到 grid 上，經負染色後利用 TEM 取像，以此證明 p-tau 有形成澱粉樣纖維，由 TEM 圖像可以找到許多絲線狀的纖維 (圖 3.33)，證明了 p-tau 確實可以自發性地形成澱粉樣纖維，因此我們推測 RNA 可以協助 p-tau 形 成纖維。

圖 3.32 利用微量盤螢光分光光譜儀測的含 RNA 的 p-tau aggregation test。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線、紅線和綠線代表 10 μM p-tau w/ RNA 三重 複，培養 24 小時。經過 24 小時，螢光訊號有增加，和其他研究的螢光訊號曲 線相似，推測有 p-tau 纖維的形成。

圖 3.33 p-tau fibril 的 TEM 照片。

使用 TEM 觀察到的 p-tau 纖維，放大倍率為 9900X，比例尺為 200 nm。

之後我們將 p-tau 樣品進行液相層析-串聯式質譜分析，看樣品中哪些胺基酸 有被磷酸化修飾 (圖 3.34)，結果只有看到一個位置有被進行磷酸化作用，在 Thr231 的位置，我們推測 p-tau 在其他位置也是有被磷酸化的，但是在質譜分析 時，這些具有磷酸化修飾的胜肽片段和沒有被修飾的相同胜肽片段比起來訊號較 低，導致分析軟體在進行判讀時會認為該段胜肽並沒有被修飾。

(A)

(B)

圖 3.34 p-tau 的液相層析-串聯式質譜分析。

(A) 序列比對圖，紅色的字體為被機器偵測到的序列。(B) 部分質譜分析圖。由質 譜分析的結果可以看到樣品中確實含有 tau，且在 Thr231 有被磷酸化。

在測試中我們使用的螢光染劑為 ThS 而不是 ThT，我們曾經使用 ThT 來進 行測試，結果初始的螢光訊號就非常高，而且隨著時間的增加反而螢光訊號會降 低 (圖 3.35)，我們懷疑 ThT 是否和 RNA 有作用，因此使用螢光光譜儀進行測 試，將 ThT 和由其他實驗室借來的 RNA 進行混合並測量螢光，結果有螢光訊號，

代表 ThT 會和 RNA 進行反應，同時我們也另外做了一組 ThT 加 RNA 以及普 立昂纖維 (prion fibril) 的組別 (圖 3.36)，結果螢光訊號和沒有含普立昂纖維的組 別比起稍微降低了一點點，所以我們推測 RNA 和纖維之間可能會競爭和 ThT 的 結合位置，因此在含 RNA 的樣品皆使用 ThS 當螢光染劑，為了保持統一性，p-tau 和 tau 的實驗皆使用 ThS，而後續的胜肽測試因不含 RNA，所以胜肽實驗皆用 ThT。

圖 3.35 使用 ThT 的 p-tau aggregation test。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線、紅線和綠線代表 10 μM p-tau w/ RNA 三重

(A) (B)

圖 3.36 使用螢光光譜儀測量 ThT 加 RNA 和普立昂纖維的螢光訊號。

縱軸為螢光訊號，橫軸為波長。(A) ThT + RNA 的螢光訊號。(B) ThT + RNA + 普 立昂纖維的螢光訊號。由圖可以看到 ThT 會和 RNA 有反應而發出螢光，但加入 普立昂纖維後訊號稍微降低了一點點。

3.4.2 tau

有了 p-tau 的經驗，我們隨即將 tau 依照原始的純化方法來重新純化，即是 依序使用破菌、煮沸、TEV protease 處理、通過管柱的順序來進行純化，破菌完 後煮沸樣品，並加入 TEV protease 反應，再利用 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 純化 (圖 3.37)，收集 45-66 ml，並由 SDS-PAGE 觀察哪些 收下來的收集管含有 tau (圖 3.38)，將 tau 收集起來並濃縮，最後加入 glycerol 即 完成純化，並再次進行 SDS-PAGE 確認純化的步驟是否正確並同時用 BSA 定量 (圖 3.39)，由結果來看經純化後的樣品確實含有 tau，而且降解的產物比之前來的 少，推測是純化的手法比較熟練且純化的時間較之前來的短。

圖 3.37 tau 經 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 純化結果圖。

縱軸為吸光值，橫軸為毫升，藍線代表 UV280nm、紅線代表 UV254nm、 綠線代表

UV_215nm。以 FPLC buffer 沖提 120 ml，收集 45-66 ml 處的樣品。

圖 3.38 收集下來的樣品 SDS-PAGE 圖。

膠片上由左至右為 marker、(A)-(K) 分別為 fraction 45-65。可以看到 tau 位於 fraction 51-59 之中。

圖 3.39 純化 tau 的 SDS-PAGE 圖。

膠片上由左至右為 marker、(A) 誘導表現蛋白前、(B) 誘導表現蛋白後、(C) 破菌 完離心後的上清液、(D) 加熱完離心後的上清液、(E) TEV protease 處理後、(F) 純 化完成的 tau，綠色框線為濃度 0.2 / 0.4 / 0.6 / 0.8 mg/ml 的 BSA。經純化後可以 得到純的 tau，依 BSA 來為 tau 進行定量，以此次為例則得到 18.3 μM 而量為 778 μl 的 tau。

純化並定量好 tau 之後，將 aggregation buffer、ThS 和 tau 均勻混合，因為 樣品不夠的緣故而無法用 10 μM tau，故調配成濃度為 9 μM tau 和 20 μM ThS 的 組別，同時準備另一組樣品含有 9 μM tau、2.25 μM heparin 和 20 μM ThS，因為 tau 要形成澱粉樣纖維必須有 heparin 的幫助，在測量之前，我們同樣先使用只含 有 aggregation buffer、heparin 和 ThS 的控制組進行測試，結果螢光訊號沒有上 升 (圖 3.40)，接著比較 tau 兩組來觀察是否在 aggregation test 有不一樣的結果 (圖 3.41)，由結果來看沒有加 heparin 的組別增加的螢光訊號反而比有加 heparin 的組別高一點，但增加的幅度不大，很難判定有無形成纖維。

圖 3.40 利用微量盤螢光分光光譜儀測的只含有 buffer、heparin 和 ThS 而不 含蛋白質樣品的控制組。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線、紅線和綠線代表三重複，培養 24 小時。

經過 24 小時，螢光訊號沒有增加。

(A) tau w/ RNA

(B) tau w/ RNA + heparin

圖 3.41 利用微量盤螢光分光光譜儀測的有含 RNA 的 tau aggregation test。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線、紅線和綠線代表 9 μM tau w/ RNA 三重複，

培養 24 小時，(A) 9 μM tau w/ RNA；(B) 9 μM tau w/ RNA + heparin。

我們隨即用沒有 RNA 的 tau 樣品進行測試，使用的濃度為 10 μM tau，一樣 分成不含 heparin 的控制組及含 2.5 μM heparin 的實驗組進行測試 (圖 3.42)，結 果含 heparin 的組別螢光增加的幅度很大，推測有 tau 纖維的形成，因此我們懷 疑 heparin 是否和 RNA 有交互作用而影響纖維的形成。

(A) tau w/o RNA

(B) tau w/o RNA + heparin

圖 3.42 利用微量盤螢光分光光譜儀測的不含 RNA 的 tau aggregation test。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線、紅線和綠線代表 10 μM tau w/o RNA 三重

我們也有將 tau / p-tau 用西方墨點法分析，證實樣品中的蛋白質確實是 tau / p-tau 蛋白，結果樣品中確實含有 tau / p-tau (圖 3.43)，但會有許多的降解產物，

即使在 SDS-PAGE 圖上看不出來。

圖 3.43 tau / p-tau 的西方墨點法。

利用西方墨點法分析樣品中是否含有 tau / p-tau，紅色箭頭處即是 tau / p-tau。使 用的抗體為 Anti-Tau-1, clone PC1C6 antibody。

我 們 也 使 用 動 態 光 散 射 測 量 p-tau 的 粒 徑 大 小 ， 蒐 集 經 HiLoad 16/60 Superdex 200 gel-filtration column 純化後的樣品並進行量測，此時樣品還未加入甘 油也還未濃縮，樣品所處的溶液為 100 mM NaCl、20 mM Tris 且 pH 為 7.4，測 量後得到平均粒徑大小約為 7 nm，代表我們純化後的 p-tau 還沒有聚集形成較大 的聚分子 (圖 3.44)。

圖 3.44 以動態光散射測量 p-tau 粒徑大小。

用動態光散射測量 p-tau 的粒徑約為 7 nm。

3.4.3 tau 胜肽

在 tau 胜肽的部分，我們使用秤重的方法來配製五種 tau 胜肽的樣品使其濃 度為 200 μM，並和 aggregation buffer 及 ThT 均勻混合，調配濃度為 50 μM tau 胜肽和 20 μM ThT 的樣品，同時準備另一組含有 50 μM tau 胜肽、12.5 μM heparin 和 20 μM ThT 的樣品，並進行 aggregation test，在測試之前，先測量只含有 aggregation buffer 和 ThT 以及多了 heparin 的控制組，結果螢光訊號皆沒增加 (圖 3.45)，接著對胜肽進行測試，由結果來看這五種 tau 胜肽在不加 heparin 的 條件下都不能自發性地形成纖維，而加了 heparin 的情況下則全部都有螢光訊號 的上升 (圖 3.46)，隨即我們將含有 heparin 的樣品點在 grid 上並進行負染色，

再利用 TEM 取像，可以看到許多絲線狀的澱粉樣纖維 (圖 3.47)。

圖 3.45 利用螢光光譜儀測的只含 aggregation buffer 和 heparin 的控制組。

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線代表培養前的螢光訊號，紅線代表培養 24 小 時後的螢光訊號，24 小時後螢光訊號沒有增加。左圖為含有 aggregation buffer 和

縱軸為螢光訊號，橫軸為時間，藍線代表培養前的螢光訊號，紅線代表培養 24 小 時後的螢光訊號，24 小時後螢光訊號沒有增加。左圖為含有 aggregation buffer 和